Abstract
Tumor hipóxia induz a transição epitelial-mesenquimal (EMT), que induz a invasão e metástases, e está ligada ao cancro de células estaminais (CSCs). Se EMT gera CSCs
de novo
, aumenta a migração de CSCs existentes ou ambos não é clara. Foi examinado o tecido do paciente de adenocarcinoma ductal pancreático (PDA), juntamente com os carcinomas da mama, pulmão, rim, próstata e ovário. Para
in vitro
estudos, cinco linhas celulares PDA estabelecidos classificadas como menos (CSC
baixo) e células CSC-como altamente agressivos (CSC
alto) foram examinadas por microscopia de imunofluorescência simples e dupla, ferida -, transwell-, e microscopia de lapso de tempo. HIF-1α e Slug, bem como HIF-2α e CD133 foram co-expressos apontando para uma co-existência putativa de hipóxia, EMT e CSCs
in vivo
. CSC
células de alta apresentaram alta expressão basal da proteína Vimentin mesenquimais mas baixa ou ausente expressão do marcador epitelial caderina-E, com o resultado oposto na CSC
células de baixa. Hipóxia desencadeada alteração da morfologia das células epiteliais de um para um fenótipo mesenquimal, que foi mais pronunciado em CSC
células de alta. Concomitantemente, expressão da caderina-E foi reduzida e expressão de vimentina, Slug, Twist2 e Zeb1 reforçada. Enquanto hipoxia causada migração em todas as linhas celulares, a velocidade, juntamente com a percentagem de migração, as células polarizadas e formando-Pseudópodes foi significativamente maior no CSC
de células de alta. Estes dados indicam que EMT induzida por hipoxia ocorre no PDA e várias outras entidades tumorais. No entanto, embora a sinalização EMT induzida por hipoxia ocorre em todas as populações de células tumorais, células apenas o tronco-como adquirir um elevado potencial migratório e, portanto, pode ser responsável pela invasão e metástase
citação:. Salnikov AV, Liu G, H cilindro , J Gladkich, Salnikova O, Ryschich E, et al. (2012) a hipóxia induz EMT em baixa e altamente agressivo Células Tumorais pâncreas, mas apenas as células com cancro da haste características celulares Adquirir potencial migratório pronunciado. PLoS ONE 7 (9): e46391. doi: 10.1371 /journal.pone.0046391
editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne Escola de Medicina da Universidade de Estado, Estados Unidos da América
Recebido: 12 de junho de 2012; Aceito: 29 de agosto de 2012; Publicação: 26 de setembro de 2012
Direitos de autor: © Salnikov et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do cancro da ajuda alemã (Deutsche Krebshilfe 109362), Comunidade alemã de Pesquisa (DFG HE 3186 /11-1) e Fundação alemã-israelense de Pesquisa e Desenvolvimento Científico (GIF 1.058-7,11 /2008). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
pâncreas ductal adenocarcinoma (PDA) é uma neoplasia agressiva caracterizada por uma extensa invasão local, disseminação sistêmica precoce e resistência marcada à quimioterapia e radioterapia [1]. Além disso, a maioria PDA possuir um tumor hipóxico-microambiente pronunciada [2]. Tumor hipoxia ocorre quando o consumo de oxigénio excede o seu fornecimento através do sistema vascular [3]. Isto leva à indução de factores de transcrição indutíveis por hipoxia, por exemplo HIF-1α e HIF-2α, que regulam a resposta hipóxica por indução de genes alvo como VEGF [4]. A pressão de oxigénio em tumores sólidos é geralmente menor do que nos tecidos circundantes não-malignas, tumores e exibem extensa hipóxia foram mostrados para ser mais agressivos do que os tumores que são melhor oxygenized [5] correspondente, [6], [7]. Isto inclui o cancro do pâncreas, onde a alta expressão do marcador de hipoxia HIF-1α no tecido do paciente foi demonstrada ser um indicador de mau prognóstico clínico [8]. Em estudos experimentais, hipóxia prevê um crescimento agressivo e formação de metástases espontânea em xenoenxertos de cancro do pâncreas [9]. Assim, tumores recaíram mostrar uma fracção hipóxica mais elevada em comparação com os tumores primários [10], [11] sugerindo um papel da hipóxia no enriquecimento das células cancerosas com características de células-tronco (CSC).
A pequena população CSC é sugerido possuir potencial de auto-renovação e a capacidade de diferenciar e gerando assim a população de células heterogénea do tumor originário [12], [13], [14]. Estas conclusões foram também demonstrou para câncer de pâncreas [15], [16]. Além disso CSC são propostas para mediar o crescimento não controlado, resistência à terapia, invasão e metástase [17]. No entanto, seja CSCs são verdadeiramente as únicas células com
de facto
potencial tumorigénico permanece controverso [18], [19], [20], [21]. Relatórios recentes indicam que o surgimento de CSCs ocorre, em parte como resultado da transição epitélio-mesenquimal-transição (EMT) [21]. Portanto, a questão de saber se EMT afeta a população CSC ou também os progenitores mais diferenciados
EMT é um processo de desenvolvimento evolutivamente conservada durante esse células perdem características epiteliais e ganhar propriedades mesenquimais [22]. Isto é acompanhado pela dissolução de junções célula-célula e a perda da polaridade APICO-basolateral, resultando na formação de células mesenquimais migratórias com propriedades invasivas [21]. Portanto, EMT está implicada na progressão tumoral e metástase [23]. EMT-indutores, tais como factor de crescimento transformante-β (TGF-β) ou hipoxia, desencadeiam mudanças na expressão de genes de vias de sinalização complexas. Um mecanismo de base envolvido em progressão de EMT é supra-regulação do marcador mesenquimais vimentina e a regulação negativa do marcador E-caderina epitelial – o principal molécula de adesão transmembranar responsável por interacções célula-célula e na organização do tecido em células epiteliais [24]. E-caderina é transcricionalmente reprimida por proteínas Twist, Caracol, Lesma e Zeb. Reduzida expressão de E-caderina causa a quebra adherens junção, e junto com outros eventos de sinalização promove mudanças de expressão de genes robustos [21]. A perda de polaridade e ganho de características de motilidade de células mesenquimais durante o desenvolvimento embrionário levou comparações com células cancerosas metastáticas durante progressão maligna [25]. Nomeadamente, os dados recentes demonstram que EMT é de facto envolvidas na geração de células com as propriedades de células estaminais, como mostrado no cancro da mama [25], [26], colorectum [27] e do pâncreas [28], [29].
de acordo com a hipótese CSC apenas a população CSC é responsável pela disseminação sistêmica precoce e formação de metástases. Isto implica que EMT induzida por hipoxia quer afeta apenas CSCs ou ativa progenitores mais diferenciados para deter-like células ou os dois juntos. Uma vez que esta questão não é examinado até agora, abordámos esta questão. Ao concentrar-se ao câncer de pâncreas encontramos co-expressão de hipóxia, EMT e marcadores CSC no tecido derivado do paciente. Através da utilização de linhas celulares estabelecidas com altas ou baixas características de células estaminais (CSC
altas ou CSC
Menor) induzimos hipóxia por uma mistura gasosa de baixo oxigênio. Isto conduziu a alterações na morfologia celular, resultando em mais um fenótipo f ibroblastóide-e expressão da proteína relacionada com o EMT em ambas as populações de células tumorais. No entanto, as células mais agressivas tinha uma assinatura EMT-basal mais elevada e esta foi associada com a indução mediada por hipoxia mais rápido e mais elevado de actividade migratória. Nossas descobertas podem ter implicações para diversas entidades tumorais, uma vez que descobrimos expressão da hipoxia marcador CA IX e do marcador EMT Twist2 não só no PDA, mas também em tecido de cancro derivadas de doente de cancro da mama, renal, da próstata, do pulmão e ovário.
Materiais e Métodos
linhas celulares de tumor
BxPC-3, Capan-2, Mia-PaCa2, AsPC-1 e Capan-1 PDA linhas celulares foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) e autenticado em toda a cultura pela morfologia típica. culturas negativas Mycoplasma foram assegurada por testes semanais. As células foram cultivadas em DMEM (PAA, Pasching, Austria) suplementado com 10% de FCS inactivado pelo calor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e 25 mmol /L de HEPES (PAA, Pasching, Austria).
amostras Declaração de Ética + tumor de tecido
tecido do tumor do paciente-derivado do pâncreas, mama, renal, pulmão, próstata e câncer de ovário foi obtido sob a aprovação do comitê de ética da Universidade de Heidelberg. O tecido foi analisada de forma anónima e é derivado a partir de um banco de tecidos de 30 anos de idade. Portanto, um formulário de consentimento do paciente não é aplicável. Os diagnósticos foram estabelecidos por critérios clínicos e histológicos convencionais de acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS). Toda a investigação clínica foram realizados de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki.
In vitro hipóxia modelo
Para a indução de hipóxia 80% de células confluentes foram colocados em uma câmara de hipóxia (auto- fez), que foi inundado por uma mistura gasosa de 1% O
2, 5% de CO
2, 94% N
2 (Grandpair, Heidelberg, Alemanha) durante cerca de 4 min. As células foram incubadas em ambiente hipóxico durante 24, 48 ou 72 h a 37 ° C. A câmara foi novamente cheio com a mistura de gás, após 24 h, para se garantir que as concentrações de gás constante.
A imuno-histoquímica e imunocitoquímica
A imuno-histoquímica em secções de 6 um de tecido congelado ou embebido em parafina foi realizada como descrito anteriormente [30 ]. Os anticorpos usados para a imuno-histoquímica foram policlonal de coelho anti-humano CA IX (Santa Cruz Biotechnology) e mAbs de ratinho anti-humano Twist2 e vimentina (Abcam, Cambridge, Reino Unido). Para colorações duplos immunocytofluorescence mAbs de ratinho dirigido para o HIF-1α (R D Systems, Abingdon, Reino Unido), HIF-2α (Novus Biologicals, Cambridge, Reino Unido), e anticorpos policlonais de coelho contra Slug humano, CD133 (Abcam, Cambridge, Reino Unido), a e-caderina (Cell Signaling, Danvers, MA, EUA) e Zeb1 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemanha). anticorpos secundários foram IgG de cabra anti-rato conjugada com Alexa 488 ou de cabra anti-coelho IgG Alexa 594 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha).
cicatrização de feridas ensaio
As células tumorais (6 × 10
5) foram semeadas em placas de 6 poços e crescidas até à confluência durante a noite. Vinte e quatro horas após a incubação sob condições de hipóxia ou de normóxia uma linha foi riscado dentro da camada de células confluentes usando a extremidade fina de uma ponta de pipeta 10 ul (tempo 0). Imagens de células que migram foram sequencialmente feita durante o fechamento da região feridos.
microscopia de lapso de tempo vídeo
BxPC-3 ou AsPC-1 células (5 × 10
5) expostos a hipoxia ou normoxia durante 48 h foram misturados com uma solução de colagénio do tipo I. Uma câmara de microscópio POCmini (LACON GbR, Ulm, Alemanha) foi preenchido com células tumorais em solução de colagénio e o gel foi polimerizada a 37 ° C num CO
2 incubadora durante 1,5 horas. A câmara de POCmini com o gel de colagénio polimerizado tridimensional (3D) foi então colocado numa placa de aquecimento (36,6 ° C, LACON, Ulm, Alemanha) sob o microscópio (Leitz, Wetzlar, Alemanha). As células em géis de colágeno 3D estavam concentrados sob 50
x
ampliação. As imagens foram gravadas usando uma câmara de vídeo digital de Kappa (DX2, Kappa GmbH, Gleichen, Alemanha) e, consequentemente, foram tomadas com um intervalo de 15 minutos, durante um período de 24 horas. imagens TIFF sequenciais foram transferidos para o formato AVI-vídeo usando software Animation Shop. As análises dos movimentos celulares foram realizados com CapImage 8,4 software (Dr. Zeintl Engenharia Biomédica, Heidelberg, Alemanha). A migração de células individuais foi analisada sob 02:01 zoom usando um “quadro a quadro” método. Foram avaliados porcentagem de células que migram, tipo de movimento e velocidade.
Transwell ensaio de migração
Para analisar o potencial invasivo de células foi utilizado um ensaio transpoço padrão descrito em outro lugar. foram usadas filtro de policarbonato Transwell (tamanho de poro de 8 um) (Corning Inc., Lowell, MA). A hipoxia pré-tratada (48 horas) ou células de controlo tratadas com normoxia foram semeadas a uma concentração de 10
5 células por placas cm
2 de 24 poços. Em seguida, as células foram expostas a hipoxia (Migração medido em condições de hipoxia) ou normoxia (Migração medido em condições de hipoxia) durante mais 48 h e o número de células foi contado transmigrou. A porcentagem de células transmigrou foi normalizado com a percentagem de vitalidade celular avaliada por um ensaio MTT no ponto final do experimento.
A análise estatística
Os dados quantitativos são apresentados como a média ± SD. Os dados foram analisados usando
t
teste de Student para significância estatística.
P
. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
A expressão de hipóxia, EMT- e CSC-marcadores no tecido do cancro do pâncreas
Para estudo co-expressão de hipóxia e EMT-marcadores foi realizada imunofluorescência dupla de amostras de tecido congelado derivadas de pacientes de adenocarcinoma ductal pancreático. Em regiões positivos HIF-1α E-caderina foi regulada para baixo e Slug-regulada revelador induzida por tumor-hipoxia EMT (Fig. 1A). Em algumas áreas tumorais, células, quer com vimentina ou expressão de E-caderina foi observada na proximidade (Fig. 1B). Isto indica que as células do estroma que rodeiam são positivos para vimentina e negativos para E-caderina. Mais interessante, regiões hipóxicas positivas para o marcador de hipoxia HIF-2α mostraram co-coloração com CD133, sugerindo que a hipoxia tumor está relacionado com a expressão dos marcadores de CSC (Fig. 1C). Estes dados confirmam que EMT-driven hipóxia ocorre no tecido tumoral de pacientes com câncer de pâncreas e células tumorais CSC-positivos estão presentes no microambiente do tumor hipóxico.
(A) colorações de imunofluorescência duplas de amostras de tumores de pacientes com câncer de pâncreas . expressão nuclear do HIF-1α (verde, seta) e expressão de membrana de E-caderina (vermelho, seta) ou Slug (vermelho, seta) é mostrado. cor amarela em imagens fundidas indica co-expressão de E-caderina ou Slug em células-HIF-1a positivo. (B) a expressão de membrana de E-caderina (vermelho), expressão citoplasmática de vimentina (verde), juntamente com DAPI-coloração de núcleos (azul). quadrados brancos indicam células Vimentina positivo dentro da massa tumoral que são negativos para E-caderina ou
vice-versa
. Barra: 100 fim. ampliações dupla das áreas rodeadas por quadrados em branco são apresentadas à esquerda. (C) a expressão Nuclear de HIF-2α e expressão membrana de CD133 é mostrado como coloração única e coloração como resultante da fusão em que a cor amarela indica double-positividade.
hipóxia induz a sinalização de HIF-1α e morfológica alterações in vitro
para uma avaliação mais detalhada da EMT induzida por hipoxia e a influência de células de câncer de pâncreas diferenciados e CSC-como usamos cinco linhas de células humanas estabelecidas de PDA. De acordo com o grau de diferenciação do tumor primário, mutações em K-ras, P53, e a capacidade de colônias, a actividade de ALDH, a tumorigenicidade em ratinhos e expressão de E-caderina e vimentina sendo estas linhas celulares como CSC
alto ou CSC
baixa (Tabela 1). A hipoxia foi induzida por incubação das células em uma mistura gasosa de 1% O
2, 5% de CO
2 e 94% N
2. Isto resultou em rápido aumento da regulação do HIF-
1α e sua VEGF gene alvo dentro de 2 horas em ambos, CSC
células de alta e baixa CSC
como examinado por análise de Western blot. Em contraste, as células cultivadas em condições de normóxia fez-se não-regular estas proteínas (Fig. 2A, dados não mostrados). CSC
células de baixa teve um pico de expressão entre 6 e 12 horas, o que diminuiu gradualmente ao longo do tempo, mas ainda era visível em 72 h. Em contraste, a CSC
de células de alta tinha um pico mais cedo entre 4 e 6 horas, que foi diminuído para níveis muito baixos, já às 24 horas e não era detectável em 72 horas em ambas as linhas celulares. Em contraste, a expressão de VEGF foi progressivamente aumentada durante um período de 72 h. Em linha com a sinalização do número de células com um fenótipo fibroblastóide-like aumento no prazo de 72 h 20-28% na CSC
células de baixa e 28-33% na CSC
células de alta relacionado hipóxia-observado (Fig . 2C). Indução da percentagem de células fusiformes foi ainda mais pronunciado e mais elevada no CSC
células alto de TGF-β, um conhecido indutor de EMT, o qual foi utilizado como controlo positivo. Foram observadas alterações morfológicas semelhantes após a exposição à hipoxia em Capan-1, células Capan-2 e AsPC-1 câncer (Figura S1). Estes dados sugerem que
in vitro
indução de hipóxia induz EMT em ambas as populações de células -. Pancreáticas células cancerosas mais diferenciados e CSC-like, mas o efeito é mais rápido e mais forte no CSC
células de alta
(a) Para a indução de hipóxia
in vitro
, BxPC-3 e MIA-PaCa2 células foram incubadas em uma câmara de ar-tight em uma atmosfera de 1% o
2, 5% de CO
2 e 94% N
2 para os períodos de tempo indicados. Os controlos foram incubados sob condições de normóxia durante 48 h (n). As proteínas foram colhidas e a expressão de HIF-1α e VEGF foram examinados por análise de mancha de Western. Os extractos proteicos das células em cultura sob condições de normóxia (N: 16% O
2, 5% de CO
2, 79% N
2) serviu como controlo para a indução da hipóxia (H). A coloração das membranas Western blot com β-actina serviu como controle para a igualdade de condições. (B, C) alterações morfológicas em células expostas à hipoxia, normoxia, ou TGF-β (5 ng /ml) foram avaliados utilizando um microscópio de luz de 72 h após a incubação /tratamento sob 100
x
de ampliação (inserir, 200
x
). A porcentagem de células fusiformes fibroblastóides foi contado em 24, 48 e 72 h.
A hipoxia up-regula a expressão de proteínas relacionadas com a EMT
Para uma avaliação mais aprofundada das células-tipo específico efeitos da EMT induzida por hipóxia examinamos a expressão de proteínas envolvidas na EMT nos dois CSC
linhas celulares de baixo BxPC-3 e Capan-2 e nos três CSC
linhas de células altas MIA-PaCa2, AsPC-1 e Capan-1. Após a exposição à normoxia ou hipoxia durante 48 h as células que marcado com anticorpos específicos e analisadas através de microscopia de fluorescência dupla imunofluorescência. Embora ambos os CSC
linhas celulares de baixo teve forte expressão basal da caderina-E, mas baixa expressão de vimentina, como esperado, a hipóxia induz a regulação negativa da E-caderina e regulação positiva de vimentina (Fig. 3). Este foi associada com a regulação positiva da EMT-marcadores Twist2, Slug e Zeb1. Em contraste, a CSC
células de alta não exibiram (MIA-PaCa2) ou uma expressão muito baixa basal (AsPC-1, Capan-1) de E-caderina, mas maior expressão basal de Vimentin comparação com CSC
células de baixa. Após a exposição à hipóxia a expressão da proteína-típica-EMT como ocorreu semelhante ao observado em CSC
células de baixa. Imunofluorescência dados foram confirmados por análise de Western blot (dados não mostrados). Estes dados sugerem que ambos, CSC
baixa e CSC
células de alta exibem a típica expressão induzida por hipóxia relacionadas com a EMT gene, mas a expressão da proteína relacionada com a EMT basal em condições de normóxia é maior em CSC
células de alta.
BxPC-3 e Capan-2 CSC
baixa e MIA-PaCa2, AsPC-1 e Capan-1 CSC
células de alta foram expostos à normóxia ou hipóxia durante 48 h. Expressão de proteínas relacionadas com EMT foi detectada por coloração de imunofluorescência dupla seguido por fotografar as células em 400
x
ampliação. O tamanho das fotos tiradas foi ainda triplicou no Photoshop. E-caderina (vermelho), Twist 2 (verde), Slug (vermelho), Vimentin (verde), ZEB1 (vermelho). Os núcleos são corados com DAPI (azul). Alterações nos níveis de proteínas relacionadas com o EMT são mostrados abaixo nas fotografias. Nenhuma expressão detectável (-)., Expressão fraca (+), expressão mediana (++), expressão forte (+++)
hipóxia estimula propriedades migratórias de CSCs pancreático
para investigar as diferenças induzido por hipoxia, analisamos a migração de células cancerosas em três ensaios de migração diferentes. Em primeiro lugar, foi utilizado um padrão
in vitro
ensaio ferindo. BxPC-3, Capan-2, as células PaCa2-MIA, AsPC-1 ou Capan-1 foram expostas a hipoxia ou normoxia durante 24 h seguida por raspagem da camada de células confluentes e posterior incubação em condições de normóxia. Imagens de células na mesma área de migração são mostrados 12 e 24 h após arranhão. Em todas as linhas de células verificou-se que a região ferida foi fechada mais rapidamente por células que tinham sido expostas a hipoxia em comparação com as células expostas a normoxia. No entanto, não foi possível detectar grandes diferenças na migração celular entre CSC
alto e CSC
linhas celulares baixos neste ensaio não-quantitativa (dados não mostrados). Os dados representativos para Capan-1 estão apresentados (Fig. 4A). Por conseguinte, foi utilizado um ensaio de migração mais sensível realizada na matriz extracelular 3D. A migração de células individuais foi documentado por microscopia de lapso de tempo vídeo. De acordo com os dados obtidos pelo ensaio de cicatrização de feridas, descobrimos que 48 h de exposição da CSC
alta AsPC-1 ou CSC
baixo células à hipóxia induzida locomoção mais rápida e uma maior percentagem de polarizada, migrando e pseudópodes 3 BxPC- -forming células de normoxia em ambas as linhas celulares (Fig. 4B). Semelhante aos nossos resultados anteriores CSC
células de alta migraram mais rapidamente do CSC
células de baixa. A velocidade média de AsPC-1 CSC
de células de alta expostas a hipoxia foi de 7,8 um /h em contraste com 5.1 um /h de CSC
células de baixa BxPC-3. Além disso, a percentagem de células que migram basais, bem como células que formam pseudopodia ou que exibem um fenótipo polarizada foi maior no CSC
elevado em comparação com CSC
células baixos. Estes dados foram confirmados num ensaio Transwell padrão. CSC
alta MIA-PaCa2, AsPC-1, Capan-1 e CSC
baixas células BxPC-3 e Capan-2 foram pré-incubadas sob condições hipóxicas durante 48 h em meio de cultura de células normal contendo 10% de FCS. Migração para um gradiente de 1%, 10% e 20% de FCS sob normoxia foi medida por avaliação do número de células transmigrou dentro de 48 h (Fig. 4C). Descobrimos que a pré-incubação das células em condições hipóxicas aumentou a percentagem de células transmigrou em todas as linhas celulares. Os efeitos mais evidentes foram obtidos com células em movimento no sentido de um gradiente de 1% de FCS. Em um gradiente de 10% de FCS a migração basal do CSC
de células de alta já estava no nível mais alto, como é evidente a partir do controlo positivo com 20% de FCS. Assim, a hipoxia não poderia induzir a migração adicional basal de MIA-PaCa2 e células Capan-1 no sentido de um gradiente de 10% de FCS. Bastante resultados semelhantes foram obtidos quando a migração de células de hipoxia pré-tratado foi analisado sob condições hipóxicas (Fig. 4D). Estes resultados sugerem que, embora a hipoxia induz a migração de células mais diferenciadas, a CSC e semelhantes, basal e potencial de migração induzida por hipoxia é maior no CSC
de células de alta. Portanto EMT induzida por hipoxia induz um elevado potencial migratório principalmente em células CSC-similares, que podem ser responsáveis para a invasão e metástase.
(A) células Capan-1 foram incubadas sob hipóxica (H) ou normóxica (N) condições durante 24 h, seguido por raspagem da camada de células confluentes. A migração de células para a área ferida foi monitorizado durante 24 h e as fotografias são exibidas nos tempos 0, 12 e 24 h após arranhão. Barra: 100 fim. (B) BxPC-3 (CSC
baixo) ou AsPC-1 (CSC
elevadas), as células expostas a hipoxia (H) ou normoxia (N), durante 48 h foram incluídos num colagénio tridimensional (3D) gel e a actividade locomotora foi analisada numa câmara POCmini por microscopia sob 50
X
ampliação como descrito no material seção de métodos. Foram avaliados quatro tipos de actividades locomotoras celulares: formação activa de pseudopodia (1), a polarização, como é evidente a partir de alongamento das células e formação de forma bipolar (2), a migração activa para mais do que dois diâmetros de células distância (seta, 3) ausência de um celular detectável polarização e locomoção (4). imagens representativos são mostrados e os pontos de tempo de análise estão indicados. (C) BxPC-3, Capan-2, Mia-PaCa2, células AsPC-1 e Capan-1 foram pré-incubadas sob hipóxica (H) ou de normóxia condições (N). Transmigração foi analisada após mais 48 horas de incubação sob condições hipóxicas (D) normóxica ou utilizando um ensaio Transwell padrão. foi avaliada migração de células no sentido de meio com 1% ou 10% de FCS na câmara inferior. Migração para médio com 20% FCS serviu como controlo positivo.
Co-expressão de hipóxia e EMT-marcadores é comum em várias entidades tumorais
EMT induzida por hipóxia foi estudada em parafina-embedded amostras de tecido derivadas de pacientes de pancreático, da mama, do rim, do pulmão, da próstata e cancro do ovário. Em todos estes tecidos identificou-se a expressão da anidrase carbónica IX (CA IX), uma proteína sobre-regulada por hipóxia [6], juntamente com a expressão da vimentina e o factor de transcrição relacionados com o EMT Twist2 (Fig. 5). Em contraste, a expressão do CA IX, vimentina e Twist2 estava ausente em tecidos não-malignas, como exemplificado no tecido pulmonar normal derivado do mesmo paciente do qual são apresentados colorações do tecido maligno correspondente (Figura S2). Estes dados demonstram que EMT-driven hipoxia é uma característica comum de diversas entidades tumorais, que podem ser seguidos por reforçada potencial migratório da população CSC.
A expressão de anidrase carbónica IX (CA IX), Twist2 e vimentina foi analisada por imuno-histoquímica regular em tecidos de tumor derivadas de doentes com pâncreas (n = 5), mama (n = 11), rim (n = 10), pulmão (n = 9), ovário (n = 9) e de próstata (n = 9) câncer. As células positivas (vermelho) são vermelho para vermelho-escuro. Barra: 100 fim. A ampliação tríplice (maiores quadrados brancos) de uma pequena área com células positivas coradas (menores quadrados brancos) é mostrado dentro de cada imagem.
Discussão
No presente estudo, avaliamos a questão de saber se EMT induzida por hipóxia afeta as células CSC-como de PDA ou também as células tumorais mais diferenciados. No tecido tumoral do paciente de PDA identificamos co-localização da hipoxia marcador HIF-1α e do Slug EMT marcador. regiões de tecido de câncer de pâncreas positivos para a hipóxia marcador HIF-2α foram altamente positivas para o marcador CD133 CSC.
In vitro
tanto CSC
alto e CSC
pancreáticas células cancerosas baixos respondeu a hipóxia, alterando a morfologia das células epiteliais de um a um fenótipo mais fibroblastóide ou mesenquimais com uma percentagem mais elevada no CSC
alta células. As alterações morfológicas induzidas por hipóxia foram associados a expressão da caderina-down-regulamentado e regulado para cima expressão de vimentina, e transcrição relacionados com a EMT fatores Slug, Twist2 e Zeb1 na CSC
células de baixa. CSC
de células de alta tinham uma assinatura de células mesenquimais expressão da proteína quase em condições de normóxia, como exemplificado por níveis baixos ou ausentes E-caderina, juntamente com alta expressão de vimentina, que foi apenas marginalmente aumentada por hipoxia. Esta maior status EMT basal da CSC
células de alta pode ser a razão para o aumento da capacidade migratória observada em condições de normóxia e hipóxia. Assume-se que as células tumorais pancreáticas estaminais semelhante podem ter uma vantagem de sobrevivência sob condições hipóxicas desfavoráveis, uma vez que tem sido demonstrado EMT para contribuir para a resistência aos medicamentos no cancro pancreático [34]. Em linha com esta suposição, MIA-PaCa2 e AsPC-1 com características de alta EMT basais foram mostrados para ser muito mais resistente em relação ao gemcitabina que BxPC de 3 células com características de baixa basais EMT [34], que também está de acordo com a CSC fenótipo -como de MIA-PaCa2 e AsPC-1.
os dados recentes de imunohistoquímica confirmar nossos resultados de imunofluorescência dupla de HIF-1α /co-expressão Slug, uma vez que 87% dos tecidos PDA humanos dos 36 analisados foram encontrado para expressar Snail e 50% dos pacientes apresentaram expressão positiva do pedaço de chumbo, enquanto torção mostrou nenhuma ou apenas uma fraca expressão [35]. No entanto, torção foi fortemente induzida por hipoxia em cima MIA-PaCa2, AsPC-1 e células Capan-1, como detectado por RT-PCR [35]. Isto corresponde aos nossos achados de expressão Twist2 em células estabelecidas e PDA primário, que era mais forte na indução de hipóxia
in vitro
. Outra interessante relatório reforça significativamente esses dados desde expressão do RNA torção foi encontrado para ser significativamente maior em PDAs invasivos comparado com amostras não-tumorais e IPMN combinados [36].
A questão é que os mecanismos moleculares estão por trás da EMT reforçada características e capacidades migratórias de CSC
células de alta. Em particular, foi descrito EMT ser dependente da sinalização de NF-kB em células de cancro pancreático [37]. Desde que recentemente identificado reforçada atividade NF-kB na CSC
elevado em comparação com CSC
células de baixa [32], NF-kB pode estar envolvido na mediação aumentou propriedades migratórias de CSC
células de alta. Outra razão subjacente bem conhecido para o padrão de crescimento muito invasiva de e.g. células MIA-PaCa2 parece ser que a invasão é claramente dependente CXCR4 [16]. Desde CSCs pancreáticas preferencialmente expressam o receptor CXCR4 e metástase usando o eixo CXCR4 /SDF-1 [16] isso pode facilitar potencial migratório reforçada. Além disso, a p53 é sugerido para regular EMT e haste propriedades das células e isso pode ter contribuído para o potencial migratório reforçada observado de CSC
linhas de células elevada, uma vez MIA-PaCa2, AsPC-1, Capan-1 e BxPC-3, mas p53 não Capan-2 ter mutado [31]. Assim, a perda de p53 correlaciona-se com um aumento de miR-dependente de 200c na expressão de EMT, marcadores stemness e grau elevado de tumor, como descrito recentemente em uma coorte de tumores da mama [38]. Muito semelhante, a inibição de p53 reprime a E-caderina por metilação do promotor, como mostrado nas células do tumor dos ovários [39]. Esta observação está de acordo com a baixa expressão da caderina-E observado em CSC
linhas de alta celulares com p53 mutante.
Vamos supor que a resposta mais rápida observada de células tumorais pancreáticas estaminais-como a hipóxia com EMT upregulated sinalização e maior potencial migratório pode ser ainda mais pronunciada no
in vivo
microambiente do tumor. Isto pode ser devido ao facto de episódios repetidos em tumores sólidos de hipoxia, seguido por re-oxigenação é um fenómeno comum. Esta chamada “hipóxia intermitente” é descrito para regular características tronco-like [40]. A ocorrência de episódios hipóxicos intermitentes varia significativamente em tumores malignos de crescimento rápido [41]. Em fases de normoxia quando os sinais de indução de EMT são removidos CSC
células de baixa que foram induzidos a EMT pode reverter para o estado epitelial semelhante por sofrer mesenquimais transição epitelial (MET), como foi relatado para ocorrer em algumas células de carcinoma [20 ], [42]. dados novos adicionais fornecem insights sobre interações como dinâmicas entre epitelial, auto-renovação, e os programas de genes mesenquimais determinar a plasticidade da CSC na comutação entre células epiteliais e mesenquimais estados [43]. Estes resultados sugerem que a CSC
células baixas podem diferenciar para células CSC-como na indução de EMT por hipóxia e dedifferentiate mediante a retirada de hipóxia.