Abstract

Fundo

Evidências acumuladas sugerem que célula de transição epitelial-mesenquimal (EMT) e de haste do cancro (CSC) características, os quais contribuem para a invasão tumoral e metástase, estão interligados com miR-21. MiR-21 é um dos microRNAs importantes associados com a progressão de tumores e metástases, mas os mecanismos moleculares subjacentes EMT e CSC fenótipo durante a miR-21 contribui para a migração e invasão de células de câncer de mama continuam a ser elucidado.

Metodologia /As principais conclusões

neste estudo, MDA-MB-231 /anti-miR-21 células foram estabelecidas por Transfectados hsa-miR-21 antagomir em células de cancro da mama MDA-MB-231. EMT foi avaliado pelas alterações de marcadores de células mesenquimais (N-caderina, vimentina, e alfa-SMA), marcador de célula epitelial (caderina-E), bem como as capacidades de migração celular e invasão; CSC fenótipo foi medida usando as mudanças de marcadores de superfície CSC (ALDH1 e CD44), e a capacidade de sphereforming (mammospheres). Descobrimos que o antagonismo de miR-21 inverteu EMT e CSC fenótipo, acompanhado com PTEN up-regulação e AKT /ERK1 /2 inativação. Curiosamente, a sub-regulação de PTEN por siPTEN suprimidos os efeitos de miR-21 antagomir sobre EMT e CSC fenótipo, confirmando que PTEN é um alvo de miR-21 na reversão EMT e CSC fenótipo. Os inibidores de PI3K-AKT e ERK1 /2 vias, LY294002 e U0126, ambos significativamente suprimida EMT e CSC fenótipo, indicando que AKT e ERK1 /2 vias são necessárias para miR-21 mediando EMT e CSC fenótipo.

conclusões /Significado

Em conclusão, nossos resultados demonstraram que o antagonismo de miR-21 inverte EMT e CSC fenótipo através da segmentação PTEN, através de inativação de AKT e ERK1 /2 vias, e mostrou um novo mecanismo de que pode aliviar a comportamentos biológicos malignas do cancro da mama

Citation:. Han M, Liu M, Wang Y, Chen X, Xu J, Sol Y, et al. (2012) Antagonismo de miR-21 inverte epitelial-mesenquimal Transição e Cancer Stem fenótipo celular através AKT /ERK1 /2 Inactivação por Segmentação PTEN. PLoS ONE 7 (6): e39520. doi: 10.1371 /journal.pone.0039520

editor: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital centro de pesquisa, Arábia Saudita

Recebido: 26 Setembro, 2011; Aceito: 26 de maio de 2012; Publicação: 25 de junho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Han et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Science Foundation Natural da China (NSFC 81072147, 31171336 NSFC), a Fundação de Ciência Natural de Chongqing Science Tecnologia da Comissão, na China. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

epitelial-mesenquimal de transição (EMT) está associada com aumento da agressividade e metástase em carcinomas, incluindo o cancro da mama, uma vez que permite que as células para migrar e invadir questões que envolvem e escapar para a corrente sanguínea, no caminho para o estabelecimento de metástase. Uma vez que estas células metastáticas chegar ao seu destino, que podem ser submetidos a mesenchymal- transição epitelial (Met) para estabelecer os tumores secundários, o que resulta na propagação do cancro e tratamento de falha [1] – [3]. Ao nível molecular, as células submetidas a EMT para um fenótipo mais mesenquimais envolve a perda ou reduzido a expressão de marcadores epiteliais, tais como E-caderina, e o aumento da expressão de marcadores de mesenquimais, tais como N-caderina, vimentina, e alfa-SMA [2] , [4], [5]. Há estudos sugeriram que a EMT no cancro da mama está estreitamente ligada às células basais-like subgrupo câncer de mama fenótipo e tronco cancerosas (CSCs) [6] – [8].

CSCs são previstos para ser fatores críticos de a progressão do tumor, devido às características da CSC, incluindo a capacidade de auto-renovação, ilimitado potencial proliferativo e metástase potencial, o que sugere que a segmentação características CSC provavelmente eliminar CSCs que são as “sementes” de recorrência de tumores e metástases. Embora a hipótese de CSC sugere que tumores podem surgir a partir de células estaminais /progenitoras, estudos de muitos laboratórios demonstraram que EMT pode dotar células que possuem características CSC, bem como um fenótipo invasivo mais móveis [7] – [10]. Anteriormente estudos têm sido confirmado que o cancro da mama contém um CSC-compartimento [11] – [13], que pode ser enriquecida através da purificação de aldeído 1 (ALDH1) células -positivas desidrogenase [13] ou CD44

+ /CD24

– /baixas células [11] por triagem, e também por purificação de células sphereforming (mammospheres) a partir de células progenitoras [12]. Há estudos demonstraram que a EMT fenótipo é mais alto do CD44

+ /CD24

– /CSCs baixos de câncer de mama (7), e CSCs enriquecido a partir de tumores mamários e derrames pleurais de mama metastático marcadores expressas semelhantes a células que sofreram um EMT [7], [14]. Da mesma forma, os marcadores de EMT e CSC também são frequentemente associados com cancros da mama que têm uma propensão à metástase, como subgrupo basal-like de câncer de mama fenótipo [15] e metaplásicas [16] cânceres de mama.

Os microRNAs (miRNAs) são uma família de moléculas pequenas não-codificantes de ARN que regulam a expressão do gene por emparelhamento de bases com a extremidade 3 ‘UTR do mRNA-alvo. Recentemente, uma série de miARNs têm sido mostrados para desempenhar papéis críticos na progressão e metástase de tumor maligno humano [17], [18], incluindo o cancro da mama. MiR-21 é um dos primeiros miARNs detectados no genoma humano, o que também é um dos conhecidos miARNs ser regulada para cima em todos os tipos de tumores malignos humanos [19]. Estudos recentes indicaram que vários supressores tumorais, incluindo fosfatase e homólogo tensina suprimida no cromossoma dez (PTEN) [20], do tumor gene supressor de tropomiosina 1 (TPM1) [21], a morte celular programada 4 (PDCD4) [22], maspina [23] e inibidores de metaloproteinases de matriz e RECK TIMP3 [24] foram alvos de miR-21, sugerindo que o miR-21 é um importante miARN oncogénicas que está intimamente relacionado com o crescimento de tumores e metástases.

Há estudos que demonstraram que o miR -21 é um componente importante do circuito de sinalização celular que regula o programa EMT [25] – [27], bem como as assinaturas associadas com CSC [26], [28], sugerindo que o miR-21 desempenha um papel-chave na processo de aquisição de EMT e características CSC, o que consistente com o nosso estudo anteriormente [29], mas os mecanismos subjacentes permanecem obscuros.

estudos recentes têm demonstrado que a proliferação celular miR-21 aumenta tumor, migração e invasão através segmentação de PTEN [20], um gene supressor de tumor que é um antagonista de phosphatidylinotidol 3-quinase (PI3K), removendo o fosfato de 3′-UTR de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3). Mas a função de PTEN em miR-21 induzindo EMT e CSC fenótipo continua por ser elucidado. É bem sabido que PTEN regula negativamente a PI3K-proteína-cinase B (AKT) via [30] e proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK) /sinal extracelular regulado kinase1 /2 (/2 ERK1) via de [31], bem como tanto AKT e ERK1 /2 vias eram considerados relevantes para a manutenção das características de EMT e CSC [32] – [36]

Estes resultados sugerem fortemente que o miR-21 poder por meio de AKT e ERK1 /2 vias. alvejando PTEN regular EMT e CSC fenótipo. No presente estudo, revelaram que o antagonismo de EMT miR-21reversed consistente com CSC fenótipo via AKT e ERK1 /2 vias, visando PTEN, indica um caminho molecular que poderia aliviar os comportamentos biológicos malignas do câncer de mama.

Resultados

transfectadas HSA-miR-21 antagomir diminuição da expressão de miR-21 em células MDA-MB-231

Para explorar se HSA-miR-21 antagomir pode diminuir a expressão do miR -21, HSA-miR-21 antagomir ou o seu controlo negativo foi transfectado em células MDA-MB-231 durante 48 h, em seguida, a expressão relativa de miR-21 foi medido pelo tempo real de RT-PCR. A expressão relativa de miR-21 foi 0,10711 ± 0,01272 no MDA-MB-231 /anti-miR-21 células, o que foi significativamente regulada para baixo, como comparar a 1,07862 ± 0,09722 em grupos de controlo negativo (p = 0,0015; A Fig. 1A ). Os resultados sugeriram que a HSA-miR-21 antagomir poderia diminuir a expressão de miR-21 em células MDA-MB-231.

MDA-MB-231 foram transfectadas com HSA-miR-21 antagomir ou hsa- miR-21 antagomir controlo, a uma concentração final de 50 nmol durante 48 h. (A) células MDA-MB-231 foram tratadas com HSA-miR-21 antagomir diminuiu a expressão de miR-21, em comparação com grupos de controlo (N1 = N2 = 3; p = 0,0015), por em tempo real de RT-PCR análise. (BE) Os níveis de ARNm de biomarcadores mesenquimais (N-caderina a vimentina e alfa-SMA) e biomarcadores epitelial (E-caderina) em MDA-MB-231 /anti miR-21-células e MDA-MB-231 /controle , tal como medido por análise em tempo real de RT-PCR. As reacções de RT-PCR em tempo real foram efectuadas num volume de reacção de 20 ul, em triplicado, em simultâneo. (F, G) Os níveis de proteína relativas dos marcadores EMT em células indicadas foram mostrados por análise de transferência de Western, e as bandas foram semi-quantificados usando software ImageJ. Beta-actina foi utilizado como controlo de carga. (H, I) As propriedades migratórias e invasivos de células indicadas foram testadas em migração e ensaio de invasão em inserções Transwell. penetrado células foram contadas e analisadas no histograma. Os dados representam pelo menos três experiências efectuadas em triplicado. (* Indica p 0,05;

★ indica p 0,001).

O antagonismo da EMT miR-21 invertido, bem como a diminuição da migração e invasão em MDA-MB-231

Para investigar os efeitos de antagonismo forçada de miR-21 no processo de TEM de MDA MB-231, o ARNm e proteína de expressão relativa de biomarcadores de células mesenquimais fenótipo (N-caderina, vimentina, e alfa-SMA) , e biomarcador fenótipo da célula epitelial (e-caderina) em MDA-MB-231 /anti-miR-21 e células de controlo correspondentes foram medidos. Antagonismo de miR-21 diminuiu os níveis de ARNm relativos de N-caderina, vimentina, e alfa-SMA (p = 0,0038, p = 0,0018 e p = 0,0023, respectivamente; a Fig. 1B, C, D), enquanto o aumento da relativa nível de ARNm de caderina-E (p = 0,0017; Fig. 1E) em-MB-231 MDA /células-miR-21 anti, em comparação com células de controlo, correspondente, por análise em tempo real de RT-PCR. Os resultados sugerem que o antagonismo de miR-21 pode diminuir a expressão do mRNA de biomarcadores de células mesenquimais fenótipo, enquanto que o aumento da expressão do mRNA de biomarcador fenótipo celular epitelial. Os resultados da análise de transferência de Western demonstrou que os níveis de proteína relativas de N-caderina, vimentina, e alfa-SMA foi regulada negativamente de forma significativa (p = 0,0003, p = 0,0026 e p = 0,04, respectivamente; a Fig. 1F, L) , enquanto que a de E-caderina foi regulada de forma significativa (p = 0,0053; Fig. 1F, L) no-MB-231 MDA /células anti-miR-21, em comparação com células de controlo. Os resultados sugerem que o antagonismo de miR-21 poderia diminuir a expressão da proteína de fenótipo mesenquimal biomarcadores de células, enquanto que o aumento de biomarcador fenótipo celular epitelial. Estes resultados demonstraram claramente que o antagonismo de miR-21 poderia reverter a EMT, contando com inibição EMT biomarcadores fenotípicas. Funcionalmente, o migrado relativa e invadido o número de células de /anti-miR-21 células MDA-MB-231 foram significativamente inferiores aos de controlo negativo (p 0,0001, p 0,0001, respectivamente; a Fig. 1H, I), sugeriu que o antagonismo de miR-21 pode reduzir a migração celular e invasão em células MDA-MB-231, que salientou ainda a função de miR-21 na invasão e metástase de células de cancro da mama.

antagonismo de miR-21 invertida CSC Fenótipo em MDA-MB-231

Para examinar os efeitos do antagonismo de miR-21 no CSC fenótipo em células MDA-MB-231, a proporção de células com ALDH1

+ (ALDH

brilhante ) e CD44

+ /CD24

– /baixo em MDA-MB-231 /anti-miR-21 e células de controlo negativo foram medidos. A percentagem de células com ALDH1

+ no MDA-MB-231 /células anti-miR-21 foi de 0,85

±

0,092, significativamente menos do que 2,323 ± 0,315 em grupos de controlo negativo (p = 0,0051; Fig . 2A, B), por ensaio de ALDEFLUOR; a percentagem de células com CD44

+ /CD24

– /baixa em MDA-MB-231 /anti-miR-21cells foi 0,543 ± 0,129, também significativamente menor do que 4,807 ± 1,062 no grupo controle (p = 0,0094; A Fig. 2C e D), por análise FACS. Estes resultados sugerem que o antagonismo de miR-21 poderia diminuir o cancro da mama CSC proporção, que expressam CSC biomarcadores superfície ALDH1

+ e CD44

+ /CD24

– /baixa. Além disso, a expressão de ARNm e proteína relativa de ALDH1 e CD44 em células MDA-MB-231 /anti-miR-21 e células de controlo foram também medidos. Os níveis de ARNm relativos de ALDH1 e CD44 em MDA-MB-231 /anti-miR-21 foram significativamente diminuídos em comparação com os grupos de controlo (p = 0,0039, p = 0,0034, respectivamente; a Fig. 2E, F), tal como avaliado pela análise em tempo real de RT-PCR, o que sugeriu que o antagonismo de miR-21 pode diminuir a expressão do mRNA de ALDH1 e CD44. A expressão da proteína de ALDH1 e CD44 foram também diminuiu em conformidade (P = 0,0002, P = 0,0005, respectivamente; a Fig. 2G; H), por análise de transferência de Western, sugerido que o antagonismo de miR-21 poderia diminuir a expressão da proteína de ALDH1 e CD44 . Estes resultados indicaram que o antagonismo de miR-21 poderia reverter CSC fenótipo em células MDA-MB-231, o que sugere ainda que o miR-21 poderia envolver na regulação de características CSC. Mais interessante, o número mammosphere em MDA-MB-231 /anti-miR-21 células foi significativamente inferior a controlar os grupos (p = 0,0017; Fig. 2I, J), indicaram que o antagonismo de miR-21 poderia diminuir a formação de mammospheres, que sugeriu ainda que miR-21 poderia regular características CSC, incluindo as capacidades de auto-renovação e clonogenicidade.

(a, B) atividade enzimática ALDH1 (ALDH

brilhante) no cancro da mama estabelecida MDA-MB -231 /anti-miR-21 e células MDA-MB-231 /controlo (N1 = N2 = 3) foram detectadas utilizando o ensaio ALDEFLUOR. (C, D) O CD44

+ /CD24

– /baixa fenótipo em células indicadas (n1 = n2 = 3) foram detectados por análise de FACS. (E, F) Os níveis de ARNm relativos de ALDH1 e CD44 foram detectados por ensaio de RT-PCR em tempo real. (G, H) Os níveis relativos de proteína ALDH1 e CD44 foram detectados por análise de Western blot. Beta-actina foi utilizado como controlo de carga. (I, J) O número de mammospheres de 1.000 MDA-MB-231 /células-miR-21 ou anti células /de controlo MDA-MB-231 foi contado ao microscópio. Todos os dados representam, pelo menos, três experiências efectuadas em triplicado. (* Indica p 0,05;

★ indica p 0,001).

O antagonismo de miR-21 Induzida por sobre-expressão de PTEN

Estudos recentes têm demonstrado que miR- 21 aumento da proliferação celular, migração e invasão de tumor por meio de modulação do gene supressor de PTEN [20], mas o papel de PTEN em miR-21 regula EMT tumor e CSC fenótipo continua por ser elucidado. Para explorar se o antagonismo de miR-21 regulam a expressão de PTEN, a níveis de proteína de PTEN e ARNm foram medidos, por análise em tempo real de RT-PCR e análise de Western blot, respectivamente. Como esperado, tanto o ARNm e a expressão da proteína de PTEN em MDA-MB-231 /células anti-miR-21 eram fortemente sobre-regulada, em comparação com grupos de controlo (p = 0,003, p = 0,0437, respectivamente; a Fig. 3A, B, D). Estes resultados demonstraram que o antagonismo de miR-21 pode regular positivamente a expressão de PTEN.

(A) A expressão ectópica de ARNm de PTEN em MDA-MB-231 /anti-miR-21 e células MDA-MB- 231 células /controlo foram verificados pelo ensaio em tempo real de RT-PCR (p = 0,003). (B, C, D) Os níveis de proteína de PTEN, p-AKT, AKT, P-ERK1 /2, e ERK1 /2 em células indicadas foram detectadas por análise de transferência de Western, e as bandas foram semi-quantificados usando software ImageJ. GAPDH foi usada como controlo de carga. (* Indica P 0,05)

Antagonismo de miR-21 inactivada AKT e ERK1 /2

AKT e ERK1 /2 são duas grandes vias de sinalização na regulação da proliferação celular, migração. e sobrevivência, como também ambos eram regulados por PTEN, mas os papéis de AKT e ERK1 /2 em vias de miR-21 regulam EMT tumor e CSC fenótipo continua por ser elucidado. Para determinar as moléculas de sinalização que são envolvendo em antagonismo de miR-21 invertendo EMT e CSC fenótipo, os níveis de proteína de AKT fosforilado (p-AKT) e AKT, ERK1 /2 (P-ERK1 /2) e ERK1 /2 eram medido por análise de Western blot. células-miR-21 anti Os níveis de proteína de p-AKT e p-ERK1 /2 em MDA-MB-231 /foram fortemente diminuída em comparação com grupos de controle (p = 0,0173, p = 0,0126, respectivamente; Fig 3C, D. ), confirmou que o antagonismo de miR-21 poderia suprimir a AKT e ERK1 /2 ativação no processo de reversão EMT e CSC fenótipo.

Re-expressão de miR-21 induzida EMT e CSC fenótipo, Acompanhado de Down-expressão de PTEN, bem como a activação de AKT e ERK1 /2

Para confirmar adicionalmente o papel de miR-21 na regulação do tumor EMT e CSC fenótipo, HSA-miR-21 imita ou imita de controlo negativo foi transfectado em estabelecida MDA-MB-231 /células anti-miR-21. A expressão de miR-21 aumentou para mais de 22 vezes após HSA-miR-21 imita tratados, em comparação com o controlo negativo (p = 0,0037; Fig. 4A), indicaram que a HSA-miR-21 imita a transfecção podia aumentar a expressão relativa de miR-21.

/células Estabelecida MDA-MB-231 anti-miR-21 foram transfectadas com HSA-miR-21 imita a uma concentração de 40 nmol durante 72 h. (A) MDA-MB-231 /anti-miR-21 as células foram tratadas com HSA-miR-21 imita elevados da expressão de miR-21, em comparação com grupos de controlo (N1 = N2 = 3; p = 0,00373), por análise em tempo real de RT-PCR. níveis (BF) de proteína de marcadores mesenquimais (N-caderina, vimentina e alfa-SMA) (B), marcador epitelial (caderina-E) (B), marcadores de CSC (ALDH1 e CD44) (C), PTEN (D), p-AKT e AKT (e), bem como P-ERK1 /2 e ERK1 /2 (e) em células indicadas foram medidos por análise de transferência de Western, e as bandas foram semi-quantificados usando software ImageJ (F). Beta-actina ou GAPDH foi usada como controlo de carga. (* Indica p 0,05;

★ indica p 0,001).

Para examinar se forçado a re-expressão de miR-21 pode induzir a EMT e CSC fenótipo, para baixo-regulam a expressão de PTEN , bem como activar AKT e ERK1 /2 vias, a expressão da proteína de biomarcadores EMT (N-caderina, vimentina, alf a-SMA, e e-caderina), CSC marcadores (ALDH1 e CD44), PTEN, p-AKT, AKT , P-ERK1 /2, e ERK1 /2 foram medidos pelo ensaio de mancha de Western. Em comparação com os grupos de controlo negativo, forçado a re-expressão de miR-21 aumentou a expressão da proteína de N-caderina, vimentina, alf a-SMA, ALDH1 e CD44 (P = 0,0136, P = 0,0397, P = 0,0067, P = 0,0002 e p = 0,0006, respectivamente; a Fig. 4B, C, F), enquanto a diminuição da expressão de e-caderina (p = 0,0014; Fig. 4B, F), sugeriram que a re-expressão de miR-21 pode induzir EMT e CSC fenótipo em células MDA-MB-231 /anti-miR-21 estabelecidos. Enquanto isso, a re-expressão de miR-21 diminuiu a expressão de PTEN (p = 0,0081; Fig. 4D, F), demonstraram que a re-expressão de miR-21 poderá afectar a expressão de miR-21 alvo directo nas células. Além disso, a re-expressão de miR-21 também aumentou a expressão de p-AKT e P-ERK1 /2 em células (P = 0,0008, P = 0,0022, respectivamente; a Fig. 4E, F), indicaram que a re-expressão de miR-21 poderia activar AKT e ERK1 /2 vias. Estes resultados suportada que miR-21 poderia regular EMT e CSC fenótipo, e acompanhar com alterações de PTEN e AKT /ERK1 /2 vias.

miR-21 alvejado PTEN em reverter EMT e CSC Fenótipo

Para determinar se o esgotamento de PTEN pode bloquear o miR-21 antagomir invertendo EMT e CSC fenótipo, siPTEN ou o controlo SsiPTEN foi transfectado em células MDA-MB-231. Após 24 h, as células foram transfectadas com o miR-21 antagomir ou um controlo negativo, e, em seguida, EMT e CSC fenótipo foram examinadas como descrito acima. Descobrimos que siPTEN significativa regulada negativamente a expressão de PTEN (p = 0,002; A Fig. 5A, E), em relação aos grupos SsiPTEN. Consistente com os efeitos de miR-21 antagomir sobre EMT e CSC fenótipo em células MDA-MB-231 (Fig 1 e Fig. 2.), O antagonismo de EMT miR-21 também invertida (N-caderina, p = 0,0025; vimentina, p = 0,0025; alfa-SMA, p = 0,0003; e-caderina, p = 0,0308; Fig. 5B, e) e CSC fenótipo (ALDH1, p = 0,0014; CD44, p = 0,002; a Fig. 5C, e) no MDA células -MB-231 /SsiPTEN (

SsiPTEN + grupos de controlo negativo contra SsiPTEN + miR-21 grupos antagomir miRNA antagomir

); depleção de PTEN por siPTEN bloqueado miR-21-antagomir invertendo EMT (N-caderina, p = 0,0172; vimentina, p = 0,0113; alfa-SMA, p = 0,0015; E-caderina, p = 0,016; A Fig. 5B, E ) e CSC fenótipo (ALDH1, p = 0,0042; CD44, p = 0,0004; A Fig. 5C, e) (

SsiPTEN + miR-21 grupos antagomir vs. siPTEN + miR-21 grupos antagomir

). Estes resultados sugerem que a depleção de PTEN poderia bloquear o miR-21-antagomir -reversing EMT e CSC fenótipo, que ainda sugerido que o antagonismo de miR-21 poderia ter como alvo PTEN para inverter EMT e CSC fenótipo. Além disso, a depleção de PTEN activado miR-21-antagomir de bloqueio de AKT e ERK1 /2 vias (p-AKT, p 0,0001; P-ERK1 /2, p = 0,0037; Fig. 5D, E) (

SsiPTEN + miR-21 grupos antagomir vs. grupos siPTEN + miR-21 antagomir

), indicou que AKT e ERK1 /2 caminhos são caminhos a jusante de PTEN na regulação EMT e CSC fenótipo.

. As células MDA-MB-231 foram transfectadas com siPTEN ou o controlo scrambled SsiPTEN a uma concentração final de 50 nmol, durante 24 h. Em seguida, as células foram transfectadas com HSA-miR-21 antagomir ou um controlo negativo, a uma concentração final de 50 nmol, durante 72 h. As células foram tripsinizadas, e os níveis de proteína relativas de PTEN (A), os marcadores de EMT (B), marcadores de superfície CSC (C), P-AKT e AKT (D), bem como p-ERK e ERK (D) foram medidos e semi-quantificados (e) como indicado antes. As fichas representativas de tratamentos de SsiPTEN além de miR-21 Controle antagomir, SsiPTEN além de miR-21 antagomir e siPTEN além de miR-21 antagomir foram mostrados na imagem. Beta-actina ou GAPDH foi usada como controlo de carga. (* Indica p 0,05;

★ indica p 0,001).

miR-21 EMT Regulado e CSC Fenótipo, bem como a proliferação celular através de AKT e ERK1 /2 Acesso

Para investigar ainda mais os papéis de AKT e ERK1 /2 vias em miR-21 regula EMT e CSC fenótipo, a MDA-MB-231 /anti miR-21 as células foram transfectadas com o miR-21 imita a uma concentração de 40 nmol durante 72 h, e depois as células foram tratadas com LY294002 (o inibidor de PI3K-AKT) a 20 umol /l ou U0126 (o inibidor de ERK1 /2) a 10 nmol /L durante 24 h. Confirmou-se que o tratamento LY294002 bloqueados re-expressão de miR-21 induzir a activação AKT (p 0,0001; Fig. 6A, E), enquanto que o tratamento U0126 abolida re-expressão de miR-21 induzindo 2 activação de ERK1 /(p 0,0001; Fig . 6A, E). Mais interessante, re-expressão de miR-21 induzindo EMT e CSC fenótipo foram inibidas por LY294002 (N-caderina, p = 0,0005; vimentina, p = 0,0005; alfa-SMA, p = 0,0008; E-caderina, p = 0,0002; ALDH1, p 0,0001; CD44, p 0,0001; Fig. 6B, C, e) ou U0126 (N-caderina, p 0,0001; vimentina, p = 0,0005; alfa-SMA, p = 0,0004; e-caderina, p = 0,0003; ALDH1, p 0,0001; CD44, p = 0,0005; Fig. 6B, C, e) nas células, indicaram que tanto AKT e ERK1 /2 vias estão exigindo para miR-21 na indução de EMT e CSC fenótipo, que ainda sugerido que a AKT e ERK1 /2 vias são duas vias a jusante paralelas de miR-21 para regular a EMT e CSC fenótipo. Além disso, tanto LY294002 e U0126 não têm efeito comprovado no PTEN (p = 0,1208, p = 0,4361, respectivamente; A Fig. 6D, E)., Que também apoiou que AKT e ERK1 /2 caminhos são caminhos a jusante de PTEN

Established células MDA-MB-231 /anti-miR-21 foram transfectadas com HSA-miR-21 imita a uma concentração de 40 nmol durante 72 h. Em seguida, as células foram tripsinizadas, e tratou-se com LY294002 (20 umol /L) ou U0126 (10 umol /L) durante 24 h. (AE) Os níveis de proteína relativas de p-AKT e AKT (A), p-ERK e ERK (A), os marcadores de EMT (B), marcadores de superfície CSC (C), bem como de PTEN (D) a partir dos de controlo em branco, LY294002, e U0126 grupos de tratamento foram mostrados, e semi-quantificados (e) como indicado antes. Beta-actina ou GAPDH foi usada como controlo de carga. (* Indica P 0,05;

★ indica P 0,001;

▴ indica p 0,05). . (F) Os efeitos do antagonismo de miR-21, re-expressão de miR-21, LY294002, e U0126 sobre a proliferação celular por contagem de células (A

vs

B, p = 0,0077; B + C

vs

B + D, p = 0,0091;. B + D

vs

B + D + E, p = 0,0109;.. B + D

vs

B + D + F, p = 0,0031).

Além disso, para verificar as funções de AKT e ERK1 /2 em vias de miR-21 que regula a proliferação celular nas células que mencionados acima, os números de crescimento de células do As células foram calculados a 0, 12, 24, 36, 48, 60 e 72 horas após os tratamentos por contagem de células. Verificou-se que o antagonismo forçada de miR-21 diminuiu a proliferação celular em células MDA-MB-231 (p = 0,0077; Fig. 6F), enquanto a re-expressão de proliferação de células elevada miR-21 em células MDA-MB-231 /anti-miR -21 células, durante 0-72 h (p = 0,0091; Fig. 6F). Os resultados sugeriram que o miR-21 pode regular a propagação de células de um determinado grau em células MDA-MB-231. Enquanto isso a proliferação celular, tanto AKT e ERK1 /2 inibições foram diminuídos (P = 0,0109, P = 0,0031, respectivamente; a Fig. 6F)., o que sugere que a regulação da AKT ou de ERK1 /2 ligada a alterações na proliferação de células

Discussão

Os miRNAs são pequenos RNAs não codificante que podem actuar como oncogenes ou genes supressores de tumor [37], [38]. Evidências crescentes mostrou que o miR-21 sobre-expressão é detectada em vários tipos de cancros humanos, incluindo o cancro da mama, e está associada com EMT [25] – [27] e as características CSC [26], [28]. Mas os papéis directos e mecanismos moleculares centrais de miR-21 na regulação EMT cancro da mama e CSC fenótipo continua por ser elucidado. Neste estudo, verificou-se que o antagonismo de miR-21 em células MDA-MB-231 e invertido EMT CSC fenótipo, sobre-regulada a expressão de PTEN, bem como AKT inactivado e ERK1 /2 vias. Os resultados demonstraram que o antagonismo de miR-21 é suficiente para reverter EMT e CSC fenótipo através da modulação da expressão de PTEN e AKT /ERK1 /2 vias, proporcionando alguma evidência directa e mecanismos moleculares que o miR-21 é capaz de regular EMT e CSC fenótipo .

para investigar o papel de miR-21 na regulação e EMT CSC fenótipo de células de cancro da mama, antagomir de miR-21, que se podem ligar especificamente a e inibem endógenos miR-21, moléculas ou seu oligómero controlo negativo , foi transfectado em células MDA-MB-231. O antagomir diminuição de 90% da expressão endógena de miR-21 nas células (Fig. 1A). Curiosamente, o EMT relativa e CSC fenótipo foram revertidas por antagonismo de miR-21 (Figura 1B-L;. A Fig. 2A-J), o que consistente com o miR-21 envolve na promoção EMT e (ou) fenótipo CSC em células de cancro do pâncreas [26], [28], células de carcinoma da tiróide [27], e a estudar anteriormente em células MCF-7 [29]. Acompanhado com os resultados, o antagonismo de miR-21 aumentou significativamente a expressão de PTEN (Fig. 3A, B, D), bem como a diminuição AKT e ERK1 2 activação /(Fig. 3C e D). Estes resultados demonstraram que o miR-21 desempenha um papel importante na mediação de EMT e CSC fenótipo, acompanhar através da regulação da expressão de PTEN, bem como AKT e ERK1 2 activação /.

Em seguida, explorámos os mecanismos subjacentes e moléculas de sinalização relativas no antagonismo de miR-21 invertendo EMT e CSC fenótipo. Em consistente com que o miR-21 suprime a função de expressão supressor de tumor PTEN por ligação sua 3′-UTR [20], que provou que o antagonismo de miR-21-regulado a expressão de PTEN (Fig. 3A, B, D). Como esperado, PTEN down-expressão nomeadamente bloqueada EMT e CSC fenótipo miR-21-inversão (Fig. 5B, C, E), confirmou que o antagonismo de miR-21 exibe o seu papel, em parte, através da promoção da expressão de PTEN, ea recuperação de expressão de PTEN iria reduzir a sua função supressora de tumores de.

Além disso, também descobrimos que a re-expressão de miR-21 por miR-21 imita levou à activação de AKT e ERK1 /2 vias (Fig. 4E, F) . Mais interessante, tratou-se as células com PI3K-AKT ou 2 ERK1 /inibidor (LY294002 ou U0126), proibida miR-21 imita recuperando EMT e CSC fenótipo (Fig. 6B, C, E). Os resultados sugerem que os efeitos de AKT e (ou) de ERK1 /2 em miR-21-regulação EMT e CSC fenótipo, em conformidade com o que a AKT e (ou) ERK1 /2 vias são necessários para promover EMT e (ou) CSC fenótipo no cancro da mama células [32], células epiteliais mamárias [33], [34], células de cancro do cólon [35], as células cancerosas cervicais [32] e células carcinomas ovarianos 7 MCF-[36].

em resumo, os nossos resultados demonstraram que o antagonismo de miR-21 inverte EMT e CSC fenótipo através AKT e ERK1 /2 vias inactivação pela indução da expressão de PTEN em células MDA-MB-231 (Fig. 7). Este estudo mostrou um papel direto e novo mecanismo de miR-21 em inversing EMT e CSC fenótipo, ea informação pode ser útil para desenvolver uma nova terapia para o tratamento de câncer de mama no futuro.

O antagonismo de miR- 21 poderia inativar AKT e ERK1 /2 vias presumivelmente através PTEN-regulação, e, finalmente, EMT e CSC fenótipo reversa em células MDA-MB-231.

Materiais e Métodos

Reagentes e anticorpos

humana tem-miR-21 (MIMAT0000076) antagomir e controle negativo, imita e controle negativo foram adquiridos de Ribobio (Guangzhou, China). Os iniciadores de PCR foram sintetizados por Sangon Biotech (Xangai, China). tempo real kits de ensaio de RT-PCR foram comprados a partir de Takara (Dalian, China). siPTEN sequência duplex e controle de corrida siRNA específico (SsiPTEN) foram adquiridos de Ribobio. LY294002 e U0126 foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO, EUA). Lipofectamine ™ 2000 foi adquirido a Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Kit ALDEFLUOR® foi comprado de Aldagen (Durham, NC, EUA). isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com anti-CD44 e anticorpo ficoeritrina (PE) marcado com anticorpo anti-CD24 foram adquiridos a BioLegend (San Diego, CA, EUA). Os anticorpos primários, incluindo anticorpos E-caderina antihuman coelho (Não: BS1098; Bioworlde, St. Louis, MO, EUA), anticorpo N-caderina (Não: BS2224; Bioworlde), anticorpos vimentina (Não: BS1776; Bioworlde), alfa-SMA anticorpo (Não: ab5694; Abcam, Cambridge, UK), anticorpo ALDH1 (Não: ab51028; Abcam), anticorpo CD44 (Não: BA0321; Boster, Wuhan, China), anticorpo PTEN (Não: BS1304; Bioworlde), anticorpo AKT (