Abstract

O medicamento contra o câncer ruxolitinib é um inibidor Janus quinase potente aprovado para o tratamento das neoplasias mieloproliferativas. Além disso, ruxolitinib tem actividade inibidora fraca contra um painel de outras cinases, incluindo Src quinase. Não há nenhuma informação estrutural de ruxolitinib ligação a qualquer quinase. Neste trabalho, nós determinamos a estrutura cristalina do domínio quinase c-Src no complexo de ruxolitinib com uma resolução de 2,26 Å. domínio C-Src quinase adopta a ruxolitinib DFG-na conformação activa após ruxolitinib ligação, indicando que é um tipo de inibidor de c-Src. Ruxolitinib forma duas pontes de hidrogênio com Met341, uma ligação de hidrogênio mediada por água com Thr338, e um número de van der Waals contatos com c-Src. Ruxolitinib foi então encaixado dentro do bolso de ligação ao ligando de uma estrutura de JAK1 previamente resolvido. A partir do resultado de encaixe, também se liga ruxolitinib JAK1 como um inibidor do tipo I, com mais interacções e um maior complementaridade de forma com o bolso de ligação ao ligando de JAK1 comparada com a de c-Src. Desde ruxolitinib é um relativamente pequeno inibidor e há cavidade considerável entre ruxolitinib e c-Src bolso de ligação ao ligando, propomos modificar ruxolitinib para desenvolver inibidores mais potentes para c-Src

Citation:. Duan Y, Chen L, Chen Y, Fan Xg (2014) c-Src liga-se ao cancro da droga ruxolitinib com uma conformação activa. PLoS ONE 9 (9): e106225. doi: 10.1371 /journal.pone.0106225

editor: Wenqing Xu, da Universidade de Washington, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de maio de 2014; Aceito: 28 de julho de 2014; Publicação: 08 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Duan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. coordenadas atômicas e fator de estrutura foram depositados junto do Protein Data Bank www.rcsb.org com números de adesão 4U5J

Financiamento:. Este trabalho é apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (YC, números de projeto 81272971 e 81372904) e National Institutes of Health (NIH) (LC, 5R01GM064642). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as proteína-quinases catalisam a transferência de um grupo fosfato do trifosfato de adenosina (ATP) para resíduos de serina, treonina ou tirosina de proteínas substrato suas [1]. Tais modificações pós-tradução servir como um mecanismo para modular a actividade enzimática ou interacções moleculares de proteínas de substrato em resposta a sinais endógenos e exógenos [1]. A fosforilação desempenha um papel crítico na transdução de sinal e regula numerosos processos celulares, incluindo a adesão celular, invasão, a proliferação, a sobrevivência e a angiogénese [2]. A sobre-expressão ou mutações de cinases de proteína pode conduzir a uma variedade de doenças humanas, tais como cancro e auto-imunidade. As proteína-quinases são alvos terapêuticos para o tratamento de doenças humanas [3]. Um exemplo prototípico, imatinib, tem como alvo BCR-ABL, uma forma constitutivamente activa da cinase Abl que leva a leucemia mielóide crónica (LMC), e é muito bem sucedida no tratamento desta doença [4].

Como de um elevado grau de conservação da sequência no domínio cinase, não é surpreendente que a maioria dos inibidores de quinase tendem a ter especificidade de alvo limitada. Fora do alvo efeitos pode ser benéfica em alguns casos, mas pode levar a efeitos colaterais em outros casos. Cada inibidor da cinase tem o seu espectro de destino único e altamente imprevisível [5]. Compreender o mecanismo por trás da especificidade meta é uma meta importante que aumentaria o uso de inibidores da quinase existentes e beneficiar o processo de desenvolvimento de inibidores. Por exemplo, a informação estrutural de cinase de ligação Imatinib não só foi estudado em complexo com o seu alvo pretendido quinase Abl [6], mas também estudado em complexo com outras quinases, incluindo c-Src, Lck, p38 [7] – [9] . Estes estudos de grande ajuda-nos a compreender a base da inibição da quinase, seletividade e potenciais efeitos fora do alvo. Além disso, estes estudos fornecem uma estrutura de suporte estrutural para o desenvolvimento de novos inibidores da quinase de quinases diferentes

inibidores da proteína cinase são tipicamente divididos em três subtipos:. Tipo I, tipo II e tipo III inibidores. Tipo I inibidores ocupar a bolsa cheia, principalmente por ATP, e Asp-Phe-Gly (DFG) motivo cataliticamente importante é mantido na conformação activa (referido como DFG-na conformação). Um exemplo típico de um inibidor de cinase de tipo I é a segunda geração de inibidores da BCR-Abl, dasatinib. inibidores do tipo II, tais como imatinib, ocupar a bolsa de ligação ao ATP e uma região adicional, e o motivo DFG é rodado por ~180 ° com respeito à conformação activa (referido como DFG-a conformação) [10] – [12 ]. inibidores do tipo III ligar domínios de regulação fora do bolso de ligação de ATP, e modulam a actividade de quinase de uma forma alostérica. Uma vez que os aminoácidos fora do bolso de ligação a ATP são menos conservadas em relação àquelas no bolso, foi proposto que pode ser mais fácil de conseguir a selectividade de quinase com inibidores tipo II ou tipo III.

um único resíduo de dentro do ATP local de proteína-quinases, denominado o gatekeeper, desempenha um papel importante na formação da bolsa de especificidade, sensibilidade e controla a uma variedade de inibidores de moléculas pequenas. O resíduo gatekeeper varia entre diferentes proteínas cinases. Algumas cinases ter um resíduo pequeno (por exemplo, Thr, Ala ou Gly) nesta posição, e são prontamente alvo de estruturalmente diversas classes de inibidores. Outras cinases possuem um resíduo maiores (e.g. Phe) nesta posição, e são mais resistentes [13]. A mutação do resíduo gatekeeper é um mecanismo comum da resistência a inibidores de cinase. Por exemplo, a substituição de BCR-Abl gatekeeper Thr-315 para Ile levou a resistência ao imatinib [14] – [16].

ruxolitinib é um inibidor potente da cinase Janus para o tratamento das neoplasias mieloproliferativas (NMP ) [17]. Ele tem uma actividade inibidora potente contra JAK1 (IC

50 = 3,3 nM) e JAK2 (IC

50 = 2,8 nM), atividade moderada contra TYK2 (IC

50 = 19 nM) e fraca actividade contra JAK3 ( IC

50 = 428 nM) e um painel de outras cinases, incluindo Src-quinase [18], [19]. mutações JAK2 e activação desempenhar um papel fundamental na etiologia de NMP humanos. Por exemplo, cerca de metade dos pacientes com NMP realizar uma mutação de ganho de função no gene JAK2 (V617F JAK2) [17], [18]. Ruxolitinib inibe a JAK2 desregulado via de sinalização, e mostrou benefícios significativos em ensaios clínicos. Em 2011, ruxolitinib foi aprovado para o tratamento da mielofibrose intermediário ou de alto risco [20].

Não há informações estrutural da ruxolitinib ligação a qualquer quinase. Neste trabalho, investigamos a base estrutural para a ligação ruxolitinib a uma quinase, usando domínio c-Src quinase como um sistema protótipo. Ao determinar a estrutura de um complexo ruxolitinib em 2,26 Å de resolução, que mostrou que o domínio de quinase c-Src adopta a conformação activa DFG-no. Ruxolitinib forma duas pontes de hidrogênio com Met341, uma ligação de hidrogênio mediada por água com Thr338, e um número de van der Waals contatos com c-Src. Em seguida, acoplado ruxolitinib para o bolso de ligação ao ligando de uma estrutura de JAK1 previamente resolvido. Do nosso resultado de encaixe, também se liga ruxolitinib JAK1 como um inibidor do tipo I, com mais interacções e maior a complementaridade de forma com o bolso de ligação ao ligando de JAK1 do que a de c-Src. Uma vez que existe cavidade considerável entre ruxolitinib eo bolso de ligação do ligando c-Src, é altamente possível modificar ruxolitinib para desenvolver inibidores mais potentes para c-Src.

Métodos

Protein Expression and a purificação

galinha c-Src (resíduos 251-533) foi preparado como previamente descrito [21]. Em resumo, a proteína foi expressa com uma 6 × marcada com His em células de Escherichia coli BL21DE3, na presença da fosfatase YopH. A proteína foi purificada primeiro por pérolas de Ni-NTA. A 6 × His-tag foi, em seguida, removido por clivagem de TEV. Após clivagem, a cromatografia de permuta aniónica e cromatografia de exclusão de tamanho foram utilizadas para purificar ainda mais a proteína. A proteína em Tris 50 mM (pH 8,0), 100 mM de NaCl, 5% de glicerol, 1 mM de DTT foi concentrada para 10 mg /ml e rapidamente congelados para armazenamento a -80 ° C.

A cristalização

o c-Src cristais /ruxolitinib foram obtidos a 18 ° C utilizando o método de difusão de vapor de gotas de suspensão. O complexo de c-Src /ruxolitinib foi misturado numa solução de 170 uM c-Src, 2000 ruxolitinib uM, DMSO a 10%, Tris 50 mM (pH 8,0), 100 mM de NaCl, 5% de glicerol, 1 mM de DTT. A solução reservatório contém 0,1 M de MES (pH 6,4), 2% de glicerol, 8% de PEG 4000, acetato de sódio 50 mM, MgCl2 10 mM. Os cristais foram crioprotegidos em solução reservatório acrescido de 20% de glicerol e 2,000 uM ruxolitinib. Cristal pertence à P1 grupo de espaço com dimensões celulares de

a

= 42,107 Â,

b

= 63,228 Â,

c

= 73,989 Â, α = 79,27 °, β = 89,27 °, γ = 90,29 °.

Recolha de dados e Estrutura de Determinação

os dados foram coletados no Centro de Shanghai Synchrotron Radiation (SSRF), BL17U beamline, eo avançada Fonte de Luz (Lawrence Berkeley Laboratório nacional) beamlines 5.0.2 e 8.2.1. Os dados foram reduzidos utilizando HKL2000 [22]. a determinação da estrutura foi realizada tal como descrito anteriormente [23], [24]. determinação fase inicial foi realizada por substituição molecular com Phaser do pacote CCP4 [25], usando uma cadeia de uma estrutura de c-Src previamente resolvido (código PDB 2SRC) [26], como o modelo de busca. A estrutura foi refinada usando Phenix.refine e coot a partir do pacote de Phenix [27]. As estatísticas da análise cristalográfica são apresentados na Tabela 1. As representações gráficas de estrutura foram preparados utilizando PyMOL (DeLano Scientific, San Francisco, CA). As coordenadas e fatores estruturais foram depositados no Protein Data Bank com 4U5J código de adesão.

Docking Molecular e análise estrutural

encaixe Molecular foi realizada utilizando Molsoft ICM-Pro [28 ]. Ruxolitinib foi encaixado dentro do bolso de ligação ao ligando de JAK1 (código PDB: 3EYG) [29]. Volume do bolso de ligação ao ligando foi calculada usando POCASA [30]. Diagramas de interacções proteína-ligando foi gerado usando ligplot [31].

Ensaios de Quinase

c-Src (diluída em Tris 50 mM pH 7,5, EGTA 0,1 mM, 0,1% β-mercaptoetanol, 1 mg /ml de BSA) foi ensaiado contra KVEKIGEGTYGVVYK em um volume final de 25,5 ul contendo Tris 50 mM pH 7,5, EGTA 0,1 mM, KVEKIGEGTYGVVYK 0,3 mM, acetato de magnésio 10 mM e 0,05 mM de [33P-γ-ATP] (50-1000 cpm /pmol) e incubou-se durante 30 min à temperatura ambiente. Os ensaios foram interrompidos por adição de 5 ul de H (3%) de ácido ortofosfórico 0,5, colhidas em placas de P81 Unifilter com um tampão de lavagem de 50 mM de ácido fosfórico em solução, e secou-se ao ar. As placas Unifilter secos foram então seladas na adição de MicroScint O e foram contadas num Packard Topcount contadores de cintilação NXT.

Resultados e Discussão

ruxolitinib ligação à bolsa de ligação ao ATP de c-Src

para ver como medicamento contra o câncer ruxolitinib interage com uma quinase, determinamos a estrutura de raios-X da c-Src em complexo com ruxolitinib a uma resolução de 2,26 Å. As estatísticas de recolha de dados e refinamento do modelo estão listadas na Tabela 1. Cada unidade assimétrica contém duas moléculas de c-Src. Há densidade de elétrons bem definido para ruxolitinib em ambas as moléculas de c-Src, o que parece estar ligado com ocupação total (Figura S1). A estrutura da c-Src é composto de uma arquitetura de bi-lobadas (N-lobo e C-lobo) que é típico para tirosina-quinases de proteína. O sítio de ligação ATP da quinase c-Src está localizado na fenda entre os lóbulos de dobragem N- e C-terminais, rodeado por região de dobradiça, P-loop, Helix CA e ansa de activação (Figura 1A). Parte da ansa de activação (aminoácidos 412-423) apresenta nenhuma densidade electrónica, indicando esta região é flexível. Portanto, esta região não está incluído no APO.

(A) estrutura geral do complexo de c-Src /ruxolitinib. (B) Os anéis de pirrolopirimidina formar duas ligações de hidrogénio com os átomos da cadeia principal de Met341. (C) ruxolitinib forma uma interação mediada por água com resíduo Src gatekeeper Thr338.

ruxolitinib se liga na cavidade de ligação de ATP de c-Src, com densidade de elétrons inequívoca observado para o inibidor (Figura S1) . Ele é orientado de tal modo que os anéis de pirrolopirimidina apontam para a região de charneira, os pontos de anel ciclopentano em relação a C-lobo, enquanto que os pontos de grupo propanonitrilo em relação a ansa P (Figura 1A). Os anéis de pirrolopirimidina formar duas ligações de hidrogénio com os átomos da cadeia principal de Met341 (Figura 1B), bem como uma interacção mediada por água com resíduo gatekeeper Src Thr338 (Figura 1C). Além das ligações de hidrogénio, ruxolitinib forma também um número de contactos de van der Waals com c-Src (Figura S2).

DFG motivo localiza na extremidade N-terminal da ansa de activação, a sua conformação e desempenha um pivot papel na actividade de quinase [32]. DFG-in e DFG-out conformações representam dois estados extremos de um continuum de possibilidades [32]. estados intermédios são observados em alguns casos [26]. Três conformações diferentes dos domínios de cinase das cinases da família Src: a DFG-na conformação activa, uma conformação inactiva DFG-intermédia, e uma conformação inactiva DFG-para fora [32]. No DFG-in conformação (Figura 2A e 2B, pdbs 3LCK e 3DQW), as faces da cadeia lateral Aspartato para o local de ligação de ATP, e as faces da cadeia lateral fenilalanina na proteína. Na conformação DFG-out (Figura 2E, 2OIQ APO), a espinha dorsal do motivo DFG é invertida, a cadeia SDIE aspartato fica virado para fora a partir do local de ligação de ATP, enquanto que a cadeia lateral de fenilalanina ocupa o local de ligação de ATP. Por exemplo, o domínio de cinase de c-Src adopta DFG-a conformação após a ligação ao imatinib [33]. Na conformação DFG-intermediário (Figura 2D, 2SRC APO), o DFG-motif adota uma conformação entre os dois acima conformações. Comparou-se a conformação DFG-motif no complexo de Src /ruxolitinib com estes três conformações. Aparentemente, após ligação ruxolitinib, domínio de c-Src quinase é mantido em DFG-em conformação (Figura 2C)

(A) activo Lck DFG-na conformação. (PDB: 3LCK); (B) ativa c-Src T338I DFG-in conformação (PDB: 3DQW); (C) ativa c-Src DFG-in conformação no complexo de Src /ruxolitinib (este trabalho); (D) inativa c-Src na conformação Src /CDK, DFG-intermediário (PDB: 2SRC); (E) inativa c-Src DFG-out conformação em src /Imatinib complexo (PDB: 2OIQ).

O domínio quinase de c-Src adota diferentes conformações na ligação de diferentes inibidores. No c-Src complexo /Imatinib, Imatinib ocupa não só o local de ligação de ATP, mas também se estende para além do motivo DFG e ocupa uma região adicional. O motivo DFG está na conformação DFG-out (Figura 3A). No complexo de c-Src /ruxolitinib, ruxolitinib ocupa apenas o local de ligação de ATP, e c-Src adota uma DFG-in conformação. A ansa P se move para mais perto do lóbulo-C, que conduz a um local de ligação ao ATP mais apertado. Isto poderia ser devido a um mecanismo de ajuste induzido (Figura 3B). Com base nestas observações, Imatinib é um inibidor do tipo II para c-Src, enquanto ruxolitinib é um tipo I inibidor para c-Src.

(A) Capacidade de bolso de Imatinib no c-Src /Imatinib complexo (APO : 2OIQ). estrutura de C-Src é mostrado em desenhos animados, colorido em magenta. Imatinib é mostrado na esfera. (B) a ocupação do bolso de ruxolitinib no complexo de c-Src /ruxolitinib (este trabalho). estrutura de C-Src é mostrado em desenhos animados, colorido em amarelo. Ruxolitinib é mostrado na esfera.

A maioria dos inibidores da quinase são ATP-competitiva e pertencem ao tipo I inibidores. O bolso de ligação ao ATP é conservada entre os membros da família cinase. Além do bolso de ligação ao ATP, de tipo II inibidor se liga a um bolso adicional menos conservada. Tipo II atos inibidor de indução de uma alteração de conformação de tal modo que a quinase não é mais capaz de funcionar. Propõe-se que inibidor de tipo II poderia conseguir uma melhor seletividade. No entanto, a eficácia biológica, especialmente a eficácia clínica, será o árbitro final.

Comparação das bolsas de ligação em Src e JAK

ruxolitinib é um inibidor da quinase Janus, com relatados IC

50 valores de 2,8 nM para JAK2, 3,3 nM para JAK1, 19 nM para TYK2, e 428 nM para JAK3 [18]. Lck, uma cinase da família Src, é inibida por ruxolitinib com um IC

50 valor reportado de 3,6 uM de [19]. Usando ensaios de quinase, descobrimos que ruxolitinib inibida c-Src com um IC

50 de 2,92 uM (Tabela S1). Portanto, quinases Src são inibidas por ruxolitinib em muito menor grau do que JAK quinases. A identidade de sequência entre Src e quinases JAK família é ~34% no domínio de cinase (Figura 4A 4B). Além do fato que JAK quinases tem vários trechos adicionais de aminoácidos (Figura 4A, em destaque na caixa verde), foram identificadas várias outras diferenças fundamentais entre Src família quinase e JAK família quinase. Thr338, o resíduo gatekeeper no c-Src, é substituído por Met na família JAK; Met 341 de c-Src, o resíduo formando duas ligações de hidrogênio com ruxolitinib, é substituído por leucina na família JAK (Figura 4A)

O motivo DFG conservada está em destaque na caixa azul.; o resíduo gatekeeper está em destaque na caixa vermelha; resíduo correspondente a Met341 no c-Src está em destaque na caixa roxa; vários trechos adicionais de aminoácidos estão em destaque na caixa verde

Em seguida, sobreposta a nossa estrutura com uma estrutura JAK1 (PDB: 3EYG). [29]. Ambos os domínios da quinase partilham uma estrutura global semelhante com um RMSD de 2,92 Å. A ansa P da JAK1 está mais perto do lóbulo-C, conduzindo a uma bolsa mais apertada, comparada com a de C-Src (Figura 5A). Em seguida, usamos POCASA [30] para analisar os bolsos de ligação ao ligando de c-Src (nossa estrutura) e JAK1 (código PDB: 3EYG). JAK1 tem um bolso menor, com um volume de 311 Å

3, enquanto c-Src tem um bolso maior, com um volume previsto de 450 Å

3 (Figura 5B 5C).

( a) domínio de cinase de c-Src (este trabalho) é sobreposta com o domínio quinase JAK1 (PDB: 3EYG) usando os átomos Ca de domínio cinase como a referência. c-Src é mostrado amarelo, enquanto JAK1 é mostrado na magenta. (B) Previsto c-Src bolso de ligação ao ligando é mostrado em pontos cinzentos. (C) Previsto JAK1 bolso de ligação ao ligando é mostrado em pontos cinzentos. bolsa de ligação ligando está previsto usando POCASA [30]

Para entender melhor como ruxolitinib diferencia essas famílias quinase, nós ancorado ruxolitinib em uma estrutura JAK1 anteriormente resolvido (PDB: 3EYG). [29]. O resultado mostra que a ancoragem ruxolitinib única ocupa o local de ligação de ATP, e o motivo DFG é mantido em DFG-na conformação activa (Figura 6A), o que sugere que ruxolitinib é também um tipo I inibidor para JAK1. Isto é consistente com a conclusão anterior, através de uma concorrência ensaios de ligação [5]. Ruxolitinib é orientado de tal modo que os anéis de pirrolopirimidina apontam para a região de charneira. Em vez de formar duas ligações de hidrogénio com Met341 em c-Src, os anéis de pirrolopirimidina formar duas ligações de hidrogénio com os átomos da cadeia principal de Glu957 e Leu959 (Figura 6B). Uma grande diferença entre a ligação ruxolitinib a c-Src e JAK1 encontra-se na orientação do anel de ciclopentano. Ele aponta para o C-lobo no complexo de c-Src /ruxolitinib, enquanto aponta na direção N-lobo quando se ligar a JAK1 (Figura 6B). Outra diferença notável é que o grupo de propanonitrilo ruxolitinib faz contactos com JAK1, embora não interage com c-Src (Figura S3).

(A) ruxolitinib foi encaixado dentro do bolso de ligação ao ligando de JAK1 ( pdb: 3EYG). domínio JAK1 quinase é mostrado em desenhos animados e colorido em magenta. Ruxilitinib é mostrado na esfera. (B) Previsto pontes de hidrogênio entre ruxolitinib e JAK1 dobradiça região. Com base no resultado de encaixe, os anéis de pirrolopirimidina de ruxolitinib forma duas pontes de hidrogênio com JAK1 Glu957 e Leu959. (C) Forma complementaridade entre ruxolitinib e JAK1 bolso de ligação ao ligando. (D) Forma complementaridade entre ruxolitinib e c-Src bolso de ligação ao ligando. O bolso de ligação ao ligando prevista é mostrada em malha cinzento.

Há uma alta forma complementaridade entre ruxolitinib eo bolso JAK1 de ligação a ATP (Figura 6C), levando a mais contactos com os resíduos em torno do bolso do que a de c-Src (Figura S3). No complexo de c-Src /ruxolitinib, há uma considerável cavidade adjacente à ruxolitinib no bolso de ligação ao ligando, especialmente entre a hélice e ruxolitinib aC de c-Src (Figura 6D). Mais interacções e superior forma complementaridade pode ser a razão pela qual ruxolitinib é um inibidor mais potente para a quinase de JAK quinases Src do que para.

Ruxolitiib é um inibidor relativamente pequeno com um peso molecular de 306,37 g /mol. A adição de alguns grupos adicionais para ruxolitinib poderia conduzir à descoberta de novos compostos que são inibidores mais potentes para a c-Src. Por exemplo, a adição de alguns grupos químicos para encher a cavidade entre ruxolitinib e aC hélice de c-Src pode melhorar significativamente a afinidade do novo composto com quinases Src. No entanto, por causa do aumento do volume de ligante, o novo composto provavelmente para ser demasiado grande para encher o bolso de ligação ao ligando de JAK, portanto, pode ser um inibidor fraco para cinases JAK.

Conclusões

neste artigo, apresentamos uma estrutura cristalina de ruxolitinib ligado ao domínio de cinase c-Src. Embora ruxolitinib não é um inibidor potente de c-Src, a estrutura cristalina mostra que o domínio de quinase c-Src é mantido na conformação activa DFG-nos que é característica do tipo I de inibidor. Além disso, nós ancorado ruxolitinib para o bolso de ligação ao ligando de uma estrutura de JAK1 previamente resolvido. Do nosso resultado de encaixe, ruxolitinib também se liga JAK1 como um tipo I inibidor. Em comparação com a sua ligação a c-Src, ruxolitinib tem mais interacções e um maior complementaridade com a forma JAK1 bolso de ligação ao ligando, o que pode ser a principal razão pela qual ruxolitinib é um inibidor muito mais potente contra quinases JAK quinases Src que. Em nossa análise estrutural, percebemos que existe cavidade considerável entre ruxolitinib e c-Src bolso, sugerindo que a modificação ruxolitinib poderia levar ao desenvolvimento de inibidores de c-Src potentes de ligação ao ligando.

Informações de Apoio

Figura S1.

Fo-Fc omitir mapa de ruxolitinib no complexo de c-Src /ruxolitinib. A densidade de elétrons é contornado em 2σ e é sobreposto com o modelo final

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106225.s001

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Figura S2.

Diagrama esquemático das interações ptotein-ligando no complexo de c-Src /ruxolitinib. As ligações de hidrogénio estão indicados por linhas a tracejado entre os átomos envolvidos, enquanto os contactos hidrofóbicos são representados por um arco com raios. O diagrama foi gerado pelo ligplot [31] (Referência Suplementar)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106225.s002

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Figura S3.

Diagrama esquemático das interações ptotein-ligante em resultado de ancoragem JAK1 /ruxolitinib. As ligações de hidrogénio estão indicados por linhas a tracejado entre os átomos envolvidos, enquanto os contactos hidrofóbicos são representados por um arco com raios. O diagrama foi gerado pelo ligplot [31] (Referência Suplementar)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106225.s003

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Tabela S1. ensaios

Quinase mostram que ruxolitinib inibida c-Src com uma IC50 de 2,93 uM

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106225.s004

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Reconhecimentos

Agradecemos Xiao Lei, Kaori Noridomi e Shuxing Li de assistência experimental e discussão. Agradecemos Chao Zhang por fornecer o vector de expressão de c-Src. Agradecemos Meng Xia e Stephanie Chu para obter ajuda com a edição. Agradecemos a membros da equipe ALS BCSB Corie Ralston e Kevin real para obter ajuda com a coleta de dados. Agradecemos a membros da equipe SSRF BL17U para obter ajuda com a coleta de dados. Agradecemos Centro Internacional de Quinase Profiling para obter ajuda com ensaio de cinase.