Abstract
Fundo
A sobrevida média é de 10 meses e 2 anos de sobrevida é de 20 % no cancro do pulmão de células não-pequenas metastático (NSCLC) tratados com quimioterapia à base de platina. Uma pequena fração dos cancros do pulmão de células não-escamosas abrigar mutações EGFR, com melhor resultado para gefitinib e erlotinib. A evidência experimental sugere que a sobre-expressão de BRCA1 aumenta a sensibilidade para o docetaxel e a resistência à cisplatina. RAP80 e Abraxas estão interagindo proteínas que formam complexos com BRCA1 e pode modular o efeito de BRCA1. A fim de examinar ainda mais o efeito de mutações EGFR e níveis de mRNA BRCA1 sobre a evolução das NSCLC avançado, foi realizado um ensaio clínico prospectivo fase não-randomizado II, testando a hipótese de que a terapia personalizado conferiria melhor evolução sobre a terapia não-personalizado. Em uma análise exploratória, que também analisou o efeito de níveis RAP80 e mRNA Abraxas.
Metodologia /Principais Achados
Nós tratados 123 pacientes com carcinoma metastático do pulmão de células não-escamosas usando uma abordagem personalizada. ARN e ADN foram isolados a partir de amostras microdissecadas a partir de tecido de tumor embebido em parafina. Os pacientes com mutações EGFR recebeu erlotinib, e aqueles sem mutações EGFR receberam quimioterapia com ou sem cisplatina com base em seus níveis de mRNA BRCA1: baixo, cisplatina e gemcitabina; intermediário, cisplatina e docetaxel; alta, docetaxel. Uma análise exploratória examinou expressão RAP80 e Abraxas. A sobrevida média ultrapassou 28 meses para 12 pacientes com mutações EGFR, e foi de 11 meses para 38 pacientes com baixa BRCA1, 9 meses para 40 pacientes com BRCA1 intermediária, e 11 meses para 33 pacientes com alta BRCA1. Dois anos de sobrevida foi de 73,3%, 41,2%, 15,6% e 0%, respectivamente. A sobrevivência média foi influenciado pela expressão RAP80 nos três grupos de BRCA1. Por exemplo, para pacientes com de baixo BRCA1 e baixa RAP80, sobrevida média excedeu 26 meses. RAP80 foi um fator significativo para a sobrevivência em pacientes tratados de acordo com os níveis de BRCA1 (taxa de risco, [IC 95%, 1-1,7] 1,3; P = 0,05).
Conclusões /Significado
A quimioterapia personalizado de acordo com os níveis de expressão BRCA1 está associada a excelente mediana e 2 anos de sobrevivência para alguns subgrupos de pacientes com NSCLC e RAP80 poderia desempenhar um efeito modulador crucial sobre esse modelo de quimioterapia personalizada.
Registro de Estudos
ClinicalTrials.gov NCT00883480
Citation: Rosell R, Perez-Roca L, Sanchez JJ, Cobo M, Moran T, Chaib I, et al. (2009) Tratamento personalizado em Non-Small-Cell Lung Cancer Based on EGFR mutações e mRNA BRCA1 Expression. PLoS ONE 4 (5): e5133. doi: 10.1371 /journal.pone.0005133
editor: Mikhail V. Blagosklonny, Instituto de Pesquisa Ordway, Estados Unidos da América
Recebido: 01 de dezembro de 2008; Aceitou: 3 de março de 2009; Publicado em: 05 de maio de 2009
Direitos de autor: © 2009 Rosell et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo recebeu o apoio parcial de Redes de Câncer, Espanha (RD06 concessão /0020/0056). A fonte de financiamento não estava envolvido na recolha, análise ou interpretação dos dados, a escrita do relatório, ou a decisão de enviar para publicação
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.
Introdução
A média de sobrevivência de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas avançado ou metastático (NSCLC) é de apenas 10-11 meses, quer com quimioterapia à base de cisplatina padrão [1], [ ,,,0],2] ou quimioterapia baseada em cisplatina personalizada com base no reparo por excisão de cross-complementando uma expressão de mRNA (ERCC1), [3] e a taxa de sobrevivência de dois anos é de apenas 14-21%. [1], [2], [3]
Os dois proto-oncogenes conhecidos actualmente a ser mais comummente mutado no adenocarcinoma de pulmão são K-ras e EGFR [4]. Os cancros do pulmão causadas por mutações de activação do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) – principalmente quer deleção no exon 19 ou mutação L858R no exão 21 – responde aos inibidores de tirosina-quinase de moléculas pequenas (gefitinib e erlotinib), [5], [6], [7] com uma sobrevida média informou recentemente a gefitinib de 17,5 meses. [8] a taxa de resposta foi de 90% em nosso estudo retrospectivo mutações examinar EGFR em pacientes tratados com gefitinib, [9] e dados agrupados de estudos prospectivos de gefitinib em doentes com mutações EGFR mostrou uma taxa de resposta de 80%. [10] no entanto, não houve mutações EGFR foram encontrados em 454 pacientes com carcinoma de células escamosas do pulmão. [11]
um crescente corpo de evidências indica que o cancro da mama gene de susceptibilidade 1 (BRCA1) confere sensibilidade a apoptose induzida por drogas antimicrotúbulos (paclitaxel e vincristina), mas induz a resistência a agentes que danificam o ADN (cisplatina e etoposido) e radioterapia. [12], [13], [14], [15] estes resultados pré-clínicos são suportados por uma variedade de modelos experimentais de mama e células de cancro do ovário: expressão indutível de BRCA1 sensibilidade melhorada de paclitaxel; [16] uma inactivação mediada por ARN de interferência curto de BRCA1 endógenos levou a paclitaxel e docetaxel resistência; [17 ], [18], [19] e reconstituição de células BRCA1 deficiente com o tipo selvagem de BRCA1 sensibilidade melhorada ao paclitaxel e vinorelbina. [17] Este diferencial efeito da expressão de ARNm de BRCA1 modular também foi observada em células tumorais isoladas de efusões malignas NSCLC e doentes com cancro gástrico, onde os níveis de ARNm de BRCA1 negativamente correlacionados com sensibilidade a cisplatina e positivamente com sensibilidade docetaxel [20] Dois estudos retrospectivos -. em NSCLC [21] e do ovário [19] pacientes – descobriram que os níveis baixos ou intermediários de ARNm de BRCA1 correlaciona com uma sobrevivência significativamente maior após a quimioterapia à base de platina, [19], [21] enquanto a sobrevida em pacientes com maior expressão BRCA1 aumentou após quimioterapia baseada em taxano. [19]
BRCA1 é recrutado para os sites de DNA breaks, jogando um papel central no reparo do DNA e no controle checkpoint do ciclo celular. A ligação do mediador de DNA danos checkpoint uma proteína (MDC1) para a cauda fosforilada de H2AX histona facilita a formação de focos nuclear BRCA1 em quebras da cadeia dupla. [22] A proteína associada ao receptor 80 (RAP80) actua a montante de BRCA1 e é necessário para a acumulação de BRCA1 para os locais de quebras de ADN. [23], [24], [25] Abraxas recruta RAP80 para formar um complexo com BRCA1. Ambos Abraxas e RAP80 são necessários para a reparação de danos de DNA e células esgotado de Abraxas ou RAP80 hipersensibilidade exposição à irradiação. [23]
A fim de examinar se a personalização de tratamento pode melhorar os resultados em pacientes com NSCLC avançado, temos realizado uma fase não-randomizado II estudo prospectivo do tratamento personalizado com base no estado da mutação EGFR e os níveis de expressão de mRNA BRCA1. Optou-se por limitar a inscrição para carcinoma de células não-escamosas, a fim de maximizar a oportunidade de administrar erlotinib em pacientes com mutações de EGFR. Pacientes com qualquer um de eliminação do exão 19 ou erlotinib a mutação L858R recebido, enquanto que aqueles com EGFR de tipo selvagem tratados com quimioterapia com base nos níveis de BRCA1: aqueles com níveis baixos receberam cisplatina mais gemcitabina; aqueles com níveis intermediários receberam cisplatina e docetaxel; e aqueles com níveis elevados receberam docetaxel sozinho. Em uma análise exploratória, que também analisou o efeito de níveis RAP80 e mRNA Abraxas nestes pacientes.
Resultados
Os pacientes
Entre março de 2005 e julho de 2007, um total de 123 pacientes de 25 centros foram incluídos no estudo (Figura 1). Trinta e cinco pacientes foram excluídos: 3 pacientes não tinham células tumorais na biópsia; 5 pacientes tinham menos de 50 células tumorais na biópsia, o que torna impossível garantir resultados correctos; 19 pacientes eram do tipo selvagem EGFR mas com amostra de tumor insuficiente após avaliação EGFR para análise de expressão BRCA1; 2 pacientes recusaram-se a participar; e 6 pacientes foram retirados pelo seu médico devido a fatores clínicos não relacionados com o estudo. Para todos os 123 pacientes, e o isolamento de ARN a amplificação por PCR foram bem sucedidas. Em média, os resultados de análises genéticas estavam disponíveis em 8 dias (variação de 6-11 dias). O número médio de ciclos de quimioterapia administradas nos grupos de BRCA1 foi de 5 (intervalo, 1,8). Acompanhamento médio foi de 8 meses (variação de 1-28 meses). Doze pacientes tinham mutações EGFR e foram designados para receber erlotinib (grupo EGFR). Dos 111 pacientes com EGFR de tipo selvagem, 38 estavam no menor tercil de expressão BRCA1 e foram designados para receber cisplatina e gemcitabina (baixo grupo BRCA1), 40 estavam no tercil intermediário e foram designados para receber cisplatina e docetaxel (BRCA1 intermediária grupo), e 33 foram no mais alto tercil e foram designados para receber docetaxel isoladamente (grupo de alto BRCA1) (Figura 1)
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Entre março de 2005 e julho de 2007, um total de 123 pacientes de 25 centros foram inscritos no estudo. Razões para o abandono do paciente: 3 pacientes não tinham células tumorais na biópsia; 5 pacientes tinham menos de 50 células tumorais na biópsia, o que torna impossível garantir resultados correctos; 19 pacientes eram do tipo selvagem EGFR mas com amostra de tumor insuficiente após avaliação EGFR para análise de expressão BRCA1; 2 pacientes recusaram-se a participar; e 6 pacientes foram retirados pelo seu médico devido a fatores clínicos não relacionados com o estudo. Os dois pacientes no grupo que não o EGFR foram avaliados quanto à resposta morreram no prazo de um mês de entrar no estudo; os 13 pacientes no BRCA1 que não foram avaliados para resposta recebida . 3 ciclos de tratamento
As características clínicas dos quatro grupos estão apresentados na Tabela 1 e Tabela S1. A idade média para todos os pacientes foi de 60 anos. Proporcionalmente mais mulheres que homens estavam no menor tercil de expressão BRCA1. mutações EGFR foram mais frequentemente observadas em que nunca fumaram (p = 0,03) e mulheres (p = 0,0001). Cinquenta e cinco por cento dos doentes tinham uma performance status de 1, e 83% tinham doença IV palco. Dezassete por cento dos pacientes tinham metástases cerebrais. Os pacientes com mutações EGFR tiveram uma média de dois sítios metastáticos, em comparação a um local em pacientes com EGFR de tipo selvagem (Tabela S2).
A taxa de resposta global foi de 90% para o grupo EGFR, 25 % para o grupo de baixa BRCA1, 45,7% para o grupo BRCA1 intermédia, e 41,9% para o grupo BRCA1 elevada (Tabela 2). Na análise de intenção de tratar, a taxa de resposta foi de 75% para o grupo de EGFR, 21,1% para o grupo de baixa BRCA1, 40% para o grupo BRCA1 intermédia, e 39,4% para o grupo de alto BRCA1 (Tabela 2).
a sobrevida média não foi alcançada, mas ultrapassou 28 meses para o grupo de EGFR, em comparação com 10 meses (IC 95%, 8,5 a 15-5) para pacientes em todos os três grupos BRCA1. sobrevivência de dois anos para os pacientes no grupo de EGFR foi de 73,3% e para todos os pacientes nos grupos de BRCA1 foi de 26,7%. Para os pacientes no grupo de baixo BRCA1, a sobrevida mediana foi de 11 meses (IC 95%, 1,1-20,9) e 2 anos de sobrevivência foi de 41,2%. Para aqueles no grupo BRCA1 intermediária, a sobrevida mediana foi de 9 meses (IC 95%, 5,4-12,6) e 2 anos de sobrevida foi de 15,6%. Para pacientes no grupo de alta BRCA1, a sobrevida mediana foi de 11 meses (IC 95%, 8,2-13,8) e 2 anos de sobrevida foi de 0% (Tabela 2, Figura 2).
A sobrevida média foi não pegou 12 pacientes no grupo de EGFR, 11 meses para os 38 pacientes no grupo de baixa BRCA1, 9 meses para 40 doentes no grupo BRCA1 intermediário, e 11 meses para os 33 pacientes no grupo de alto BRCA1 (P = 0,01) (ver Tabela 2) .
o tempo médio de progressão foi de 13 meses (IC 95%, 7,7-18,3) no grupo de EGFR, comparado a 6 meses (95% CI, 4,7-7,2) para pacientes em todos os três BRCA1 grupos. Para pacientes nos grupos de baixo e intermediário BRCA1, tempo de progressão foi de 5 meses (95% CI, 2,7-7,3). Para pacientes no grupo de alta BRCA1, o tempo de progressão foi de 8 meses (IC 95%, 5,1 a 10,9) (Tabela 2, Figura S1).
transcrições RAP80 e Abraxas mRNA
Com base em os resultados de modelos experimentais [23], [24], [25], uma análise exploratória da relação entre BRCA1, RAP 80 e expressão de mRNA Abraxas foi realizada em 86 de 111 pacientes sem mutações EGFR para quem tecido tumoral suficiente estava disponível. As características dos pacientes para estes 86 doentes foram semelhantes aos de todos os 111 pacientes; significativamente mais mulheres que homens tiveram baixa expressão BRCA1 (P = 0,009). Resposta foi significativamente maior em pacientes com níveis BRCA1 intermediário e alto (p = 0,004). (Tabela S3). A estreita correlação foi encontrada entre BRCA1 e RAP 80 níveis (ρ = 0,27; P = 0,02) e entre RAP 80 e os níveis de Abraxas (ρ = 0,41; P 0,001), mas não entre BRCA1 e os níveis de Abraxas (ρ = 0,10; P = 0,39).
A sobrevida média foi influenciada pelos níveis de RAP 80. Nos pacientes com baixos níveis de BRCA1, sobrevivência média não foi alcançada em pacientes com baixos níveis de RAP 80, enquanto ele foi de 8 meses para pacientes com RAP intermédia 80 e 7 meses para aqueles com alta RAP 80 (Tabela 3, Figura 3). Em pacientes com níveis intermediários BRCA1, a sobrevida média foi de 5 meses em pacientes com baixos níveis de RAP 80, enquanto ele foi de 13 meses para os pacientes com RAP intermédia 80 níveis e 16 meses para aqueles com alta RAP 80 níveis. Em pacientes com níveis elevados de BRCA1, a sobrevida mediana foi de 6 meses em pacientes com baixa RAP 80 níveis, 12 meses em pacientes com níveis RAP80 intermediários, e 11 meses para aqueles com alta RAP 80 níveis (Tabela 3).
a sobrevida média não foi alcançada por 11 pacientes com baixa RAP 80 níveis, 8 meses, para 9 pacientes com RAP intermédia 80 níveis e 7 meses para 5 pacientes com alto RAP 80 níveis (p = 0,006).
nos pacientes com baixos níveis de BRCA1, tempo de progressão foi de 14 meses em pacientes com baixos níveis de RAP 80, enquanto ele foi de 4 meses para pacientes com níveis RAP80 intermediários e 6 meses para aqueles com altos níveis de RAP 80 (Tabela 4, Figura S2). Em pacientes com níveis intermediários BRCA1, tempo de progressão foi de 4 meses em pacientes com baixos níveis de RAP 80, enquanto ele foi de 9 meses para pacientes com RAP intermédia 80 níveis e 6 meses para aqueles com alta RAP 80 níveis. Em pacientes com níveis elevados de BRCA1, tempo de progressão foi de 2 meses em pacientes com baixa RAP 80 níveis, 10 meses em pacientes com RAP intermédia 80 níveis, e 4 meses para aqueles com alta RAP 80 níveis (Tabela 4).
resultados semelhantes foram obtidos quando a sobrevivência mediana e tempo de progressão foram comparados de acordo com os níveis de expressão de mRNA Abraxas (Tabelas S4 e S5). Uma análise exploratória multivariada nos 86 pacientes, com o uso de um modelo de riscos proporcionais de Cox, identificou performance status ECOG e RAP 80 variáveis como significativas para a sobrevivência (taxas de risco: performance status 1, 2,72; p = 0,005; RAP 80, 1.3 ; P = 0,05) (Tabela S6). A sobrevivência não foi influenciada por outras características clínicas, tipos de metástases, a quimioterapia de segunda linha (36 pacientes), ou níveis Abraxas. O modelo de Cox para o tempo de progressão também mostrou que apenas o estatuto de desempenho e RAP 80 foram variáveis significativas (Tabela S7).
Discussão
As mutações no domínio de tirosina-cinase EGFR induzir adenocarcinoma de pulmão em ratos [ ,,,0],26] e uma resposta favorável ao primeiro e gefitinib de segunda linha e erlotinib em NSCLC avançado. [7], [8] no presente estudo, a sobrevida mediana ultrapassou 28 meses em 12 pacientes com mutações EGFR tratados com erlotinib, com mediana tempo até à progressão de 13 meses e uma sobrevivência de 73,3% de dois anos; Estes resultados são semelhantes aos resultados de uma meta-análise de estudos prospectivos com gefitinib em doentes com mutações EGFR. [10] A sobrevida média foi de 11 meses em pacientes com o menor expressão BRCA1, tratados com cisplatina e gemcitabina e sobrevivência de dois anos foi de 41,2%, o que compara favoravelmente com a média de sobrevivência e de dois anos atingido com gemcitabina e cisplatina ou pemetrexed e cisplatina (10,3 meses e 22%) em um estudo randomizado recente. [2] em pacientes com a mais alta expressão BRCA1, tratado com docetaxel, a sobrevida mediana foi de 11 meses, idêntico ao obtido em um grande ensaio clínico de fase III em doentes tratados com docetaxel mais cisplatina. [1] no entanto, em nosso estudo, nenhum paciente estava vivo em dois anos, enquanto no estudo de fase III , a sobrevivência de dois anos foi de 21% [1] Curiosamente, 11 pacientes com o menor expressão de ambos BRCA1 e RAP 80 teve um resultado semelhante ao obtido pelos pacientes com mutações EGFR tratados com erlotinib:. sobrevida média não foi alcançada e tempo para progressão foi 14 meses (Tabela 3, Figura 3) a resposta .Chemotherapy está solidamente com base no facto de que os genes de reparação do ADN requer uma série de passos de reconhecimento molecular que permitem que as proteínas de resposta de dano de DNA para localizar-se próximo de lesões e de ADN. A ligação do mediador de dano de ADN um ponto de verificação proteína (MDC1) com a cauda de H2AX fosforilada histona (γH2AX) facilita a formação de focos nuclear BRCA1 em quebras da cadeia dupla induzidas por irradiação ou quimioterapia. Por dimerização com o domínio ANEL associada a BRCA1 proteína (BARD1) através do domínio ANEL, BRCA1 forma uma ubiquitina ligase E3. Recentemente, tem sido mostrado que o rap 80 alvos a ligase BRCA1 de BARD1 E3 para proteínas ubiquitina lisina-63 ligadas MDC1-γH2AX-dependentes em quebras de cadeia dupla (revisto em Wang Elledge [27]). Três estudos mostraram que a anulação de RAP 80 reduziu a formação de focos induzidos a BRCA1 de 28%, [23] 2% [24] e 0%. [25] Por outro lado, Abraxas e RAP 80 formação de focos é independente de BRCA1. [ ,,,0],23] por esse motivo, a hipótese de que se RAP 80 foi elevada, que poderia causar a resistência à quimioterapia com cisplatina, mesmo na presença de níveis baixos de BRCA1. A avaliação exploratória de RAP 80 no presente estudo confirma o seu efeito modulador sobre o modelo BRCA1 personalizado. Por exemplo, a sobrevida mediana em pacientes com menor expressão BRCA1 diminuiu com RAP 80 expressão aumentada: 8 meses com RAP intermédia 80 níveis e 7 meses, com alta RAP 80 níveis (Tabela 3). Superexpressão de BRCA1 confere sensibilidade a docetaxel e paclitaxel; [12], [17], [19], [20] pacientes com os níveis mais elevados de BRCA1, tratados com docetaxel, tinham uma sobrevida média de 11-12 meses quando a expressão RAP80 foi também elevada, mas apenas 6 meses, quando RAP 80 expressão foi baixa (Tabela 3). Pacientes com níveis intermediários BRCA1, tratados com cisplatina e docetaxel, teve uma sobrevida média global de 9 meses, que aumentou para 13-16 meses, quando RAP 80 níveis foram intermediário ou alto (Tabela 3). Estes resultados podem ser explicados por resultados pré-clínicos que o rap 80 é capaz de se translocar para focos induzidos por irradiação na HCC1937 células que expressam um gene BRCA1 truncada que é incapaz de migrar para focos nuclear. [28] Isto indica que RAP 80 podia substituir o função de reparo do DNA BRCA1 em células sem BRCA1. Assim, embora diferentes dobletes platina mostram o mesmo [29] – ou um pouco diferente [2] – sobrevida global, as diferenças podem ser encontrados ao personalizar a quimioterapia com base em um modelo de BRCA1 e RAP 80.
No presente estudo , nenhuma correlação foi encontrada entre BRCA1 e expressão de mRNA Abraxas. No entanto, havia uma indicação de que os níveis de expressão Abraxas modular o efeito de BRCA1. Por exemplo, os pacientes com a menor expressão de BRCA1, tratados com cisplatina com gemcitabina, atingida uma sobrevivência média de 18 meses e o tempo de progressão de 11 meses quando os níveis foram baixos Abraxas (Tabela S4).
Para além da potencial papel preditivo de BRCA1, BRCA1 sobre-expressão confere o comportamento agressivo em modelos transgénicos de células pequenas e carcinomas de pulmão de células escamosas, bem como em um subconjunto de adenocarcinomas do pulmão albergando o /assinatura cancro t-antigénio intrínseca t. [30] o mau prognóstico tem igualmente sido associada com a sobre-expressão BRCA1 no início de NSCLC. [31] no presente estudo, a sobrevivência de dois anos foi de 41% em pacientes com níveis mais baixos de BRCA1, 16% naqueles com níveis intermediários e 0% naqueles com níveis mais altos.
Os mecanismos de sobre-expressão BRCA1 ou downregulation em NSCLC devem ser esclarecidas. No entanto, recentemente, tem sido mostrado que o DNA quebra rapidamente activar proteína heterocromatina 1-β (HP1-β), que promove a fosforilação da histona H2AX, iniciando a BRCA1 conjunto de sinalização para a reparação do ADN. [32] De forma intrigante, caseína quinase 2 promove a mobilização de HP1-β e está associado com prognóstico pobre em NSCLC. [33] Embora BRCA1 metilação é observada no cancro da mama ductal, que só se encontra em 4% de CPNPC. [34] baixa expressão de BRCA1 em tumores pode ser devido à perda de metiltransferases histonas, o que leva à diminuição da metilação H3 cromatina em lisina 9, com a consequente regulação negativa da HP1-β [35].
neste, estudo não-randomizado de fase II, o fator genético ea diferença de tratamento são inteiramente co-existente, e recomenda-se cautela na interpretação dos resultados. No entanto, a análise exploratória indica que há alguma evidência para adaptar a quimioterapia baseada em BRCA1 e RAP 80 níveis. Além disso, num estudo recente de doentes com NSCLC IV 96, fase tratadas com docetaxel mais gemcitabina, observou-se que à medida que os níveis de ARNm de BRCA1 aumentou, a probabilidade de resposta aumentada e o risco de progressão diminuída. Para os pacientes com os níveis mais elevados de BRCA1, a taxa de resposta foi de 58,6%, em comparação com 13,8% para aqueles com níveis intermediários e 27,6% para aqueles com os níveis mais baixos. [36] Com base nestes resultados e os do presente estudo, o Espanhol Grupo câncer de pulmão é agora modificar o protocolo para um estudo planejado internacional de fase III em NSCLC avançado para incluir personalização baseada na RAP 80, bem como a expressão do mRNA BRCA1. Os pacientes no braço de controle receberá a cisplatina com o docetaxel e aqueles no braço experimental receberá a quimioterapia baseada em RAP 80 e níveis de mRNA BRCA1: baixo RAP 80 níveis (independentemente dos níveis de BRCA1), cisplatina e gemcitabina; RAP intermediária ou alta 80 e baixa ou intermediária BRCA1, cisplatina e docetaxel; RAP intermediário ou alto de 80 e de alta BRCA1, docetaxel sozinho
Materiais e Métodos
O protocolo para este ensaio está disponível como informação de apoio.; veja Protocolo S1 e S2 Protocolo.
declaração Ética
O protocolo foi aprovado pelo conselho de ética de revisão institucional de cada centro, e todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito antes da inscrição.
Os pacientes
Foram recrutados pacientes a esta fase II ensaio multicêntrico prospectivo com base no rastreamento de mutações EGFR seguido por análise de expressão de mRNA BRCA1 no tecido tumoral embebido em parafina. elegibilidade clínico incluiu estágio IIIB com derrame pleural ou estágio IV NSCLC, doença mensurável por critérios de avaliação de resposta em tumores sólidos (RECIST), estado de desempenho 0-2 por critérios Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG), hematológica adequada, função renal e hepática. metástases cerebrais foram autorizados. Pacientes com tumores de células escamosas, terapia sistémica prévia para NSCLC avançado, ou outros tipos de câncer clinicamente significativas dentro de cinco anos não eram elegíveis
pacientes com mutações EGFR -., Quer a eliminação exão 19 ou a mutação L858R – recebeu 150 mg de erlotinib oral diária continuamente até progressão ou efeitos adversos intoleráveis. Cada ciclo foi de 28 dias. Os pacientes com EGFR de tipo selvagem recebido quimioterapia personalizado baseado nos níveis de ARNm de BRCA1. Os pacientes no menor tercil de expressão BRCA1 receberam cisplatina 75 mg /m
2 no dia 1 mais gemcitabina de 1250 mg /m
2 nos dias 1 e 8. Os pacientes no tercil intermediário receberam cisplatina 75 mg /m
2 no dia 1 e docetaxel 75 mg /m
2 no dia 1. os pacientes no mais alto tercil recebeu docetaxel 75 mg /m
2 no dia 1. Todos quimioterapia foi repetido a cada três semanas por um período máximo de seis anos ciclos a menos que houvesse evidências anteriores de progressão da doença ou efeitos adversos intoleráveis.
avaliação de base incluiu uma história clínica, exame físico e medições tumorais de lesões palpáveis, bem como lesões avaliadas por tomografia computadorizada. O método de avaliação inicial foi repetida a cada dois ciclo, e depois a cada seis semanas até progressão da doença.
analisa Molecular
coleta de tecido tumoral e microdissecção de captura de laser.
BRCA1, RAP80 e expressão de genes e mutações de EGFR Abraxas foram analisados no ARN e ADN isolado a partir de tecidos tumorais embebidos em parafina. Para cada amostra de tumor uma fatia manchado hematoxilina /eosina foi analisado pelo nosso patologista para selecionar a área de tumor. Duas fatias 5 mícrons foram montadas em lâminas especiais (slides Pem-membrana, palma, Oberlensheim, Alemanha) para microdissecção de captura a laser (CAPmover Microdissector, Carl Zeiss MicroImaging, Barcelona, Espanha) para garantir um mínimo de 90% das células tumorais. Uma lâmina foi utilizada para o isolamento de RNA e o segundo foi usado para isolamento de DNA. A análise
expressão do gene.
Análise da expressão de genes foi efectuada em ARN isolado a partir das amostras de tecido de tumor. O ADNc foi sintetizado utilizando a enzima retrotranscriptase M-MLV. ADNc molde foi adicionado ao Taqman Universal Master Mix (AB; Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) com os iniciadores e sonda específicos para cada gene (Tabela S8). Os conjuntos de iniciadores e sondas foram projetados usando software Primer Express 2.0 (AB) e as sequências RefSeq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene). Quantificação da expressão de genes foi realizada utilizando o Sistema de Detecção de Sequência ABI Prism 7900HT (AB).
análise de mutações de EGFR.
Para o isolamento de ADN a partir de tecido microdissecados, o material foi incubada com proteinase K e O DNA foi extraído com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol. Primers para amplificação por PCR em reações aninhadas para exons 19 e 21 de EGFR são mostrados na informação de apoio. As mutações foram analisadas utilizando dois métodos:. Sequenciamento de DNA e análise de comprimento marcado fluorescente produtos de PCR para exclusões de EGFR no exão 19, e sequenciamento e 5 ‘ensaio de actividade de nuclease (TaqMan) para mutação EGFR no exão 21 (L858R)
(para mais informações sobre as análises moleculares, consulte Texto S1).
a análise estatística
os pacientes foram divididos em grupos com base em tercis de expressão BRCA1 desde que esta divisão é menos suscetível ao viés em múltiplos comparações. Pontos de corte para os tercis BRCA1 foram obtidos a partir da base de dados espanhol Grupo de Cancro do Pulmão, que inclui características clínicas e genéticas de mais de 600 pacientes com câncer de pulmão espanhóis. As respostas foram registradas de acordo com os critérios RECIST. O tempo mediano até à progressão e sobrevivência global foram calculados a partir do início do tratamento para a primeira progressão da doença documentada ou morte, respectivamente.
De forma a comparar as variáveis quantitativas entre os pacientes em cada um dos grupos de tratamento, para explorar as associações entre variáveis dentro de cada grupo, e para estudar o potencial associação entre características basais e resposta, utilizou-se testes paramétricos (teste t de Student ou ANOVA) ou os seus testes não paramétricos equivalentes (U Mann-Whitney, Kruskall Wallis), quando a normalidade não detinha . A normalidade das variáveis contínuas foi verificada com o teste de Kolmogorov-Smirnov. Para comparar as variáveis categóricas e porcentagens de resposta com a sua 95% IC entre os grupos de tratamento, foram utilizados tanto o teste exato de dois lados de Fisher ou o teste do qui-quadrado.
A associação de fatores de risco com o time-to endpoints -Evento foi analisada com o teste logrank frente e verso, e o método de Kaplan-Meier foi utilizado para traçar o time-to-progressão e curvas de sobrevivência correspondente. A análise de regressão Cox univariada, com taxas de risco e os seus 95% IC foi usado para avaliar a associação entre cada potencial fator prognóstico e sobrevivência e tempo de progressão. Esses fatores foram então incluídas em um modelo de riscos proporcionais de Cox de regressão multivariada para avaliar a significância independente de cada variável na sobrevivência e tempo de progressão. O teste da razão de verossimilhança foi utilizado para avaliar a qualidade do ajuste, e o teste de Wald foi usado para avaliar a significância do coeficiente. Para os potenciais múltiplas comparações, os p-valores foram corrigidos com a correção de Bonferroni.
Oitenta e seis dos 111 pacientes sem mutações EGFR para quem tecido tumoral suficiente foi disponíveis foram incluídos em uma sub-análise exploratória da relação entre BRCA1, RAP80 e expressão Abraxas. teste de Spearman foi utilizado para avaliar a correlação entre BRCA1, RAP80 e expressão de mRNA ABRAXAS.
Todos os cálculos estatísticos foram realizados com o pacote estatístico SPSS, versão 15.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA) e S-Plus 6.1. Foram considerados significativos valores de p frente e verso de menos de 0,05.
Informações de Apoio
S1 texto.
texto suplementar
doi: 10.1371 /journal.pone.0005133.s001
(0.04 MB DOC)
Tabela S1.
características clínicopatológicos, os níveis de expressão do gene, estado da mutação EGFR e resultados para todos os pacientes
DOI: 10.1371 /journal.pone.0005133.s002
(0.07 MB XLS)
Tabela S2.
Tipos de metástases
DOI: 10.1371 /journal.pone.0005133.s003
(0.05 MB DOC)
Tabela S3.
Características de 86 pacientes em quem RAP 80 e Abraxas foram analisados
doi: 10.1371 /journal.pone.0005133.s004
(0.07 MB DOC)
Tabela S4.
sobrevida média de acordo com níveis de BRCA1 e Abraxas
doi: 10.1371 /journal.pone.0005133.s005
(0,03 MB DOC)
Tabela S5.
tempo para progressão de acordo com níveis de BRCA1 e Abraxas
doi: 10.1371 /journal.pone.0005133.s006
(0,03 MB DOC)
Tabela S6. modelo
Multivariable COX pela sobrevivência com BRCA1 e RAP 80 como variáveis contínuas
DOI: 10.1371 /journal.pone.0005133.s007
(0,03 MB DOC)
Tabela S7. modelo
Multivariable COX para o tempo de progressão com BRCA1 e RAP 80 como variáveis contínuas
DOI: 10.1371 /journal.pone.0005133.s008
(0,03 MB DOC)
Tabela S8.
Primers e sondas utilizadas na expressão do gene analisa
doi: 10.1371 /journal.pone.0005133.s009
(0.04 MB DOC)
Figura S1.
tempo de progressão de acordo com o grupo de tratamento. Tempo para a progressão foi de 13 meses no grupo de EGFR, 5 meses nos grupos de baixo e intermediário BRCA1 e 8 meses no grupo alta BRCA1 (ver Tabela 2)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0005133.s010
(8.92 MB TIF)
Figura S2.
tempo de progressão para os pacientes no grupo de baixo BRCA1 de acordo com RAP 80 níveis de expressão. Tempo para a progressão foi de 14 meses para pacientes com baixa RAP 80 níveis, 4 meses para aqueles com intermediários RAP 80 níveis e 6 meses para aqueles com alta RAP 80 níveis (ver Tabela 4)
doi:. 10.1371 /journal.pone .0005133.s011
(10.31 MB TIF)
Protocolo S1.
Julgamento Protocolo
doi: 10.1371 /journal.pone.0005133.s012
(1,12 MB PDF)
Protocolo S2.