Abstract

O câncer de fígado é uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer. Uma compreensão mais profunda mecanicista de cancro do fígado poderia conduzir ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes. Em nosso trabalho anterior, nós analisamos 646 miRNAs e identificou 11 que regulam a migração de células de câncer de fígado. O estudo atual mostra que miR-525-3p é frequentemente sobre-regulada em tecidos de câncer de fígado, e maior expressão de miR-525-3p pode promover a migração de células de câncer de fígado e invasão. proteína de dedo de zinco 395 (ZNF395) é a funcional do gene alvo directo para miR-525-3p, e é frequentemente regulada para baixo em tecidos de cancro do fígado. Alta expressão de ZNF395 significativamente pode inibir enquanto knockdown de expressão ZNF395 pode marcadamente melhorar a migração e invasão de células de câncer de fígado, sugerindo que ZNF395 suprime metástase em câncer de fígado. Down-regulação da ZNF395 pode mediar miR-525-3p migração de células de câncer de fígado induzida e invasão. Em conclusão, miR-525-3p promove a migração de células de câncer de fígado e invasão diretamente pela segmentação ZNF395, eo fato de que o miR-525-3p e ZNF395 ambos desempenham papéis importantes na progressão do câncer de fígado torna potenciais alvos terapêuticos.

citação: Pang F, R Zha, Zhao Y, Q Wang, Chen D, Zhang Z, et al. (2014) Mir-525-3p Melhora de Migração e invasão das células do cancro do fígado por downregulating ZNF395. PLoS ONE 9 (3): e90867. doi: 10.1371 /journal.pone.0090867

editor: Hong Wanjin, Instituto de Biologia Molecular e Celular, Biopolis, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de Agosto de 2013; Aceito: 07 de fevereiro de 2014; Publicação: 05 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Pang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado por doações do 973 Key Programa Nacional de Pesquisa básica (2013CB910504), Xangai Saúde Bureau (XYQ2011047, XBR2011039) e O Projeto de Estado-chave para o cancro do fígado (2012ZX10002-009013). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as metástases são a principal causa de morte relacionada ao câncer [1], [2]. Sistematicamente estudar os mecanismos moleculares de metástases do cancro do fígado é particularmente importante para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Metástase tumoral é um processo complexo multi-etapa em que as células tumorais circundantes para mover ou tecidos distantes depois de romper a partir do tumor primário. Este processo envolve a passagem de células tumorais através da matriz extracelular (ECM) e a membrana basal do vaso sanguíneo local [3], [4], [5], [6], [7], seguido pelo movimento para o microambiente hospedeiro [ ,,,0],8], [9], [10]. Estudos recentes revelaram que, além de genes que codificam proteínas, RNAs não-codificantes, tais como miARNs também desempenham papéis reguladores importantes no processo de metástase [11], [12], [13], [14], [15], [ ,,,0],16]. miARNs são pequenos RNAs não-codificante de cadeia simples, e as suas sequências são altamente conservadas em eucariota [17]. miARNs regular a expressão do gene ao nível da pós-transcrição por ligação a sequências alvo de ARNm [18], [19], [20], e, assim, participar em vários processos biológicos [21], [22]. Meng et al [23] relatada pela primeira vez que a expressão aberrante de miR-21 pode mediar a invasão de células de câncer de fígado diretamente pela segmentação PTEN. Recentemente, o miR-151 e miR-30D encontram-se a ser localizado em locais genómicos frágeis e estão associados com a metástase de cancros [24], [25]. Hipoxia-inducible expressão de miR-210 regula metástase VMP1 mediada induzida por hipóxia fígado de células de câncer [26].

À tela miRNAs envolvidos na metástase do cancro do fígado, em um estudo anterior, nós analisamos 646 miRNAs usando a cicatrização de feridas ensaio com o sistema de imagens de células vivas, e 11 miRNAs foram encontrados para efetivamente regular a migração de células de câncer de fígado [27]. Em um relatório anterior [28], foram identificadas algumas regiões do número de cópias de variação no DNA genômico de 58 pares de tecidos de câncer de fígado usando uma matriz SNP 6.0. No presente estudo, verificou-se que o gene miR-525-3p está localizado em uma região número de cópias amplificadas e poderia facilitar a migração de células de câncer de fígado no ensaio transpoço. Além disso, o miR-525-3p é frequentemente regulados positivamente em tecidos de cancro do fígado e regula a migração de células do cancro do fígado e invasão por regulação negativa da expressão de ZNF395. Estes achados sugerem que miR-525-3p e ZNF395 representam alvos potenciais para o tratamento de câncer de fígado.

Materiais e Métodos

fígado humano Tumor Samples /Ética Declaração

câncer de fígado humano e tecidos não tumorais adjacentes foram obtidos a partir dos arquivos de espécimes cirúrgicos de Qidong Instituto cancro do fígado, província de Jiangsu, China. Todas estas amostras foram obtidas com consentimento informado por escrito, e os protocolos foram aprovados pela Comissão de Ética Revisão da OMS Centro de Pesquisa Colaborar na produção humana autorizado pelo Governo Municipal de Xangai. As amostras específicos utilizados neste estudo foram descritos na publicação anterior [29].

Cultura de Células

HEK-293T, NCI-H1299, BxPC-3, PANC-1, Hep3B, PLC /PRF /5, HepG2, SK-HEP-1, MCF7, A549, NCI-H460, Tera-1 e Tera-2 foram adquiridos a partir de ATCC; HuH-7 foi adquirido da coleção japonesa dos recursos biológicos de Investigação (JCRB), SMMC-7721 e BEL-7402 foram comprados de banco de células comissão preservação da cultura típica, Academia Chinesa de Ciências (NCB); MHCC-97L e LM3 foram presentes de Zhongshan Hospital, Universidade de Fudan (Xangai, China); SMMC-7721, BEL-7402, MHCC-97L e LM3 utilizados neste estudo foram descritas em publicação anterior [24], [30], [31], [32].

HEK-293T, NCI -H1299, BxPC3, PANC1, Hep3B, PLC /PRF /5, HepG2, hein-7, HepG2, SK-HEP-1, SMMC-7721, 97L, LM3, BEL-7402 e MCF7 células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS). As células A549 e NCI-H460 foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS. células Tera1 Tera2 e foram cultivadas em meio de McCoy 5A suplementado com 15% de FBS. Todas as linhas celulares foram cultivadas na presença de antibióticos, a 37 ° C com 5% de CO

2.

Extração de RNA e quantitativa PCR em tempo real

O RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen). Sintetizou-se ADNc com o kit de reagentes Prime-Script RT (Takara). PCR em tempo real foi realizado com SYBR Premix Ex Taq (Takara). miARNs maduros foram sujeitos a transcrição reversa e quantificada usando ensaios de miARN TaqMan (Applied Biosystems). As sondas e os iniciadores utilizados para a detecção de ARNm de miARN e estão listadas na Tabela S1 e S2.

vector plasmídico Constructos

A sequência primária de miR-525 foi amplificado a partir do ADN genómico de tecido normal e ligado num vector PGIPZ (Open Biosystem). A sequência ZNF395 ORF foi amplificado a partir do vector ZNF395 (FulenGen) e ligado no vector pWPXL (uma oferta do Professor Didier Trono). O ZNF395 3’UTR foi amplificado a partir do ADN genómico de células HK-293T e subclonado directamente a jusante do codão de terminação do gene da luciferase no vector repórter de luciferase. 3’UTR do mutante foi obtido a partir do 3 ‘UTR ZNF395 clonado utilizando o kit Quikchange relâmpago mutagénese dirigida ao local (Agilent). Tanto o tipo selvagem e as sequências de 3’UTR mutantes foram confirmados por sequenciação (Invitrogen). As sequências dos iniciadores são apresentados na Tabela S3.

Lentivírus Produção e transdução celular

O plasmídeo psPAX2 embalagem e do plasmídeo envelope pMD2.G eram dons do Professor Didier Trono. Tanto o vector de pGIPZ-miR-525 ou pWPXL-ZNF395 foi co-transfectado com psPAX2 e pMD2.G em células HEK293T, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Os vírus foram colhidos 48 h após transfecção e os títulos virais foram determinados. As células SK-HEP-1 e SMMC-7721 foram infectadas com 1 × 10

6 unidades de transdução de lentivírus recombinante na presença de 6 ug /mL de polibreno (Sigma, MO). SMMC-7721-525, SK-HEP-1-525 e SK-HEP-1-ZNF395 são piscinas de células estáveis, que infectados com lentivírus com GFP, linhas de células estáveis ​​utilizados em ensaios com . 95% fluorescência verde

Oligonucleótido Transfecção

As células foram semeadas em placas de 6 poços. Depois de 24 h, com 100 pmol de miARN mímico (Genepharma), inibidor (Ribobio) ou siARN foi transfectado utilizando 5 uL de lipofectamina reagente RNAiMax (Invitrogen). As células foram colhidas 48 h mais tarde para ensaios Transwell ou ensaios de repórter de luciferase. As sequências de siRNA são fornecidos na Tabela S4.

A eficiência de transfecção de detecção

As células foram transfectadas em placas de 6 poços utilizando 100 pmol de ARNsi com FAM (Genepharma) e reagente RNAiMax (Invitrogen), depois 20-24 h, a eficiência de transfecção foi detectado utilizando citometria de fluxo (FCM).

Ensaios de proliferação de células

a proliferação celular foi avaliada pela contagem celular kit-8 kit de ensaio (CCK-8 Dojindo Corp ). 1 × 10

3 células foram semeadas em cada poço da placa de 96 poços e cultivadas com meio de 90 mL, 10 mL de CCK-8 foi adicionado em cada poço. Depois incubou-se a 37 ° C durante 2 h, a absorvância foi detectado a 450 nm, e o valor DO450 se correlaciona com o número de células vivas.

ensaio de migração celular Os ensaios migração e invasão

: 5 × 10

4 células foram suspensas em meio DMEM isento de soro de 200 ul e semeadas para dentro da câmara superior de cada molde de inserção. Em seguida, 800 ul de DMEM contendo 10% de FBS foi adicionado a uma placa de 24 poços. Após incubação a 37 ° C (SK-HEP-1:6-8 h; SMMC 7721:12-16-h), as células que migraram foram fixas e coradas durante 30 min numa solução de corante contendo 0,2% de violeta de cristal e 20 % de metanol. ensaio de invasão celular: As câmaras foram uniformemente cobertos com 40-80 mL de Matrigel (BD Biosciences), diluída com DMEM para uma determinada percentagem e incubou-se a 37 ° C durante 2-4 h. Em seguida, 1 × 10

5 células foram suspensas em 200 ul de DMEM e semeadas em câmaras superiores, e 800 mL de DMEM contendo FBS a 10% foi adicionada à câmara inferior. Após incubação a 37 ° C (SK-HEP-janeiro 14-16 h; SMMC-7721 16-18 h), as células foram

Luciferase Reporter Assay

células HEK293T fixadas e coradas. foram cultivadas numa placa de 96 cavidades e foram transfectadas com 50 ng pluc-3’UTR, 10 ng de plasmídeo de luciferase de Renilla e o controlo negativo ou imitador 5 pmol de miR-525-3p. Após 48 h de incubação, a actividade de luciferase foi detectada utilizando o sistema de ensaio de repórter de luciferase dupla (Promega).

Western Blot Assay

Os lisados ​​celulares foram separados por 10% SDS-PAGE, transferido para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad), bloqueadas com solução salina tamponada com fosfato contendo Tween-20 e 5% de leite desnatado durante 1 h, e incubadas com anticorpo policlonal ZNF395 (Santa Cruz) (1:1000) ou β-actina (Sigma) ( 1:10000). O complexo anticorpo foi detectado utilizando quimioluminescência aumentada (Pierce).

Análise estatística

Todos os resultados são apresentados como a média ± erro padrão da média (SEM). Diferenças entre os grupos foram analisadas pelo teste t de Student (bicaudal, p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo).

Resultados

alta expressão de miR-525-3p Melhora a migração e invasão de as células do cancro do fígado

Para explorar o papel do miR-525-3p no desenvolvimento do cancro do fígado, o nível de miR-525-3p a expressão foi detectada em cancro do fígado e 136 pares de tecidos adjacentes não cancerosas do fígado (NT). miR-525-3p foi significativamente regulada para cima em tecidos de cancro do fígado (Figura 1A), com a sobre-regulação observado em 60% de tecidos de cancro do fígado (Figura 1B). Além disso, foi examinada a expressão de miR-525-3p em várias linhas celulares de cancro. Os resultados mostraram que o nível de miR-525-3p expressão é relativamente elevada em linhas celulares do cancro do fígado (Figura S1 S1 no ficheiro). Para examinar a função biológica de miR-525 em CHC, linhas de células estáveis ​​que expressam o miR-525 foi construído e chamado SMMC-7721-525 e SK-HEP-1-525 (Figura S2A em S1 do ficheiro). CCK-8 ensaios sugeriu que o miR-525 não influenciar o crescimento celular HCC (Figura S3 no ficheiro S1), enquanto Transwell ensaios indicaram que a sobre-expressão de miR-525 promovida SK-HEP-1 e a migração e invasão SMMC-7721 (Figura 1C, D).

(a), a expressão de miR-525-3p foi determinada por TaqMan PCR em tempo real em cancro do fígado e amostras de tecido de fígado não cancerosos adjacentes (NT) (n = 136). O nível de expressão de miR-525-3p foi normalizada para U6b snRNA. A expressão relativa de miR-525-3p é relatada em um gráfico de caixa com um log

10 escala do eixo y. As extremidades das caixas definem o th 25

e 75

th percentis, e a linha indica a mediana. A análise estatística foi realizada por um teste-t emparelhado, e as estrelas indicam resultados estatisticamente significativos a P 0,05 (*). (B) O gráfico mostra as proporções de tecidos de câncer de fígado em que a expressão de miR-525-3p foi regulada (60%), regulada para baixo (5%) e inalterada (35%). (C) Transwell ensaios de migração de SMMC-7721 e células SK-HEP-1 expressando miR-525 ou vetor de controle. (D) Transwell ensaios de invasão de SMMC-7721 e células SK-HEP-1 expressando miR-525 ou vetor de controle. Imagens representativas são mostrados à esquerda, e 3 campos selecionados aleatoriamente são quantificados na direita. Os valores aqui apresentados representam a média ± SEM, e as estrelas indicam resultados estatisticamente significativos em P 0,01, ** ou P . 0.001, ***

Mir-525-3p pós-transcricional down-regula ZNF395 Expressão por Diretamente Segmentação sua 3’UTR

a seguir, procurou determinar os genes alvo de miR-525-3p. genes-alvo potenciais foram previstas usando a previsão miRNA algoritmos TargetScan, Miranda e Diana. previsões conjuntas de cada dois softwares foram combinados e 30 genes candidatos foram encontrados (Figura 2A). Os níveis de expressão destes genes foram detectados após imita o miR-525-3p foram introduzidos SK-HEP-1 e SMMC-7721. RANBP10, NACC1, IRF1, ZNF395 MLST8 e foram inibidas em mais de 40% (Figura S4 no ficheiro S1). Para compreender se estes cinco genes estão relacionados com o cancro do fígado, os níveis de expressão destes genes foram detectados em 12 pares de amostras de tecido de cancro do fígado. RANBP10, IRF1 e ZNF395 foram encontrados para ser regulada para baixo em tecidos de câncer de fígado, enquanto os níveis de NACC1 e MLST8 expressão permaneceu inalterada (Figura S5 em S1 Arquivo).

(A) Esquema dos genes candidatos produzida por diferentes algoritmos de previsão. Cada círculo representa um algoritmo de predição e o número de genes que se previram, e os números listados nas regiões onde os círculos sobrepostos representam o número de genes previstos por ambos os algoritmos. (B) Os ensaios de Western blot dos níveis de proteína ZNF395 em SMMC-7721 e HEP SK-1 células infectadas com miR525 ou controle de vetores. (C) sequências de ligação potenciais para miR525-3p dentro do ZNF395 3’UTR do ser humano (HSA), o chimpanzé (PTR), rhesus (mm), cão (CFA) e de coelho (Ocu). sequências de sementes estão sublinhados. (D) os plasmídeos repórter da luciferase foram construídos inserindo o ZNF395 3’UTR e fragmentos correspondendo à região a jusante do gene da luciferase. As sequências de ligação previstas para miR-525-3p são mostradas, incluindo a de tipo selvagem de comprimento total UTR (WT) ou mutante (mt, sublinhado) sítios de ligação. a actividade de luciferase relativa (e) foi ensaiada após as células HEK-293T foram co-transfectadas com plasmídeos repórter WT ou MT ZNF395 3’UTR e miR-525-3p. Os valores são apresentados como a média ± SEM, e as estrelas indicam significância estatística a P . 0,01, **

Para entender se RANBP10, IRF1 e ZNF395 são potenciais genes alvo funcional de miR-525 -3p, estes genes foram knockdown utilizando siARN. Os resultados mostraram que a interferência com a expressão IRF1 poderia inibir a migração de células SMMC-7721 e SK-HEP-1, um fenótipo que é incompatível com o fenótipo de miR-525-3p sobre-expressão. Knockdown de RANBP10 endógena e expressão ZNF395 foi capaz de promover a migração de SMMC-7721 e células SK-HEP-1. Este fenótipo é consistente com o fenótipo de miR-525-3p sobre-expressão. (Figura S6 no ficheiro S1). Em seguida, o RANBP10 ZNF395 e os níveis de proteína foram analisadas em células SK-HEP-1-525 e SMMC-7721-525 para determinar se o miR-525 sobre-expressão pode inibir a expressão destas proteínas. Os resultados mostraram que o nível de proteína ZNF395 foi significativamente diminuído em SMMC-7721-525 e SK-HEP-1-525 células (Figura 2B). Considerando que o nível de proteína RANBP10 não foi significativamente afectada (Figura S7 em S1 Arquivo). Assim, ZNF395 foi seleccionado para posterior estudo.

O ZNF395 3’UTR contém um local de ligação para miR-525-3p (previsto por TargetScan), e a sequência de ligação é altamente conservado em várias espécies, tais como humano, chimpanzé, macaco rhesus, cachorro e coelho (Figura 2C). Para determinar se miR-525-3p regula diretamente ZNF395, visando a sua 3’UTR, um ZNF395 full-length luciferase 3’UTR repórter vector foi construído. A actividade de luciferase diminuiu significativamente após a co-transfecção com os construtos 3’UTR imitam luciferase e miR-525-3p. Em contraste, a actividade de luciferase relativa não se alterou de forma significativa quando os sítios de ligação mutantes foram introduzidas (Figura 2D, E), sugerindo que o miR-525-3p poderia regular a expressão ZNF395 directamente por ligação ao seu 3’UTR.

ZNF395 é frequentemente regulada no cancro do fígado e pode inibir a migração celular do cancro do fígado e Invasion

proteína de dedo de zinco 395 é um membro da Krüppel C2H2 família-tipo de proteína dedo de zinco, ea maioria das proteínas nesta função família como activadores da transcrição ou inibidores. ZNF395 não foi previamente relatado para ser envolvido no cancro do fígado ou metástase do tumor. Portanto, os efeitos da ZNF395 sobre o desenvolvimento e progressão do câncer de fígado e o mecanismo subjacente a esses efeitos devem ser investigados. ZNF395 foi significativamente regulada para baixo em tecidos de câncer de fígado (Figura 3A), com a regulação negativa observada em 62% dos tecidos de câncer de fígado (Figura 3B). Para esclarecer o efeito de ZNF395 na migração de células de câncer de fígado e da invasão, a linha celular estável SK-HEP-1-ZNF395 foi estabelecido (Figura S2B em S1 Arquivo) e siRNAs contra ZNF395 foram encomendados, foi determinada a eficiência knockdown de ZNF395-siRNAs por -time PCR real (Figura S2C em S1 Arquivo), ea eficiência de transfecção de SK-HEP-1 e SMMC-7721 foram 89,5% e 97,0% (Figura S2 D, e, F, G, em S1 Arquivo).

(A), os níveis de expressão relativa da ZNF395 em tecidos de carcinoma hepatocelular ou tecidos cancerosos correspondentes (NT) foram determinadas usando ensaios de PCR de transcrição inversa-quantitativos. (B) O gráfico mostra as proporções de amostras de câncer de fígado em que ZNF395 foi regulada para baixo (62%), inalterada (32%), e up-regulada (6%). ZNF395 expressão foi determinada por TaqMan PCR em tempo real em cancro do fígado e os tecidos do fígado não cancerosos adjacentes (NT) (n = 136), e ZNF395 níveis de expressão foram normalizadas para GAPDH. A expressão relativa de ZNF395 é apresentada em um gráfico de caixa. A análise estatística foi realizada com um teste t pareado. (C, D) Lentivírus mediada por sobre-expressão ou knockdown induzida por siARN da expressão ZNF395 foi detectado por Western blot em SK-HEP-1. ((E) os níveis de expressão relativa de miR-madura 525-3p em ZNF395 sobre-expressão ou células SK-HEP-1 knockdown. (F) Transwell de migração e invasão ensaios de SK-HEP-1cells que expressam estavelmente ZNF395 ou controlo de vector. ( .. L) Transwell migração e invasão ensaios de células SK-Hep-1 após o knockdown de ZNF395 endógena imagens representativas são mostrados à esquerda, e 3 campos selecionados aleatoriamente são quantificados na direita as barras de erro representam o SEM; asteriscos indicam significância estatística em P 0,05, *, P 0,01, **; ou P .. 0,001, ***

O nível de expressão ZNF395 foi detectada por ensaio western blot (Figura 3C e D) e os níveis de expressão relativos de miR-madura 525-3p não foi obviamente mudado em ZNF395 sobre-expressão ou knockdown SK-HEP-1, células (Figura 3e), de modo que se pode descartar a possibilidade de uma regulação cruzada de miR-525 por ZNF395 . Este ensaio mostrou que a sobre-expressão de ZNF395 poderia inibir significativamente SK-HEP-1 migração e invasão (Figura 3F), enquanto que a interferência com a expressão ZNF395 endógena pode promover significativamente a migração e a invasão de SK-HEP-1, células (Figura 3G) .

Restauração de ZNF395 inibe a migração celular do cancro do fígado induzida por miR-525 e Invasion

Em uma tentativa de testar se ZNF395 é o mediador funcional direto de miR-525 migração induzida e invasão, um ZNF395 vector lentiviral contendo o ORF de comprimento completo, mas excluindo a 3 ‘UTR foi introduzido na linha celular estável SK-Hep1-525 (Figura 4A). os níveis de expressão relativa de miR-madura 525-3p não estavam obviamente mudado em SK-HEP-1-525 e SK-HEP-1-525-ZNF395 células (Figura 4B). Os resultados mostraram que a elevada expressão ZNF395 foi capaz de compensar as alterações induzidas por miR-525 em SK-HEP-1 migração e invasão (Figura 4C, D). Estes resultados indicaram que ZNF395 é um gene alvo funcional direta para miR-525-3p.

(A) ensaios de Western blot para SK-HEP-1-vector ou SK HEP-1-525 células com ou sem a reintrodução de ZNF395. (B) os níveis de expressão relativa de miR-madura 525-3p em ZNF395 sobre-expressão ou células SK-HEP knockdown-1. migração (C, D) Transwell, ensaios de invasão para SK-HEP-1-vetor ou SK-HEP-1-525 células com ou sem a reintrodução de ZNF395. Estes resultados são representativos de pelo menos três experiências independentes. A análise estatística foi realizada com o teste t de estudante. As barras de erro representam S.E.M, e as estrelas indicam significância estatística a P 0,05, *; e P . 0.001, ***

Discussão

miR-525 está localizado no cromossomo 19q13.42 sem um gene hospedeiro. O nível de miR-525-3p expressão aumentou 6,8-8 vezes em duas linhas celulares de tumores de células germinativas resistentes à cisplatina [33]. Wang et al [34] detectaram expressão miRNA usando miRNA microarray e descobriram que miR-525-3p foi regulado para cima em três pares de tecidos de câncer de fígado. Não há relatos sobre a função e mecanismo de miR-525-3p no câncer. Neste estudo, pela primeira vez, verificou-se que a expressão elevada de miR-525-3p promove a migração de células do cancro do fígado e invasão. ZNF395 é identificado como um gene alvo funcional directa para miR-525-3p.

ZNF395 é um membro da família de zinco do tipo proteína de dedo de Krüppel C2H2. É amplamente expresso e foi originalmente identificada como um factor de transcrição que regula a expressão do vírus do papiloma humano (HPV); Assim, também é conhecido como factor de ligação a HPV (PBF) e podem ligar-se a região do promotor de HPV [35]. ZNF395 é expresso em linhas celulares de glioblastoma induzida por hipoxia e nos vasos sanguíneos de tecidos de glioblastoma adultos [36]. Tsukahara et al [37] verificaram que ZNF395 é um antigénio associado a um tumor. ZNF395 Também foi mostrado para regular a via PI3K /Akt para inibir o crescimento das células [38], através da activação de caspase-3 para promover a apoptose [39]. Não há relatos de ZNF395 estar envolvido na metástase do tumor.

Nós relatamos pela primeira vez que ZNF395 é frequentemente regulada para baixo em tecidos de câncer de fígado e que miR-525-3p pode especificamente a ZNF395 3’UTR . A sobre-expressão de ZNF395 podem inibir a migração de células de cancro do fígado e invasão, enquanto restauração da ZNF395 inibe o miR-525-mediada migração celular e invasão do cancro do fígado. A sobre-expressão de ZNF395 e miR-525 não têm qualquer efeito no NF-kB, MAPK via, mas podem regular de PI3-K /Akt através da alteração do estado de P-Akt (Figura 5, Figura S8 em S1 do ficheiro).

a análise Western blot de PI3-K /Akt em células SK-HEP-1-525 e SK-HEP-1-ZNF395.

em resumo, este estudo mostra que a alta expressão de miR-525-3p promove a migração de células de câncer de fígado e invasão. ZNF395 é um gene alvo funcional directa de miR-525-3p; miR-525-3p promove a migração de células do cancro do fígado e invasão por regulação negativa da expressão de ZNF395. Esta descoberta revela um novo mecanismo de metástase de câncer de fígado e novos alvos para o tratamento de câncer de fígado.

Informações de Apoio

Tabela S1.

As sequências de sondas de miRNA

doi: 10.1371. /journal.pone.0090867.s001

(DOCX)

Tabela S2.

A em tempo real iniciadores de PCR para os potenciais candidatos de genes alvo previstos

DOI: 10.1371. /journal.pone.0090867.s002

(DOCX)

Tabela S3.

Primers para miR-525, ZNF395, ZNF395 3’UTR e clonagem 3’UTR mutante

doi: 10.1371. /journal.pone.0090867.s003

(DOCX)

Tabela S4. sequências

siRNA contra IRF1, RANBP10 e ZNF395

doi: 10.1371. /journal.pone.0090867.s004

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S1 arquivo.

Apoiando informações sobre os resultados obtidos, contendo Figura S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7 e S8. Figura S1. Os níveis de expressão de miR-525-3p em várias linhas celulares de cancro. miR-525-3p expressão foram determinados por TaqMan PCR em tempo real em linhas celulares de cancro. Os níveis de expressão foram normalizados para U6 snRNA. Figura S2. Os níveis de linhas celulares estáveis ​​de expressão que expressam fortemente o miR-525 e ZNF395. (A) os níveis de expressão relativos de madura miR-525 em SMMC-7721-525 e SK-HEP-1-525, foram utilizados ensaios ABI TaqMan miRNA e os dados foram normalizados por U6b snRNA. (B) O nível de expressão relativa de ZNF395 no SK-HEP-1 ou vetor de controle, os dados foram normalizados por GAPDH. (C) Queda de eficiência ZNF395-ARNsi. A mistura de ZNF393 siRNA-1, ZNF393 siRNA-2, e ZNF393 siRNA-3 foi nomeado ZNF393 siRNA-1 + 2 + 3. (D, E, F, G) A eficiência de transfecção de FAM-siRNA em células SK-HEP-1 e SMMC-7721. Estrelas são indicados para mostrar significância, P 0,01, **; P 0,001, ***. Figura S3. miR-525 não tem efeitos significativos sobre o crescimento celular HCC. Os ensaios de proliferação celular para SMMC-7721 (A) e as células infectadas com lentivírus ou miR525 expressam controlo do vector SK-HEP-1 (B). A contagem das células Kit-8 (CCK-8) ensaio foi utilizado para avaliar a proliferação celular. A média dos valores estão representados como mostrado, e as barras indicam S.E.M em triplicado. P = NS (não significativa) por estudante do

t

-teste. Figura S4. Os níveis de expressão de genes alvo potenciais candidatos previsto. Os dados foram normalizados pelo GAPDH, e apresentados como média ± S.E.M. Figura S5. Os níveis de expressão de genes candidatos em tecidos de câncer de fígado. A expressão de (A) RANBP10, (B) IRF1, (C) ZNF395, (D) NACC1 e (E) MLST8 foram determinadas por ensaios quantitativos em tempo real de PCR em cancro do fígado e os tecidos do fígado não cancerosos adjacentes (NT) (n = 12 ). Os dados foram normalizados pelo GAPDH, estrelas são indicados para mostrar significância, P 0,05, *; P 0,001, ***. Figura S6. Interferência IRF1, RANBP10 e expressão ZNF395 pode inibir ou promover SMMC-7721 e SK-HEP-1 células migração. (A) A interferência expressão IRF1 poderia inibir SMMC-7721 e SK-HEP-1 células migração. RANBP10 interferência (B) e expressão ZNF395 (C) pode promover SMMC-7721 e SK-HEP-1, células de migração. Figura S7. RANBP10 expressão não é obviamente alterada em miR-525 células sobre-expresso. ensaios de Western blot da expressão RANBP10 no SK-HEP-1 e SMMC-7721 células infectadas com miR525 ou controle de vetores. Figura S8. Sobre-expressão de miR-525 e ZNF395 não têm nenhum efeito no NF-kB, caminho ou EMT marcadores MAPK. A análise de Western blot de NF-kB (A), (B) MAPK pathway e EMT marcadores (C) em células SK-HEP-1-525 e SK-HEP-1-ZNF395

doi:. 10.1371 /journal.pone .0090867.s005

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Reconhecimentos

Agradecemos ao professor Didier Trono (Escola de Ciências da Vida, Ecole Polytechnique Fe’de’rale de Lausanne, 1015 Lausanne, Suíça) para os generosos presentes dos plasmídeos pWPXL, psPAX2 e pMD2.G.