Abstract

O cancro do pulmão continua a ser a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) representa aproximadamente 80% do total de casos de cancro do pulmão. O uso de fitoquímicos dietéticos não tóxicos pode ser considerado como uma estratégia quimioterapêutico para a gestão do NSCLC. Aqui, nós relatamos que proantocianidinas de semente de uva (GSPs) induzir a apoptose de células NSCLC, A549 e H1299,

in vitro

que é mediado através do aumento da expressão da proteína pró-apoptótica Bax, diminuição da expressão de proteínas anti-apoptóticos Bcl2 e Bcl-XL, perturbação do potencial de membrana mitocondrial e activação de caspases 9, 3 e poli (ADP-ribose) polimerase (PARP). Pré-tratamento de células A549 e H1299 com o inibidor de caspase-3 (Z-DEVD-FMK) bloqueou significativamente a apoptose destas células induzidas GSPs-confirmou que a apoptose induzida por GSPs é mediada através da activação de caspases-3. Tratamentos de A549 e células H1299 com GSPs resultou em um aumento na paragem em G1. G0 /fase G1 do ciclo celular é conhecido por ser controlado por cinases dependentes de ciclina (CDK), inibidores de quinase dependente de ciclina (Cdki) e ciclinas. Nossas análises de Western blot mostrou que a paragem do ciclo celular G1 induzido GSPs foi mediado através do aumento da expressão de proteínas Cdki (Cip1 /p21 e KIP1 /p27), e uma redução simultânea dos níveis de Cdk2, Cdk4, CDK6 e ciclinas. Além disso, a administração de 50, 100 ou 200 mg /kg GSPs peso corporal de ratinhos por gavagem oral (5 d /semana) inibiu marcadamente o crescimento de

sc

A549 e H1299 de pulmão xenoenxertos de tumor em ratinhos nus atímicos, que foi associada com a indução da morte celular por apoptose, aumento da expressão de Bax, a diminuição da expressão das proteínas anti-apoptóticas e a activação de caspase-3 em células de tumor de xenoenxerto. Com base nos dados obtidos no estudo animal, foi calculada a dose humana equivalente de SPG, que parece acessível e atingível. Juntos, estes resultados sugerem que GSPs pode representar um potencial agente terapêutico para o câncer de pulmão de células não pequenas

Citation:. Singh T, Sharma SD, Katiyar SK (2011) Uva Proanthocyanidins induzir a apoptose pela perda de Membrana Mitocondrial potencial de células humanas não-pequenas células do cancro do pulmão

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 6 (11): e27444. doi: 10.1371 /journal.pone.0027444

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de agosto de 2011; Aceito: 17 de outubro de 2011; Publicação: 08 de novembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Singh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por fundos do Mérito Veterans Administration revisão Award (SKK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão continua a ser a principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos e em todo o mundo [1]. Um em cada três mortes relacionadas com o cancro é atribuível ao câncer de pulmão, ea taxa de sobrevida em 5 anos sombrio de cerca de 14% não mostrou melhora nas últimas três décadas [2], [3]. cancro do pulmão de pequenas células e cancro do pulmão de não-pequenas células (NSCLC) são responsáveis ​​por 90% de todos os cânceres de pulmão. NSCLC representa aproximadamente 80% de todos os tipos de cancro do pulmão e inclui carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, carcinomas de células e grande [4], [5]. Apesar de uma combinação de quimioterapia e terapia de radiação pode melhorar a sobrevivência dos pacientes, a maioria dos doentes morre de progressão da doença, muitas vezes, resultante do intrínseco ou adquirido resistência a fármacos quimioterapêuticos [6]. Portanto, a exploração e desenvolvimento de agentes terapêuticos mais eficazes e terapias que podem direcionar as moléculas associadas com o crescimento do tumor e resistência à apoptose levará a melhores resultados em pacientes com câncer de pulmão.

produtos vegetais Natural oferecer novas opções promissoras para o desenvolvimento de estratégias de quimioterapia mais eficazes para cancros de vários órgãos. proantocianidinas de semente de uva (GSPs) são promissores fitoquímicos que têm propriedades anti-inflamatórias [7] e anti-oxidante propriedades [8] – [10], e parecem exibir uma toxicidade mínima em animais de laboratório [9], [10]. GSPs são facilmente extraído da uva-sementes, um subproduto das indústrias de suco de uva e vinho, e são uma mistura de vários componentes polifenólicos, que constituem dímeros, trímeros, tetrâmeros e oligômeros /polímeros de catequinas monoméricas e /ou (-) -epicatechins, como descrito anteriormente [9], [10]. Acreditamos que, pelo menos, alguns dos constituintes presentes em GSPs actuam de forma sinérgica e pode proporcionar melhores efeitos quimioterapêuticos do que um único componente.

Anteriormente, mostrámos que a suplementação dietética com a dieta de controlo GSPs AIN76A resultou numa dose inibição dependente do crescimento de A549 e xenoenxerto de tumor H1299 NSCLC em ratinhos nus atímicos, e o efeito inibidor do crescimento de GSPs sobre os tumores de xenoenxerto NSCLC foi associado com o aumento dos níveis de insulina como factor de crescimento de ligação de proteína-3 e anti- efeitos angiogénicos no microambiente do tumor (11). Em outro estudo, também relataram que GSPs inibir a proliferação e induz a apoptose de células NSCLC

in vitro

e

in vivo

xenotransplantes tumorais, que foi associado com os seus efeitos inibidores da cyclooxygenase- 2 expressão e produção do seu metabolito da prostaglandina, PGE

2 (12). Em contraste, não foi observada uma inibição significativa da proliferação celular e na indução de apoptose em células epiteliais brônquicas humanas normais após tratamento sob condições idênticas GSPs [11], [12]. Apesar dos efeitos anti-cancerígenos dos GSPs em células NSCLC, um mecanismo exacto do efeito inibidor sobre o crescimento de células NSCLC e apoptose pelo GSPs não é bem compreendido. Na presente comunicação, realizamos uma investigação abrangente sobre o mecanismo responsável pela inibição da proliferação de células de câncer de pulmão e apoptose utilizando A549 e linhas de células H1299 como um

in vitro

modelo de cultura celular e

In vivo

modelo de xenotransplante tumoral. Para estudar o

in vivo

efeito da GSPs no crescimento de xenotransplante tumoral, GSPs foi dado a ratos por sonda oral 5 dias /semana. Relatamos que GSPs induzida morte celular apoptótica de células NSCLC é mediada através de modulações nos níveis de proteínas pro- e anti-apoptóticas, perda do potencial de membrana mitocondrial e caspase-3 vias de activação de expressão. GSPs também verificou a progressão do ciclo celular desregulado e proteínas reguladoras associadas em células NSCLC. Assim os nossos estudos fornecem informações sobre o mecanismo pelo qual GSPs induzir a apoptose nestas células. Além disso, nossos resultados fornecem uma base lógica convincente para a actividade farmacológica do GSPs contra células de câncer de pulmão de células não-pequenas humanas.

Materiais e Métodos

Os reagentes, produtos químicos e anticorpos

os GSPs utilizados neste estudo foram obtidos a partir de Kikkoman Corporation (Noda, Japão). A membrana mitocondrial potencial Kit de Detecção de JC-1, e Anti-OxPhos Complexo IV subunidade IV (IV Cox) foram adquiridos de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Cell Death Detection Kit de ELISA foram obtidos a partir de Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN). Os anticorpos primários foram comprados como se segue: anticorpos para a proteína Bcl-2, Bcl-XL, Bax, caspases-9 e -3, anti-poli (ADP-ribose) polimerase de caspase-9 clivada, (PARP) e β-actina foram adquiridos de celular tecnologia de sinalização (Beverly, MA); anticorpos para o citocromo c, Smac /DIABLO, ciclina D1, ciclina D2, ciclina E, Cdk2, Cdk4, CDK6, Cip1 /p21, KIP1 /p27 e os anticorpos secundários, peroxidase ligadas anti-rato imunoglobulina G e imunoglobulina anti-coelho G eram obtido a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). A caspase-3-inibidor específico (Z-DEVD-FMK) foi adquirido de Calbiochem (San Diego, CA). ApoTarget kit específico para ensaio da actividade da caspase-3 foi obtido a partir de Biosource International, Inc. (San Diego, CA). de Ham F-12, meio RPMI 1640, penicilina, estreptomicina e tripsina /EDTA foram obtidos de Cellgro (Herndon, VA). Os quimioluminescência aumentada western blotting reagentes de detecção foram adquiridos a Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ).

cultura de células e linhas celulares

linhas de não-pequenas células humanas de carcinoma do pulmão de células, A549 e H1299, e células epiteliais brônquicas humanas normais foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). As linhas de células A549 e H1299 foram cultivadas como monocamadas em meio de Ham F-12 e RPMI 1640 cultura, respectivamente, suplementado com soro inactivado por calor a 10% de bovino fetal (Hyclone, Logan, UT), 100 ug /ml de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina e mantidos numa incubadora com uma atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2 a 37 ° C. Os GSPs foram dissolvidos numa pequena quantidade de dimetilsulf óxido [DMSO, concentração máxima, 0,1% (v /v)], que foi então adicionada para completar o meio de cultura de células antes da adição de células confluentes (60-70% confluentes). As células tratadas apenas com veículo (DMSO, 0,1% em meios) serviu como controlo.

Análise de morte celular por apoptose por meio de ELISA

As células foram tratadas com GSPs durante 48 h e em seguida colhido. GSPs induzida por apoptose foi determinada utilizando o Cell Death Detection Kit ELISA (Roche Diagnostics, Palo Alto, CA), que quantifica fragmentos de ADN associado a histona citoplasmáticos sob a forma de mononucleosomes ou oligonucleosomes, seguindo as instruções do fabricante.

a caspase-3 ensaio de actividade

a actividade da caspase-3 em lisados ​​celulares foi medida utilizando o ensaio colorimétrico de protease ApoTarget Kit (Biosource International, Inc., CA) seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células H1299 ou A549 foram tratadas com GSPs (20, 40, 60 e 80 ug /ml) durante 48 h. Em seguida, as células foram colhidas utilizando tripsinização curto e lisados ​​celulares preparados seguindo o protocolo do fabricante. As amostras dos lisados ​​celulares (100 ug de proteína por amostra) foram misturadas com tampão de reacção e 200 pmol /L de substrato (DEVD-pNA para a caspase-3) e incubou-se durante 3 h a 37 ° C no escuro. A absorvência foi então medida a 405 nm e as leituras da amostra calculado por subtracção da absorvância das amostras em branco.

análise do ciclo celular de ADN

sub-confluente de células (50-60%) foram tratadas com concentrações variáveis ​​de GSPs em meio completo durante 48 h. As células foram então colhidas, lavadas com PBS frio, e processado para análise do ciclo celular, tal como descrito anteriormente [13], [14]. Resumidamente, as células (1 x 10

5) foram re-suspensos em 50 ul de PBS frio a que 450 uL de metanol frio foi adicionado e as células foram então incubadas durante 1 h a 4 ° C. As células foram centrifugadas a 1100 rpm durante 5 minutos; O sedimento foi lavado com PBS frio, ressuspensas em 500 ul de PBS, e incubadas com 5 ul de ARNase (20 ug /ml de concentração final) durante 30 minutos. As células foram incubadas com iodeto de propídio (50 ug /mL) em gelo, durante 1 h no escuro. A distribuição do ciclo celular das células foi então determinada usando FACSCalibur instrumento (BD Biosciences, San Jose, CA) equipado com software CellQuest 3,3 em (FACS) máquina do celular activada por fluorescência na instalação Núcleo do Cancer Center UAB Comprehensive.

a imunoprecipitação e análise western blot

a seguir ao tratamento de A549 e células H1299 com GSPs, as células foram colhidas, lavadas com PBS frio e lisadas com tampão de lise arrefecido em gelo suplementado com inibidores de protease, como detalhado anteriormente [12], [13]. Para imunotransferência de citocromo

C

, Smac /DIABLO e Cox IV, fracções mitocondriais e citosólicas foram preparados a partir das células e as proteínas foram resolvidas em géis de 10% Tris-glicina e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. Depois de bloquear os sítios de ligação não específicos, a membrana foi incubada com o anticorpo primário desejado, a 4 ° C durante a noite. A membrana foi então incubada com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase apropriados e as bandas imunorreactivas foram visualizadas utilizando os reagentes de quimioluminescência aumentada. Cada membrana foi despida e re-sondadas com anticorpo anti-actina β para assegurar o carregamento igual de proteína.

Para inibidor de Cdk (Cdki) -Cdk ensaio de ligação, as células A549 foram tratados com veículo ou 60 ug /mL GSPs durante 48 h, lavadas com PBS gelado, e os lisados ​​de células totais preparados como descrito previamente [13]. Alíquotas contendo 200 mg de proteína foram apuradas com /G-além de pérolas de agarose de proteína A (Santa Cruz, CA). proteínas Cip1 /p21 e KIP1 /p27 foram imunoprecipitadas a partir de lisados ​​de células inteiras, utilizando anticorpos específicos após incubação durante 8 horas, seguida pela adição de pérolas de agarose /G-além de proteína A (50 uL, Santa Cruz, CA) e continuou a incubação durante a noite a 4 ° C. Os imunoprecipitados foram lavados, e subsequentemente sujeito a análise Western blot utilizando géis de Tris-Glicina, seguido por imunotransf erência utilizando anticorpos Cdk2, CDK4 e CDK6.

Ensaio para a membrana mitocondrial potencial

A mudança na membrana mitocondrial potencial em células de cancro de pulmão após o tratamento com GSPs foi determinada por citometria de fluxo utilizando a sonda fluorescente catiónico lipófilo JC-1 (5,5 ‘, 6,6′-tetracloro-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodeto) Detecção kit de acordo com as instruções do fabricante, e, como descrito por nós anteriormente [13], [14]. JC-1 acumula selectivamente dentro de mitocôndrias intactas para formar multímeros J-agregados emissor de luz de fluorescência a 590 nm. A forma monomérica emite luz a 527 nm após excitação a 490 nm. Assim, a cor das mudanças de corantes de laranja para verde, dependendo do potencial de membrana mitocondrial, e pode ser analisada por FACS com fluorescência verde no canal 1 (FL1) e emissão de laranja no canal 2 (FL2).

Animais e xenotransplante tumoral estudo

ratinhos nus atímicos fêmea (4-5 semanas de idade) foram adquiridos da National Cancer Institute (Frederick, MD), instalado em conformidade com as orientações animal Care Institucional e Comitê de Uso e fornecida com a dieta esterilizado AIN76A e água

ad libitum

. Todos os ratinhos foram mantidos sob condições padrão de uma 12-h de escuridão /12 horas de ciclo de luz, a uma temperatura de 24 ± 2 ° C, e humidade relativa de 50 ± 10%. O protocolo de origem animal utilizado neste estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Alabama em Birmingham, e aprovado animal protocolo número é: 101109267.

Para determinar o

in vivo

eficácia de GSPs contra o crescimento do tumor de xenoenxerto de cancro do pulmão humano, células em crescimento exponencial e A549 H1299 (2 × 10

6) foram misturados a uma razão de 01:01, com Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA), e uma de 100 uL suspensão contendo 2 x 10

6 células foi injectado SC no flanco direito de cada ratinho. Após 24 h, os ratinhos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (n = 10). Os animais experimentais foram tratados por cânula oral com 50, 100 ou 200 mg /kg GSPs de peso corporal /dia em 100 ul de PBS cinco dias por semana (de segunda a sexta-feira) começando um dia após implantação de células de tumor. Os ratinhos de controlo receberam um volume igual de PBS. A experiência foi terminada 58 dias depois da inoculação das células tumorais. O crescimento tumoral foi monitorizado a 2 vezes por semana. O peso corporal /mouse e dieta consumo /rato foram registrados regularmente durante todo o experimento. Os animais também foram monitorados se ficarem doentes ou sofrimento (grooming e evasão comportamentos normais falta) durante todo o período do experimento. No final da experiência, toda a massa tumoral foi colhido, pesados, e uma parte do tumor foi usado para a preparação de lisados ​​tumorais para analisar os níveis de diferentes proteínas de interesse e uma parte restante de expressão foi usado para a análise imuno-histoquímica.

detecção imuno-histoquímica de células PCNA-positivas e TUNEL-positivos

Cinco mm secções de tumor de espessura foram desparafinados e reidratadas em uma série graduada de álcoois. Após reidratação, um processo de recuperação de antigénio foi realizada colocando-se as lâminas em tampão de citrato de sódio 10 mM, pH 6,0 a 95 ° C durante 20 minutos seguido de 20 minutos de arrefecimento. As secções foram lavadas em PBS e os locais de ligação não específicos foram bloqueados com BSA a 1% com soro de cabra a 2% em PBS antes da incubação com os anticorpos anti-PCNA durante 2 h à temperatura ambiente. Após a lavagem, as secções foram incubadas com anticorpo secundário biotinilado durante 45 min, seguida por estreptavidina conjugada com HRP, lavagem em PBS, a incubação com substrato de diaminobenzidina, e contra coloração com hematoxilina. A morte celular apoptótica em tecidos tumorais foi detectada utilizando ensaios de desoxinucleotidilo terminal de dUTP nick-fim de rotulagem mediada-transferase (TUNEL). O número de células PCNA positivas e TUNEL-positivas foram detectadas e contadas utilizando um microscópio de luz. Os resultados são apresentados como o número de células positivas x 100 /número total de células.

A análise estatística

Os resultados do

In vivo

estudos são representativos de pelo menos 2-3 experiências independentes. A significância estatística da diferença entre controle e grupos tratados com GSPs foram calculados pelo teste t de Student (Sigma Stat 2,03, Jandel Scientific, San Rafael, CA). Todos os dados quantitativos são apresentados como média ± DP. No estudo de xenotransplante tumoral, a significância estatística da diferença entre controle e grupos tratados com GSPs foi determinada por ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni t, e em cada caso P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

células NSCLC são sensíveis a apoptose induzida GSPs-

Nós mostramos que o tratamento de células A549 NSCLC e H1299 com várias concentrações de GSPs inibe o crescimento ou a proliferação potencial destas células em uma dose e dependente do tempo maneira. GSPs também induziu a morte celular por apoptose destas células de um modo dependente da concentração, [11], [12]. A apoptose induzida GSPs-de células A549 H1299 e após o tratamento durante 48 h, usando análise de FACS é resumido na Figura 1A. No entanto, um mecanismo exacto do efeito anti-apoptóticos de GSPs contra células NSCLC não está claramente entendido. Portanto, os estudos foram realizados para determinar o mecanismo exacto envolvido na morte celular por apoptose de células NSCLC pelo tratamento com GSPs.

(A)

In vitro

tratamento de A549 e H1299 células com GSPs induz apoptose de um modo dependente da dose. morte celular por apoptose foi analisada usando análise FACS, e a percentagem total de células em apoptose em A549 e H1299 células são resumidos como média ± SD, n = 3. Os controlos Diferença significativa em relação não-GSPs tratados-:

*

P

0,05;

¶

P Art 0,01;

†

P Art 0,001. (B) O tratamento de células A549 e H1299 com GSPs resulta numa redução dependente da dose, na expressão das proteínas anti-apoptóticas, Bcl-2 e Bcl-XL, enquanto o aumento da expressão da proteína pro-apoptótica, Bax, tal como determinado por A análise de western blot. Os dados são representativos de três experiências independentes, com resultados semelhantes.

GSPs reduzir a expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-XL e Bcl-2, enquanto o aumento da expressão de proteína pro-apoptótica em Bax e A549 células H1299

as proteínas da família Bcl-2 desempenham um papel importante na regulação da apoptose por funcionando como promotores (

por exemplo

., Bax) ou inibidores (Bcl-2 ou Bcl-XL ) de morte celular [15] – [17]. Utilizando a análise de Western Blot, descobrimos que o tratamento de A549 e células H1299 com GSPs durante 48 h resultou numa redução dependente da dose nos níveis das proteínas anti-apoptóticas Bcl-XL e Bcl-2, e um aumento nos níveis de a proteína pro-apoptótica, Bax, em comparação com as células de controlo tratados com veículo (Figura 1 B). Assim, o tratamento destas células de cancro do pulmão com GSPs pode alterar os níveis de proteína dos membros principais da família Bcl-2 de uma forma que favorece um aumento na proporção de Bax: Bcl-2, o que pode contribuir para a susceptibilidade das células cancerosas à apoptose [15] GSP-induzido.

GSPs induzir uma perda de potencial de membrana mitocondrial e uma melhoria subsequente da liberação de citocromo c e Smac /DIABLO em células NSCLC

a perda de potencial de membrana mitocondrial tem sido associada com a iniciação e a activação do processo de apoptose em células [15], [16]. A libertação de citocromo c e Smac /DIABLO das mitocôndrias para o citossol contribui para a activação de caspases e, subsequentemente leva a morte celular por apoptose. Para explorar os efeitos de GSPs sobre este processo na A549 e células H1299, citosólica e fracções mitocondriais foram preparadas a partir de células que tinham sido tratadas com GSPs durante 48 h. Os resultados da análise de Western blot revelou que o tratamento de GSPs resultou num aumento dependente da dose no citocromo C e a libertação Smac /DIABLO para o citosol e uma diminuição correspondente dos níveis de citocromo c e Smac /DIABLO nas fracções mitocondriais em ambos A549 e H1299 células (Fig. 2A e 2B), sugerindo, assim, a perda do potencial de membrana mitocondrial no tratamento GSPs nestas células. As manchas foram retirados e re-sondado com anticorpo anti-COX IV para descartar a possibilidade de contaminação cruzada das fracções mitocondriais e citosólicas. A presença de COX IV não foi detectada nas fracções citosólicas

(A B). Imunotransferência para citocromo

C

e Smac /DIABLO usando citosólica e fracções mitocondriais preparadas a partir de células A549 e H1299 na sequência tratamento com concentrações indicadas de GSPs durante 48 h. As manchas foram retirados e re-sondado com anticorpo anti-COX IV para assegurar a igualdade de carga de proteína mitocondrial, bem como para descartar a contaminação cruzada das fracções mitocondriais e citosólicas. (C) O tratamento da A549 e as células H1299 com GSPs induz a perda de potencial de membrana mitocondrial. As células foram tratadas com as doses indicadas de GSPs durante 48 h. JC-1 de células coradas com corante foram analisadas por citometria de fluxo, tal como descrito em Materiais e Métodos. Os dados são representativos de duas experiências separadas com observações idênticas.

Para verificar ainda que GSPS induzir uma perda de potencial de membrana mitocondrial, foi utilizado o corante catiónico lipofílico, JC-1, que se acumula dentro da mitocôndria numa forma potencial-dependente. Na perturbação do potencial de membrana mitocondrial, a emissão de fluorescência de JC-1 mudanças de corante de vermelho para verde. Quarenta e oito horas após a adição dos GSPs, o A549 H1299 e as células foram recolhidas, incubadas com corante JC-1 e a emissão de fluorescência analisadas utilizando citometria de fluxo. Tal como mostrado na Figura 2C, o tratamento de SPG A549 e células H1299 resultou num aumento dependente da dose no número de células com fluorescência verde-positiva, tal como mostrado no quadrante inferior direito (RV) do histograma de FACS. Colectivamente, estes estudos sugerem que o tratamento GSPs induzir apoptose de ambas as células de carcinoma do pulmão A549 e H1299 através da ruptura do potencial de membrana mitocondrial.

GSPs induzir a activação de caspases e PARP tanto nas células H1299

p> a liberação do citocromo

c

e Smac /DIABLO em citosol ativa procaspase 9 na apoptossomo e leva a caspase-9 clivagem ativa e clivagem da caspase-3 [18] – [20]. A activação de caspase-3, subsequentemente leva a morte celular por apoptose por meio de clivagem de um largo espectro de proteínas alvo incluindo PARP. Portanto, determinou-se a indução de apoptose de células A549 e H1299 por GSPs é mediada através da activação de caspase-3 e PARP proteínas pro-caspase-9,. O tratamento de células A549 e H1299 com GSPs durante 48 h resultou numa redução dependente da dose nos níveis de caspase-9, enquanto que o aumento da clivagem de caspases-9, caspase-3 e proteínas de PARP em comparação com as células tratadas com veículo (Figura 3A ). a activação de caspase-3 Os GSPs-induzida em células A549 e H1299 também foi determinada utilizando um ensaio de actividade da caspase-3 colorimétrico. Tratamento de ambas as A549 e células H1299 com cancro do pulmão com GSPs durante 48 h resultou numa significativamente maior (p 0,05; p 0,001) a actividade da caspase-3 de um modo dependente da dose, do que o observado nas células de controlo tratados com veículo (Figura 3B).

(a) o tratamento de células H1299 e A549 com GSPs reduz o nível de caspase-9, enquanto que aumenta a activação /de clivagem de caspase-9, caspase-3 e PARP de um modo dependente da dose. As células foram tratadas com concentrações variáveis ​​de GSPs (0, 20, 40, 60 e 80 ug /ml) durante 48 h, em seguida as células foram colhidas, lisados ​​celulares preparados e sujeitos a análise de Western blot para detectar os níveis de caspase-9 clivada, caspase-9, caspase-3 e PARP. Um blot representativo é mostrado a partir de três experiências independentes com resultados semelhantes. (B) A actividade da caspase-3 em lisados ​​celulares a partir das amostras do Grupo A foi medido utilizando um ensaio colorimétrico de protease (ApoTarget Kit). tratamento GSPs a A549 e as células H1299 aumenta a actividade da caspase-3, dependente da dose. diferença significativa em relação grupo de tratamento não-GSPs,

¶

P Art 0,01 e

*

P Art 0,001. (C) O efeito de GSPs (60 e 80 ug /ml) sobre apoptose de A549 e células H1299 foi determinada após 48 h na ausência ou na presença de 60 pmol /L do inibidor da caspase-3 (Z-DEVD-FMK) . O conteúdo de células apoptóticas foi determinado utilizando detecção morte celular kit de ELISA, tal como descrito em Materiais e Métodos. As células tratadas com Z-DEVD-FMK bloqueou a apoptose induzida GSPs-em A549 e células H1299. A percentagem de células apoptóticas nos diferentes grupos de tratamento foram resumidos e os dados são apresentados como média ± DP de duas experiências repetidas. inibição significativa por inibidor de caspase-3 contra GSPs apenas células tratadas,

*

P Art 0,001. Ci = caspase-3 inibidor, C = controlo, sem qualquer tratamento.

apoptose O tratamento com o inibidor de caspase-3 (Z-DEVD-FMK) bloqueia GSPs-induzida de ambos A549 e células H1299

Para confirmar adicionalmente que a activação induzida GSPS-de caspase-3 está envolvida na indução da morte celular por apoptose de A549 e células de cancro do pulmão humano H1299, determinou-se a apoptose induzida GSPs-de A549 e células H1299 foi afectada pela adição do inibidor específico de caspase-3-(Z-DEVD-FMK). A549 e células H1299 tinham sido tratados com GSPs com ou sem Z-DEVD-FMK (60 umol /L) durante 48 h. As células foram colhidas e a morte celular foi ensaiada utilizando celular kit de ELISA de Detecção da Morte seguindo as instruções do fabricante. Como mostrado na Figura 3C (painel esquerdo), o tratamento de células A549 com GSPs nas concentrações de 60 e 80 ug /ml resultou em 31% e 49% de apoptose ou morte celular, respectivamente, em comparação com 6,5% em células de controlo não-GSPs-tratados . O tratamento de células A549 com GSPs (60 ou 80 ug /ml) na presença de Z-DEVD-FMK resultou em apenas 14% e 17% de apoptose, respectivamente, o que indica claramente que a presença de inibidor de 3-específica por caspases significativamente bloqueados morte apoptótica de células induzidas GSPs-(

P

0,001) em células A549. Foram encontrados resultados semelhantes quando H1299 células foram tratadas com GSPs na presença ou ausência de Z-DEVD-FMK, como mostrado na Figura 3C (painel da direita). Estes resultados indicam que a apoptose de células de cancro do pulmão, tanto humano A549 H1299 e GSPs-induzido está associado com a activação de caspase-3.

GSPs induzir a paragem do ciclo celular fase G1 em células NSCLC

baseada nos estudos preliminares, onde foi observada uma forte efeito inibidor do crescimento de células NSCLC na GSPs, que, em seguida, determinou-se a possível mecanismo de actividade anti-proliferativa de GSPs que podem conduzir à morte celular apoptótica. Para este efeito, foi determinado o efeito de GSPs sobre a progressão do ciclo celular em células A549 e H1299 na sequência do tratamento com GSPs durante 48 h. Como sumariado na Figura 4, (Painéis A-D), o tratamento de células A549 com GSPs resultou num maior número significativo de células em fase G1 em todas as concentrações utilizadas: 20 ug /mL (58,3%,

P

0,05), 40 ug /mL (67,9%,

P

0,001) e 60 ug /mL (75,5%,

P

0,001) em comparação com o não -GSPs tratados de controlo (52,7%). Como indicado na Figura 4 (esquerda pains A-D), o efeito dependente da dose de GSPs em paragem em G1 em células A549 foi em grande parte à custa de células na fase S com uma alteração mínima da população celular G2-M em comparação com o não as células de controlo -GSPs-tratados (Painel A). efeito semelhante de GSPs na prisão fase G1 também foi encontrada em células H1299 (Figura 4, painéis direitos A-D). Os resultados da distribuição do ciclo celular em cada dose de GSPs também estão resumidos no Painel E, o que indicou a prisão significativa de células A549 e H1299 na fase G0-G1 após o tratamento GSPs.

As células foram tratadas com quer veículo ( 0,1% de DMSO em meio) ou 20, 40 e 60 ug de doses /ml de GSPs em meio completo. Após 48 h de tratamento, as células foram colhidas e digerido com RNase. O ADN celular foi corado com iodeto de propídio e análise de citometria de fluxo foi realizada para analisar a distribuição do ciclo celular, tal como descrito nos Materiais e Métodos. (A-D) a distribuição do ciclo celular em A549 (painéis esquerdos) e H1299 (painéis da direita) células com o tratamento de várias concentrações de SPG. (E) Os dados da distribuição do ciclo celular foram resumidos e apresentados como a média ± DP de três experiências independentes. Estatisticamente significativa versus não-GSPs tratada grupo controle,

¶

P Art 0,05 e

*

P

. 0,01

GSPs diminuir a expressão das proteínas de regulação das CDK G1 e ciclinas nas células NSCLC

Estudos têm mostrado que Cdks e ciclinas desempenha um papel crucial na regulação da progressão do ciclo celular [21], portanto, determinou-se o efeito de na GSPs os níveis de proteína das Cdks e ciclinas que são regulados negativamente pela Cdki (Cip1 /p21 e KIP1 /p27) durante a progressão do ciclo celular fase G1. Como mostrado na Figura 5 (Painel A), o tratamento de células A549 com GSPs resultou numa diminuição marcada na expressão de Cdk2, CDK4 e CDK6 de uma forma dependente da dose em 48 h após tratamento GSPs. Uma forte redução em Cdks foi observado nas doses de 40-80 concentrações ug /mL de SPG. Do mesmo modo, foi observada uma redução marcada na expressão de ciclinas D1, D2 e ​​E de uma maneira dependente da dose. efeito idêntico de GSPs foi também encontrado quando as células H1299 foram tratados com GSPs e sob condições idênticas (Figura 5A, painéis direitos).

As células foram tratadas com quer veículo (0,1% de DMSO em meio) ou GSPs (20 , 40, 60 e 80 ug /ml) durante 48 h e em seguida colhidas, lisados ​​celulares preparados e então sujeitos a SDS-PAGE seguido por análise de transferência de Western, como descrito em Materiais e métodos.