Sumário

telomerase humana transcriptase reversa (hTERT) é a enzima chave responsável pela síntese e manter os telómeros nas extremidades de cromossomas, e é essencial para a proliferação celular. Isso fez hTERT um foco de pesquisa oncológica e um alvo atraente para o desenvolvimento de drogas anti-cancro. Neste estudo, foi elaborado um pequeno ARN interferente (siRNA) alvejando a subunidade catalítica de hTERT e testados os seus efeitos sobre o crescimento de cancro do cólon humano células de carcinoma SW480 telomerase-positiva, in vitro, bem como sobre a tumorigenicidade destas células em ratinhos nus . transfecção transiente e estável de hTERT siRNA em células de cancro do cólon SW480 suprimida a expressão da hTERT, a actividade de telomerase reduzida e inibiu o crescimento celular e proliferação. Derrubando a expressão da hTERT em tumores SW480 xenoenxerto em ratinhos nu diminuiu significativamente o crescimento do tumor e promoveu a apoptose de células tumorais. Nossos resultados sugerem que hTERT está envolvido na carcinogênese do carcinoma do cólon humano, e destacam o potencial terapêutico de uma abordagem knock-down hTERT

Citation:. Liu AQ, Ge LY, Lu XL, Luo XL, Cai YL , Ye XQ, et al. (2014) silenciamento do gene hTERT por shRNA Inibe cancro do cólon SW480 celular Crescimento

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 9 (9): e107019. doi: 10.1371 /journal.pone.0107019

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de outubro de 2013; Aceito: 14 de abril de 2014; Publicação: 10 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Fundação de Ciência Natural de Guangxi (concessão 2010GXNSF013238, https://www.gxst.gov.cn/zwgk/kjxmgl/xmxdgg/600619_7.shtml) e os Programas de Changjiang Estudiosos e equipas de investigação inovadora da Universidade (No. IRT1119). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma colorectal é o terceiro câncer mais comum no mundo inteiro e a quarta causa mais comum de morte [1] – [2]. Só em 2008, cerca de 1,23 milhões de novos casos de cancro colorectal foram diagnosticados em todo o mundo, e 608.000 pessoas morreram da doença [3]. O tratamento padrão para esse tipo de câncer é cirúrgico, mas os resultados estão longe de ser satisfatória, com até 50% dos pacientes que sofrem recorrência ou morte dentro de 5 anos de cirurgia [4].

Segmentação telomerase no carcinoma do cólon pode fornecer uma alternativa eficaz ou complemento ao tratamento cirúrgico. A telomerase, um complexo de ribonucleoproteína contendo um molde interno de ARN (hTR) e uma proteína catalítica com actividade de transcriptase reversa específica dos telómeros-(hTERT), estende-se telómeros no final de cromossomas eucarióticos, evitando assim a senescência celular e morte. A telomerase parece desempenhar um papel chave no crescimento do tumor e proliferação: expressão e actividade da enzima estão anormalmente elevados na maioria dos cancros [5] – [6], e regulação negativa da enzima inibe o crescimento e proliferação [7]. Enquanto hTR está constitutivamente presente em células normais e tumorais, hTERT é o componente limitante da taxa do complexo da telomerase, e a sua expressão está correlacionada com a actividade da telomerase [8]. Em tecidos somáticos normais, a actividade de hTERT é reprimido, mas tanto a expressão de hTERT e a actividade de telomerase são elevados na maioria dos tumores humanos [9] – [10]. Vários estudos indicam que a telomerase pode ser a chave para as células imortalizar como um passo necessário na oncogênese [11] – [12]., Tornando hTERT um biomarcador potencialmente útil clínica [13] e alvo de investigação anticancerígeno [14]

no cancro colorectal, até 85% das células contêm telomerase activo, enquanto que apenas cerca de 5% de células colorrectais normais contêm enzima activa. Por conseguinte, visando a expressão ou a actividade de telomerase pode proporcionar uma nova terapia para o cancro colorectal. Dado que não inibidores de telomerase altamente seletivos estão disponíveis para o tratamento de qualquer tipo de câncer, nós nos concentramos em abordagens de terapia genética. A terapia genética deve desempenhar um papel fundamental na terapia do cancro da próxima geração, em conjunto com os tratamentos convencionais, tais como cirurgia, quimioterapia, radioterapia e [15]. Uma terapia de genes é a interferência de ARN (ARNi), que pode regular negativamente ( “knock-down”) da expressão de genes específicos, permitindo as funções dos genes a ser analisado ou bloqueado para fins terapêuticos [16] – [18].

no presente estudo, foi elaborado um romance hTERT pequena interferência RNA (siRNA) e expressou a correspondente RNA curto hairpin (shRNA) em células colorretal em humanos in vitro e em camundongos nus. Descobrimos que derrubar a expressão da hTERT inibiu o crescimento de células de carcinoma do cólon humano, levantando a possibilidade de abordagens de terapia genética que visam hTERT.

Materiais e Métodos

cultura celular

Dois pontos humanos linhas celulares de carcinoma SW480, DLD-1, e HT29 (Academia Sinica Cell Bank, Shanghai, China) foram cultivadas em meio de baixa glucose de Dulbecco modificado de Eagle (SW480) ou RPMI-1640 (DLD-1 e HT29) (GibcoBRL, Grande island, NY, EUA) suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino, 100 UI /ml de penicilina e 10 mg /ml de estreptomicina. As culturas foram incubadas em 5% de CO

2 a 37 ° C.

Declaração e Animais Ética

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Laboratório animais dos Institutos Nacionais de Saúde e do protocolo do estudo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Medicina de Guangxi. Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia com pentobarbital de sódio, e o sofrimento foi minimizado tanto quanto possível. camundongos atímicos (BALB /cA nu /nu) com idades entre 4-5 semanas (Guangxi Institute of Materia Medica, Nanning, China) foram alojados em gaiolas estéreis sob capuzes laminar de fluxo de ar em uma sala específica livre de patógenos com um 12 h: 12 h cronograma claro-escuro. Os animais foram alimentados com ração esterilizada e água ad libitum.

RT-PCR para medir a expressão do ARNm da hTERT em diferentes linhas celulares

O ARN total foi extraído a partir de SW480, DLD-1 e células HT29 utilizando Trizol ( bio básica Inc., Canada) de acordo com as instruções do fabricante. a síntese do ADNc da primeira cadeia foi realizada com 2 ug de ARN de cada linha celular e de Moloney vírus da leucemia murina de RT (MMLV-RT; MBI Fermentas, Amherst, Nova Iorque, EUA), em seguida, amplificado numa mistura reaccional de 50 ul contendo 50 mM de cada um dos quatro dNTPs, 3 U de Taq ADN polimerase (Promega), e 0,5 mM de iniciadores (Sangon Co., Xangai, China). Os iniciadores 5′-GCTGCTCAGGTCTTTCTTTTATG-3 ‘e 5′-CGACGTAGTCCATGTTCACAA-3′ foram utilizados para amplificar uma região de 252 pb dentro do gene hTERT. Como um controlo interno, a expressão de desidrogenase de fosfato de gliceraldeído (GAPDH) foi ensaiada utilizando os iniciadores 5’-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3 ‘e 5′-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3’ para amplificar uma região de 450 pb. reacções de amplificação foram realizadas durante 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 56 ° C durante 45 s e 72 ° C durante 45 s. Os produtos de PCR foram separados num gel de agarose a 2,0%, que foi corado com o corante ácido nucleico I (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha), fotografados e analisados ​​quantitativamente usando semi-GeneTools Análise Software (Syngene, Cambridge, Reino Unido). A linha celular que mostra o alto nível de mRNA hTERT foi escolhido para um estudo mais aprofundado.

Projeto de siRNAs segmentação hTERT

Três sequências de hTERT siRNA foram concebidos como descrito [19]. As sequências foram as seguintes, com as posições de início de nucleótidos com base na entrada do NCBI para hTERT (adesão NM_198253): hTERT-966, 5′-CGGUGUACGCCGAGACCAATT-3 ‘;

hTERT-2862, 5′-3-GAGCCAGUCUCACCUUCAATT ‘; e hTERT-2985, 5’-CGGUGUGCACCAACAUCUATT-3 ‘. Em paralelo, nós projetamos uma sequência não relacionada como um controlo negativo para a especificidade siRNA: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘. Todas as quatro sequências foram submetidas a uma pesquisa BLAST contra o genoma humano para excluir a possibilidade de uma homologia significativa com outros genes. As sequências foram sintetizados quimicamente (GenePharma Co., Xangai, China) e transientemente transfectados em culturas SW480 que tinham sido cultivadas durante a noite a 40-60% de confluência em meio completo sem os antibióticos. As transfecções foram realizadas utilizando o reagente Lipofectamina (GenePharma Co., Xangai, China) de acordo com as instruções do fabricante. Depois de 48 h a transfecção, a transcriptase inversa (RT) -PCR foi usada para medir a expressão do ARNm da hTERT. A sequência de hTERT-2985 foi encontrada para reduzir o nível de mRNA hTERT na maior medida e, portanto, foi seleccionado para um estudo mais aprofundado.

Construção de um hTERT-shRNA expressão eucariótica plasmídeo

Os oligonucleotídeos de RNA 5′-CGGUGUGCACCAACAUCUATT-3 ‘(sentido) e 5′-UAGAUGUUGGUGCACACCGTC-3’ (anti-sentido) foram sintetizados quimicamente (GenePharma Co., Xangai, China) e recozido para formar um duplex com uma saliência simétrica de dois deoxythymidines em 3 ‘ final (hTERT-siRNA). Um ARNic em cadeia dupla que contém a sequência não relacionada 5’-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘(NC-siARN) também foi sintetizado como um controlo negativo para a especificidade de ARNsi. Para construir um plasmídeo expressando NC- ou hTERT-siRNA para a transfecção estável, os oligonucleótidos emparelhados 5’-caccgTTCTCCGAACGTGTCACGTcaagagattACGTGACACGTTCGGAGAAtttttt-3 ‘e 5′-caccgCGGTGTGCACCAACATCTAttcaagagaTAGATGTTGGTGCACACCGttttttg-3’ (As sequências alvo em letras maiúsculas) foram subclonados no PGPU6 /GFP /vector de neo (GenePharma). Este vector expressa coral proteína fluorescente verde (cGFP) sob o controlo do promotor de CMV para permitir o controlo da eficiência de transfecção. foram designados plasmídeos que expressam NC- e hTERT-siRNA, respectivamente, PGPU6 /GFP /Neo-NC-shRNA (a seguir: NC-shRNA) e PGPU6 /GFP /Neo-hTERT-shRNA. (a seguir: hTERT-shRNA)

transfecção transiente de células SW480

culturas de 2 × 10

5 células por poço, foram cultivadas em placas de 6 poços a 90% de confluência e transfectadas com 100 nM NC-shRNA ou hTERT-usando shRNA Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Em paralelo, as células foram transfectadas com a mesma quantidade de Lipofectamine 2000 sem qualquer plasmídeo shRNA como um controlo. As culturas foram colhidas em triplicado, após a transfecção para 24, 48, e 72 h.

RT-PCR para medir a expressão do ARNm da hTERT após transfecção

Em cada ponto de tempo indicado acima, o ARN total foi extraído a partir de SW480 transfectadas células utilizando Trizol e submetido a RT-PCR como descrito acima.

a imunocitoquímica para medir a expressão da proteína hTERT

SW480 células foram plaqueadas sobre lamelas de 2,5 cm a uma densidade de 5 x 10

5 células /poço em placas de 6 poços. Após transfecção por 24, 48, ou 72 h, lamelas foram removidas e imunocoradas com o anticorpo anti-coelho policlonal de hTERT (1:300, Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) e o kit de MaxVision (Maixin, Fuzhou, China). Em cada lamela, cinco pontos de vista foram seleccionados aleatoriamente e capturados usando software de análise de imagem (Leica, Alemanha). Em cada ponto de vista, a intensidade em tons de cinza foi medida em 10 pontos selecionados aleatoriamente e média. A intensidade de tons de cinzento médio era inversamente proporcional ao nível da proteína.

ensaio TRAP da actividade da telomerase

a actividade de telomerase foi ensaiada utilizando um estojo comercial de ELISA Telomerase PCR (Roche Diagnostics Scandinavia AB, Estocolmo, Suécia) de acordo com as instruções do fabricante. Este ensaio baseia-se no protocolo de repetição telomérica amplificação [20]. Após SW480 células foram transfectadas durante 48 horas com Lipofectamine 2000 sozinho, NC-shRNA ou hTERT-shRNA, ou para a esquerda não transfectada em meio de cultura como um controlo em branco, as proteínas celulares totais foram extraídos utilizando tampão CHAPS lise, e uma alíquota de 0,5 ug estava ensaiada. O ensaio consistiu de uma reacção de alongamento da telomerase-iniciador, seguido por 26 ciclos de PCR. Os produtos de PCR foram detectados usando uma reacção de cor com base em ELISA [20].

a actividade de telomerase foi expressa como uma absorvência corrigida, dada pela absorvância, em unidades arbitrárias, a 450 nm menos a absorvância no comprimento de onda de referência de 690 nm . De acordo com as instruções do fabricante, a absorvância máxima ajustada para o controlo negativo deve ser de 0,25, enquanto que a absorvância ajustado para a reacção de controlo positivo fornecido com o kit deve ser 1,5 após 20 min de reacção. As amostras foram definidos como a telomerase-se a absorvância positiva ajustado foi . 0,2

A citometria de fluxo para medir o crescimento celular e proliferação

SW480 transfectadas células durante 48 h com Lipofectamine 2000 sozinho, ou NC-shRNA hTERT-shRNA, ou não transfectada esquerda no meio de cultura como um branco de controlo, foram colhidas, lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e fixadas durante a noite com 66% de etanol. As células foram centrifugadas e lavadas com PBS, depois incubadas com 50 ug iodeto de propídio /ml e 2,5 ug /ml de RNase em PBS durante 30 min à temperatura ambiente. teor de ADN foi analisada através de citometria de fluxo em um comprimento de onda de emissão de 488 nm, utilizando o software Multicycle (BD Biosciences, EUA) [21]. O índice de proliferação (PI) foi calculada de acordo com a fórmula:

PI = [S + (G2 /M)] /{(G0 /G1) + [S + (G2 /M)]} x 100 %.

a citometria de fluxo para medir a apoptose

a apoptose foi medida por células de dupla coloração para anexina V e DNA (iodeto de propídio) e analisá-los por citometria de fluxo. células SW480 transfectadas durante 48 h, com Lipofectamine 2000 sozinho, NC-shRNA ou hTERT-shRNA foram cultivadas na presença das concentrações indicadas de pristimerina, colhidas, lavadas com PBS e incubadas em Anexina V Binding Buffer (BD Pharmingen) contendo 0,3% FITC-anexina V conjugada durante 15 min à temperatura ambiente. As células foram lavadas e ressuspensas em Tampão de Ligação Anexina V. O iodeto de propídio foi adicionado imediatamente antes da citometria de fluxo [21] – [22]. Os dados foram analisados ​​usando FACSDiva Software (BD Biosciences).

TUNEL para medir a apoptose

The Dead End colorimétrico TUNEL System (Kaiji, Nanjing, China) foi utilizado para medir a apoptose nas culturas SW480 transfectadas com Lipofectamine 2000 sozinho, NC-shRNA ou hTERT-shRNA, bem como em ratinhos nus injectados com solução salina, NC-shRNA ou plasmídeos hTERT-shRNA (ver abaixo). Para experiências in vitro, células SW480 foram plaqueadas em lamelas de 2,5 cm e transfectadas, durante 48 h, após o que lamelas foram removidos e fixados para o ensaio de TUNEL de acordo com o protocolo do fabricante. Para experimentos in vivo, fatias de tecido tumoral (5 mm de espessura) foram preparados. As lâminas foram fixadas em formol a 10% PBS-tamponada (Kaiji, Nanjing, China) e permeabilizadas com proteinase K (Kaiji). Em seguida, as lâminas foram processados ​​tal como descrito pelo fabricante.

As lâminas foram ensaiadas para células apoptóticas seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, recombinante desoxinucleotidil-transferase terminal foi usado para adicionar nucleótidos biotinilados para o citrato de ADN, cloreto de sódio e de sódio foram adicionados para parar a reacção, e, em seguida, as lâminas foram incubadas com estreptavidina de rábano marcada com peroxidase. Finalmente, as lâminas foram incubadas com uma mistura de peróxido de hidrogénio, o cromogénio diaminobenzidina, e o substrato da peroxidase, de modo a manchar os núcleos castanho escuro. lâminas coradas foram depois analisadas por microscopia de luz usando um sistema de captura de imagem (Leica, Alemanha). Pelo menos 3 campos de elevada ampliação foram examinados em cada lâmina ( 500 células no total)., E o índice apoptótico (IA) foi calculada como a percentagem de células observadas TUNEL positivo

microscopia

electrónica de transmissão ( TEM) para avaliar a morfologia apoptótica

células SW480 foram transfectadas durante 48 horas com Lipofectamine 2000 sozinho, NC-shRNA ou hTERT-shRNA e depois colhidas. As células foram sedimentadas, imediatamente fixado em 3% (v /v) de glutaraldeído, fixadas posteriormente em 1% (v /v) de tetróxido de ósmio e coradas com acetato de uranilo a 4,8%. Após a desidratação através de uma série graduada de soluções de álcool, as amostras foram lavadas em óxido de propileno e impregnado com resina epóxi. As secções ultrafinas foram tratados com acetato de uranilo e citrato de chumbo para proporcionar contraste de MET, a qual foi realizada usando um microscópio JEM-1230 (JEOL, Japão).

Medição do potencial de membrana mitocondrial (MMP) para avaliar a apoptose

MMP foi medida usando rodamina 123 corante fluorescente como indicador (CAS 83702; Sigma, Xangai, China) como anteriormente descrito [23]. Este corante tem um máximo de excitação a 488 nm e um máximo de emissão a 526 nm. Nesta abordagem, o MMP é assumido que variam inversamente com rodamina 123 fluorescência. células SW480 foram transfectadas durante 48 horas com Lipofectamine 2000 sozinho, NC-shRNA ou hTERT-shRNA, em seguida, lavada duas vezes com PBS para remover as células mortas e incubadas com rodamina 123 (0,1 ug /mL) a 37 ° C durante 30 min. Rodamina 123 intensidade de fluorescência foi medida utilizando microscopia confocal de varrimento (Nikon-AE, Japão). Para cada condição experimental, a média de intensidade de fluorescência foi determinada para 500 células.

hTERT knock-down em um modelo de tumor de rato nu

células SW480 foram injectados por via subcutânea no flanco direito de ratinhos nus em um dose de 5 × 10

7 células por ratinho em 200 ul de DMEM diluída 1:02 em PBS [24]. Quando os nódulos do tumor tinha crescido a 7 mm, os murganhos foram divididos aleatoriamente em três grupos de 8 animais, em cada grupo que recebeu um total de 6 injecções intratumorais de solução salina normal, 20 ug NC-shRNA ou 20 ug hTERT-shRNA cada 2 dias . Os animais foram observados durante 6 dias após a última injecção de shRNA [25]. comprimento do tumor (G), a largura (W) e o diâmetro foram medidos duas vezes por semana; o volume do tumor (cm

3) foi calculada usando a fórmula W

2 × (L /2) [26]. Os ratos foram mortos e amostras de tumor fixados em formol neutro foram coradas com hematoxilina-eosina e examinadas por microscopia de luz.

foram determinados níveis de mRNA hTERT e proteína nos três grupos de ratos nus, respectivamente, por RT- PCR e imuno-histoquímica, tal como descrito acima. A atividade da telomerase e extensão da apoptose utilizando o ensaio TUNEL também foram medidos como descrito acima.

A análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± SD. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS 16.0 (IBM, EUA). As diferenças entre as condições de tratamento foram avaliadas para a significância estatística usando ANOVA de uma via, seguido pelo método LSD ou teste t de Dunnett. O limite de significância foi definido como

P

. 0,05

Resultados

expressão hTERT endógena em linhas celulares de cancro do cólon

Primeiro, exibiu o SW480 , DLD-1, e em linhas HT29 para identificar qual teve suficientemente elevada expressão de ARNm da hTERT de facilitar a interferência de ARN e a análise dos efeitos sobre o crescimento celular. RT-PCR demonstrou que os níveis de ARNm da hTERT foram apenas detectável em células DLD-1 e significativamente mais elevada em células SW480 do que em células HT29 (0,827 ± 0,037

vs

0,705 ± 0,051,

P .

0,05; Fig. 1A). Portanto SW480 células foram escolhidos para um estudo mais aprofundado.

(A) expressão endógena hTERT mRNA em SW480, DLD-1 e células HT29 linhas. Houve diferenças significativas entre SW480, HT29 e células DLD-1 (

#

P Art 0,01), e entre SW480 e células HT29 (*

P Art 0,05). (B) A potência de hTERT ARNic em células SW480. Os níveis de ARNm da hTERT foram significativamente inferiores nas células transfectadas com ARNsi de hTERT em culas transfectadas com o controlo negativo (CN) shRNA ou Lipofectamina sozinho (Lipo). *

P Art 0,05,

#

P Art 0,01, em comparação com os grupos NC-shRNA e Lipo. Os resultados são a média ± SD de três experiências independentes.

Triagem para o mais potente hTERT siRNA em culturas SW480

Três hTERT-siRNAs (hTERT-966, hTERT-2862, hTERT- 2985) e um siRNA não relacionado como controlo negativo (CN-siARN) foram transientemente transfectados em células SW480 para identificar o siRNA que mais potentemente suprimida nível de ARNm da hTERT, assim como para confirmar a especificidade de hTERT nossa abordagem siARN. As células de controlo transf ectadas com Lipofectamina reagente sozinho ( “Lipo”) ou com NC-siRNA apresentaram níveis semelhantes de ARNm da hTERT (0,823 ± 0,025 e 0,815 ± 0,043, respectivamente;

P

0,05). A transfecção com qualquer um dos três hTERT-siRNAs aumentaram significativamente mais baixos do que os níveis de ARNm da hTERT de transfecção com NC-siRNA ou Lipo sozinho (Figura 1B.): HTERT-966, 0,395 ± 0,075; hTERT-2862, 0,650 ± 0,064; hTERT-2985, 0,270 ± 0,056 (todo o

P Art 0,05). Dos três sequências de hTERT siRNA testados, hTERT-2985 foi identificado como o mais potente e, portanto, foi usado para construir um plasmídeo de expressão eucariótica hTERT-shRNA para posterior in vitro e in vivo.

A expressão de hTERT-shRNA em células SW480 para baixo-regula mRNA e expressão de proteína

Nós transfectadas SW480 células com hTERT-shRNA ou NC-shRNA por 24, 48 e 72 h, em seguida, expressão medida de mRNA e proteína hTERT. Em 48 h transfecção, culturas de controlo mostraram níveis de mRNA semelhantes: meio de cultura (Branco), 0,530 ± 0,032; Lipofectamine sozinho (Lipo), 0,483 ± 0,075; NC-shRNA, 0,447 ± 0,058. Os níveis de ARNm foram significativamente menores após 48 horas de transfecção com hTERT-shRNA (0,322 ± 0,030;

P

0,05 ou

P

0,01; Fig. 2A). De facto, a redução do ARNm da hTERT foi já observado após 24 horas de transfecção. No entanto, há diferenças na expressão de mRNA hTERT foram encontrados entre os grupos após 72 h de transfecção (Fig. 2A).

(A) análise de RT-PCR da expressão de mRNA hTERT em culturas SW480 após mock-transfecção com a cultura meio sozinho (branco), Lipofectamine sozinho (Lipo), siRNA controle negativo (NC-shRNA), ou hTERT-shRNA. Níveis de níveis de mRNA foram significativamente menores após 48 horas de transfecção com hTERT-shRNA do que após transfecções de controlo.

▴

P Art 0,05,

#

P Art 0,01, em comparação com o Branco; *

P Art 0,05, em comparação com Lipo e NC-shRNA. (B) A imunocitoquímica da expressão da proteína de hTERT. (A) As células em branco, (b) células Lipo, células NC-shRNA (c), e (d) As células hTERT-shRNA. Todos os pontos de vista, × 400. Maior valor em escala de cinza indica o nível mais baixo de proteína. Os níveis de proteína foram significativamente menores após 48 horas de transfecção com hTERT-shRNA do que após transfecções de controlo.

#

P Art 0,01, em comparação com os outros grupos; *

P Art 0,05, em comparação com o Branco. (C) hTERT regulação negativa inibe a actividade da telomerase. a actividade de telomerase [absorvância corrigida (450 nm-630 nm)] foi significativamente menor em células transfectadas com hTERT-shRNA do que em células de controlo. *

P Art 0,05, em comparação com o Lipo e controlos em branco. Os resultados são SD ± média de três experiências independentes.

Resultados semelhantes foram obtidos quando examinamos a expressão da proteína hTERT. Embora as três transfecções de controlo levou a coloração amarela forte membrana nuclear com partículas castanhos abundantes nos núcleos, transfecção com hTERT-shRNA levou a coloração muito mais fraca (Fig. 2B, a-d). A determinação quantitativa das intensidades da escala de cinzentos, que variava inversamente com o nível de proteína hTERT, mostrou que 48-H transfecção com hTERT-shRNA levou a níveis muito mais baixos de proteína (209.600 ± 17,101) do que a transfecção com meio de cultura sozinhos (146,500 ± 22,325), Lipofectamine sozinho (151,800 ± 24,478) ou NC-shRNA (167,350 ± 37,754) (

P Art 0,01; A Fig. 2B). Após 72 h de transfecção, embora uma diferença significativa persistiu entre hTERT-shRNA eo controle em branco (239.500 ± 9,546 vs. 223,950 ± 10.259,

P Art 0,05; A Fig. 2B), não houve diferença significativa entre hTERT-shRNA e NC-shRNA. Estes resultados provavelmente reflecte o facto de que o nosso vector de expressão está destinado a estudos de expressão de curto prazo, uma vez que não se integra no genoma do hospedeiro. Por isso realizamos todos os demais experimentos in vitro para 48 h.

hTERT infra-regulação inibe a atividade da telomerase em células SW480

Foram observados níveis semelhantes de atividade da telomerase em células SW480 transfectadas por 48 h com meio de cultura (2,756 ± 0,089), Lipofectamine sozinho (2,693 ± 0,225) ou NC-shRNA (2.691 ± 0.119). Em contraste, 48-H transfecção com hTERT-shRNA aumentaram significativamente menor actividade da telomerase (2,242 ± 0,284;

P 0,05

; A Fig. 2C).

hTERT regulação negativa reduz o crescimento e proliferação de células SW480

A percentagem de células na fase G0 /G1 foi significativamente mais elevada após 48 horas de transfecção com hTERT-shRNA (49,37 ± 1,63%) do que após a transfecção com meio de cultura sozinhos (42,27 ± 2,76%) , Lipofectamina sozinho (42,43 ± 4,67%) ou NC-shRNA (37,07 ± 1,53%, P 0,05). Ao mesmo tempo, o Índice de proliferação foi muito mais baixa após a transfecção com hTERT-shRNA (50,6 ± 1,57%) do que após a transfecção com NC-shRNA (59,03 ± 5,86%, P 0,05); o índice foi semelhante para os três grupos de controlo (Fig. 3a).

(A) hTERT-shRNA reduz o crescimento e proliferação de células SW480. A percentagem de células na fase G0 /G1 foi significativamente maior e o índice de proliferação foi muito mais baixa após a transfecção com hTERT-shRNA do que após transfecções de controlo. *

P Art 0,05, em comparação com os outros três grupos;

#

P Art 0,05, em comparação com NC-shRNA. (B) hTERT-shRNA aumenta a apoptose de células SW480. As células foram transfectadas com (a) hTERT-shRNA ou (b) NC-shRNA, corados com diaminobenzidina (marrom) e contra-coradas com hematoxilina (azul) para rotular núcleos. As imagens são resultados representativos de três experiências independentes. Ampliação, × 400. O índice apoptótico (IA) foi significativamente mais elevada em células transfectadas com hTERT-shRNA.

#

P Art 0,01, em comparação com os outros três grupos. (C) análise de Microscopia Electrónica de Transmissão de células SW480 transfectadas com (a-c) hTERT-shRNA ou (d) NC-shRNA. morfologia apoptótica foi visível em células transfectadas com hTERT-shRNA. Ampliação, × 3800. (D) Rodamina 123 análise da intensidade de fluorescência de células SW480 transfectadas com (a) meio de cultura sozinhos (em branco), (b) sozinho Lipofectamina (Lipo), (c) CN-shRNA ou (d) da hTERT-shRNA. As células coradas foram analisadas por microscopia confocal de varrimento; maior intensidade de fluorescência indica potencial de membrana mitocondrial inferior. Ampliação, × 400. As células transfectadas com hTERT-shRNA mostraram significativamente maior do que a rodamina 123 fluorescência fez células de controlo. *

P Art 0,05, em comparação com NC-shRNA ou Lipo;

#

P Art 0,01, em comparação com branco. Os resultados são a média ± SD de três experiências independentes.

hTERT infra-regulação aumenta a apoptose de células SW480

Em contraste com células de controlo transfectadas, células transfectadas com hTERT-shRNA foram encolhida na aparência; eles mostraram coloração profunda-castanha na membrana celular, citoplasma ou no núcleo; e, ocasionalmente, continha os corpos apoptóticos (Fig. 3B, a-b). TUNEL coloração revelou que a proporção de células apoptóticas foi muito mais elevada após a transfecção com hTERT-shRNA [índice de apoptose (AI) = 22,2 ± 4,25%] do que após a transfecção com o meio de cultura por si só (1,98 ± 1,05%), Lipofectamine sozinho (2,2 ± 1,20 %) ou NC-shRNA (2,4 ± 1,25%; todos

P Art 0,01; A Fig. 3B). análise TEM também revelado que uma grande proporção de células transfectadas com hTERT-shRNA tinham morfologia apoptótica, incluindo volume reduzido, números reduzidos de microvilosidades e protuberâncias, e a acumulação de cromatina irregular sob a membrana nuclear (Fig. 3C, a). Alguns núcleos celulares foram em forma de crescente, circulares ou pesado, e muitas células continham numerosos vacúolos (Fig. 3C, b-c). Em contraste, as células transfectadas com controlo apresentaram estrutura interna normal (Fig. 3C, d).

Como uma medida adicional de apoptose, foram utilizadas rodamina 123 como um índice de MMP (Fig. 3D, a-d) ; Neste ensaio, a intensidade mais elevada de corante inferior indica MMP, a qual está associada com apoptose. As células transfectadas com hTERT-shRNA mostraram significativamente maior rodamina 123 fluorescência (719,998 ± 17,083) do que as células transf ectadas com meio de cultura por si só fez (545,833 ± 6,811,

P

0,01), NC-shRNA (585,361 ± 51,781,

P Art 0,05) ou Lipofectamine sozinho (632,169 ± 65,635,

P Art .. 0,05) (Fig 3D)

hTERT-shRNA inibe o crescimento de células tumorais

in vivo

Um modelo de tumor xenoenxerto foi estabelecido através da injecção de ratinhos nus com células SW480 e depois injetar os tumores resultantes com NC-shRNA ou hTERT-shRNA. Medição periódica do tamanho do tumor mostrou que em 31 dias, os tumores tratados com hTERT-shRNA (0,248 ± 0,102 cm

3) foram significativamente menores do que os tumores tratados com solução salina (0,543 ± 0,230 cm

3,

P

0,05) ou NC-shRNA (0,580 ± 0,293 cm

3,

P Art 0,01;. A Fig. 4A)

(A) hTERT-shRNA inibe tumor o crescimento celular. O crescimento do tumor em 31 dias foi significativamente mais lento em tumores tratados com hTERT-shRNA do que em tumores tratados com solução salina (*

P Art 0,05) ou NC-shRNA (

#

P

0,01). (B) O exame histopatológico do tecido tumoral SW480 enxertados em ratos nus e tratados com hTERT-shRNA. O tecido tumoral foi biopsiado em 31 dias e coradas com hematoxilina-eosina. A seta em (a) indica necrose folha; a seta em (b) indica a inversão do nucleoplasma ao volume do citoplasma, em conjunto com a patologia mitótico. Ampliação, × 200. Análise (C) RT-PCR para medir a expressão do ARNm da hTERT em tecido de tumor tratados com solução salina (pistas 1-8), NC-shRNA (pistas 9-16), ou hTERT-shRNA (pistas 17-24). M, escada de DNA de 100 pb. A expressão relativa de ARNm da hTERT foi significativamente menor nos ratinhos hTERT-shRNA. *

P Art 0,05, em comparação com a solução salina e grupos NC-shRNA. (D) A imunocitoquímica da proteína de hTERT (corado castanho) em tecido de tumor tratados com (A) solução salina, (b) NC-shRNA, ou (c) hTERT-shRNA. Ampliação, × 200. valores em escala de cinzentos mais altos indicam níveis mais baixos de proteína. A expressão relativa de proteína hTERT foi significativamente menor nos ratinhos hTERT-shRNA. # P 0,01, comparado com o soro fisiológico e grupos NC-shRNA. (E) Efeito da hTERT-shRNA sobre a actividade da telomerase in vivo. A absorvância ajustado (450 nm – 630 nm) era significativamente inferior nos tumores tratados com hTERT-shRNA do que em tumores tratados com solução salina (*

P

0,05) ou NC-shRNA (

#

P

0,01). (F) Efeito de hTERT-shRNA na apoptose. Os tumores foram injectados regularmente com (a) solução salina, (b) NC-shRNA ou (c) hTERT-shRNA, em seguida, feita a biópsia e coradas com diaminobenzidina (castanho); núcleos foram contra-coradas com hematoxilina (azul). As imagens são resultados representativos de três experiências independentes. Ampliação, × 200. O índice apoptótico (IA) foi significativamente mais elevada em tumores tratados com hTERT-shRNA do que em tumores tratados com solução salina ou NC-shRNA.

#

P

. 0,01, em comparação com os dois grupos de controle

hTERT-shRNA inibe a expressão hTERT e da atividade da telomerase

in vivo

Após 31 dias de tratamento com solução salina, NC-shRNA, ou hTERT-shRNA, a expressão relativa de ARNm da hTERT foi significativamente menor nos ratinhos hTERT-shRNA (0,388 ± 0,093) do que na solução salina (0,809 ± 0,335) ou