Abstract

Apesar de estudos anteriores que demonstram características de células-tronco do câncer de cólon (CCSCS) e o papel do epitélio transição -mesenchymal (EMT) no desenvolvimento do tumor, ele permanece controverso quanto à relação entre CCSCS e EMT. Neste estudo, a fim de apresentar uma visão sobre esta relação no câncer de cólon, desenvolvemos HCT116 e HT29 modelos esfera, que são conhecidas por serem as células enriquecedoras células-tronco cancerosas. Em comparação com as suas contrapartes parentais, esferóides de células exibido inferior homotípica /adesão heterotípica, mas mais elevada capacidade migratória /invasivo in vitro, assim como o potencial tumorigénico superior e metastático in vivo. As células esferóides também demonstrado regulada negativamente E-caderina e supra-regulados α-SMA e expressão de vimentina, que é o fenótipo típico de EMT. A fim de explorar se este fenómeno está associado à activação da via Wnt /β-catenina, que detectado várias moléculas de sinalização importantes. Em comparação com as suas células parentais, HCT116 e células HT29 esferóides demonstraram expressão regulada de GSK3β, mas up-regulada expressão de Slug e Caracol. E também, a sobre-regulação de núcleo β-catenina em células de esferóides indicou que a β-catenina livre transferido do citoplasma para núcleo da célula. Nossas descobertas indicam que as células esferóides têm as características de células-tronco de câncer de cólon, e EMT pode ser responsável por sua stemness e malignidade. E a activação persistente de Wnt via /β-catenina pode desempenhar um papel importante na EMT da CCSCS

citação:. Han X-Y, Wei B, Fang J-M, Zhang S, Zhang F-C, Zhang H-B, et ai. (2013) As células-tronco do cancro do cólon-Like epitelial-mesenquimal Transição Associates com a manutenção da stemness em Spheroid-derivadas. PLoS ONE 8 (9): e73341. doi: 10.1371 /journal.pone.0073341

editor: Giovanni Camussi, Universidade de Torino, Itália |

Recebido: 26 de maio de 2013; Aceito: 29 de julho de 2013; Publicação: 09 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Han et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Science Foundation da China (No. 81.000.960), Projeto de Key of Science Foundation da província de Guangdong (nº 10251008901000011) e os Fundos investigação fundamental para as Universidades Central (No. 12ykpy42). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal é a terceira principal causa de mortes por câncer em todo o mundo, ea taxa de sobrevivência relativa de 5 anos é de apenas 53,8-65,2%, apesar dos avanços diagnósticos e terapêuticos [1], [2]. recorrência de tumores e metástases são dois factores críticos que influenciam a sobrevivência de cancro colorectal (CRC). Existe um conhecimento crescente de que a transição epitelial-mesenquimal (EMT) contribui com a invasão tumoral e metástase [3], [4]. Como todos sabemos, EMT é um programa celular altamente conservado que permite que as células epiteliais polarizadas, bem diferenciados para converter em células mesenquimais não polarizados, móvel. Este processo é considerada para promover a célula do cancro colorrectal para invadir a membrana basal e o microambiente circundante, tais como os sistemas linfáticos e vasculares sangue, em última análise, contribuir para o extravasamento intra ou [5].

recentemente, uma evidência crescente sugere que iniciação do tumor e metástases estão dependentes de uma pequena sub-população de células de tumor denominado cancro de células estaminais (CCC) tendo potencial de auto-renovação infinita e a capacidade de se diferenciar em populações diferentes que compreendem um tumor [6], [7], [8] [9]. De acordo com este modelo, as células-tronco do câncer sustentar carcinogênese, a angiogénese, metástase e processo de recorrência de cancro colo-rectal [10]. Em outras palavras, as células-tronco do câncer está no comando da malignidade do câncer colorretal. Mas como é que as células-tronco cancerosas manter sua stemness, tais como a capacidade de migração, invasão e metástase? Muitos pesquisadores observaram que algumas células cancerosas (como câncer de mama, câncer de cólon, etc.) podem obter as características como as células-tronco do câncer através de transição epitelial-mesenquimal [11], [12], [13], [14]. Ou seja, EMT pode atribuir célula cancerosa os bionomics tronco-like, o que indica que a EMT pode participar na manutenção da stemness de CCSC. Mas a relação detalhada entre células-tronco cancerosas e EMT não foi relatado. Enquanto isso, a ativação predominante de via de sinalização Wnt /β-catenina no CRC esporádica, é relevante para EMT [15]. O presente estudo teve como objetivo demonstrar se os bionomics de células-tronco de câncer de cólon e sua manutenção de stemness estão relacionados com EMT ou não, e ilustrar o papel da via de sinalização /β-catenina Wnt neste processo.

Materiais e métodos

Declaração

Ética

Todos os experimentos envolvendo participantes humanos (incluindo a recolha de amostras de cancro do cólon humano) foram aprovados pela Comissão médica de Ética em Pesquisa Sun Yat-sen University, e conduzida de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. Todos os participantes envolvidos no estudo assinaram os formulários de consentimento informado. E todas as experiências com animais foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais relevantes. E este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica em Pesquisa Animal de Sun Yat-sen University.

cultura celular

HCT116 (ATCC, CCL-247) e HT29 (ATCC, HTB-38) linhas celulares de cancro do cólon foram mantidas em DMEM /F12 suplementado com 10% de FBS, 200 U /ml de penicilina e 200 ug /ml de estreptomicina. meios Tumorsphere (também chamado como meio isento de soro, SFM) foi composto por meio DMEM /F12 suplementado com 1 × B27 (Invitrogen), EGF (20 ng /ml, Peprotech), bFGF (10 ng /ml, Peprotech), insulina rotina (5 ug /ml, Invitrogen), 200 U /ml de penicilina e 200 ug /ml de estreptomicina. Para 3D cultura flutuante, as células HCT116 e HT29 cultivadas em duas monocamada dimensional foram digeridas com tripsina, ressuspendidas e, em seguida semeadas a uma densidade de 2 × 10

6 células em SFM em 100 mm de ultra-baixa pratos de fixação (Corning) a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2 /95% de ar.

a detecção da expressão de CD133 por citometria de fluxo

As células derivadas de culturas de monocamada e em suspensão esferas no dia 7 após a cultura primária foram detectado para a expressão de CD133. As células foram lavadas duas vezes em PBS frio, e, subsequentemente, as suspensões celulares foram incubadas a 4 ° C com 01:10 conjugado com FITC anti-humano monoclonal de rato de anticorpo CD133 (AB, Miltenyi Biotec) durante 45 minutos no escuro. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes em PBS frio com 1% de BSA e ressuspensas em 400 ul de PBS frio com 1% de BSA para a análise de citometria de fluxo dentro de 1 hora (h).

Imunofluorescência coloração

o anti-Lgr5 Ab (Abcam), anti-CK20 Ab, anti-e-caderina Ab, anti-β-catenina Ab, anti-α-SMA Ab e anti-vimentina Ab (Santa Cruz Biotechnologies) foram preparados de acordo com o os protocolos do fabricante. As células foram fixadas com 4% de paraf ormaldeido e permeabilizadas com 0,05% de Triton X-100 em PBS à temperatura ambiente durante 20 min. As amostras foram bloqueadas com 1% de albumina de soro de bovino (Sigma) e incubadas com o anticorpo primário adequado a 37 ° C durante 1 h. Após lavagem extensiva, elas foram incubadas com Alexa Fluor 488 anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho-(Invitrogen) ou IgG anti-coelho de cabra Fluor-Cy3 (Jackson Immunoresearch) a 37 ° C durante 1 h. A contracoloração dos núcleos com DAPI (Invitrogen) foi também realizada. As células foram então lavadas e montadas por observação sob um microscópio confocal de varrimento (LSM-710, Zeiss). Aqui, ao longo deste manuscrito, dados de pelo menos três experiências independentes foram analisadas para verificar a reprodutibilidade dos resultados.

A homogeneidade e a aderência heterogeneidade ensaio

A capacidade de adesão de células a ECM foi testada utilizando fibronectina (FN) -Revestido placas de 96 poços (Corning). Suspensões de célula única de esferóide e as células aderentes foram plaqueadas (10

5 /poço), e incubadas a 37 ° C durante 2 h, em seguida, lavadas com PBS para remover as células não adesivas. Delt OD de 570 nm comprimento de onda foi determinada de modo a reflectir as células aderentes utilizando FN-Contagem celular Kit-8 (Dojindo, Japão). A capacidade de adesão das células para células homogéneas foi testado utilizando células em monocamada pavimentadas placas de 96 poços. esferóides de células aderentes e foram colocadas em placas a 10

5 por poço, e incubou-se a 37 ° C durante 60 min, 90 min e 120 min. Em seguida, as células não aderentes foram contadas e a actividade adesiva homotípica foi calculada utilizando a fórmula:. Adesão homotípica (%) = (número total de células – células não adesivas) /células totais x 100%

Migração e invasão ensaios

Migração e ensaios de invasão foram realizadas em 24 poços, transpo� câmaras com 8 mm de poros inserções de filtro de policarbonato (Corning). Um total de 5 × 10

4 ou 10

5 dissociado esferóide ou células aderentes foram semeadas em inserções não revestidas ou revestidas com Matrigel em 100 ul de inserções de meio isento de soro para os ensaios de migração ou invasão respectivamente. As câmaras inferiores foram cheias com 0,5 ml de meio DMEM /F12 10% suplementado com FBS. Após 24 h e /ou 48 h, as células no lado superior do filtro foram removidas e as células na superfície inferior do inserto foram fixadas e coradas com violeta de cristal. O número de células coradas foi contado sob um microscópio de luz. Os ensaios foram realizados em triplicado.

Western blot análise

GSK3β, β-catenina, Slug, e expressão de Snail foi analisada em extractos celulares totais ou em extractos de núcleo separados por gel de 10% SDS-poliacrilamida electroforese e transferida para membrana de polivinilideno Fluoreto (Millipore). As membranas foram lavadas em solução salina tamponada com Tris com Tween (TBST, composto por Tris-HCl a 10, pH 8, NaCl 150 mM e 0,05% de Tween 20), bloqueado 1 h à temperatura ambiente com 5% de leite magro em TBST, então sondadas 1 h à temperatura ambiente com anticorpo anti-E-caderina Ab, anti-α-SMA Ab, anti-vimentina Ab, anti-GSK3β Ab, anti-β-catenina Ab, anti-Snail Ab (Santa Cruz Biotechnologies), anti -Slug Ab (BD Pharmingen), anti-α-Tublin Ab e anti-GAPDH Ab (Peprotech). Após incubação com anticorpo secundário conjugado com peróxido de rábano, proteínas imunorreactivas foram detectadas pelo sistema de detecção ECL (Millipore). análises quantitativas de sinais immunoblotting foram obtidos por meio de análise de densitometria usando LAS4000 Software Imagem (Fuji Film). As concentrações de proteína foram determinadas utilizando o kit de ensaio de proteína BCA (ThermoScientific Biosciences).

In vivo tumorigênese

Para determinar se as células esferóides são mais tumorigénico do que suas contrapartes aderentes in vivo, realizou-se o desenvolvimento de tumores e experimentos metástase hepática. As células isoladas foram ressuspensas em PBS. Uma suspensão de 100 ul contendo 2 × 10 subcutaneamente

6 células aderentes ou células esferóides foram injectados (s.c.) nos flancos do macho com 4 a 6 semanas de idade BALB ratinho /C-nu, obtidos a partir do Jackson Laboratory. diâmetros tumorais subcutâneos foram medidos com um compasso de calibre digital a cada dois ou três dias, e o volume do tumor em mm

3 foi calculada utilizando a fórmula: Volume = largura

2 × comprimento × 0,52. seções, em seguida, 3 ou 4 semanas depois, os ratos foram mortos e congelados de tecido (6 um) de tumores subcutâneos foram feitos para detecção patológico.

In vivo metástase hepática

foi utilizado modelo metastático

Liver para determinar o potencial metastático de células esferóides. As metástases hepáticas foram estabelecidas por injeção interna do baço, de 4 × 10

6 HCT116 esferóide ou células aderentes e esplenectomia foi realizada 10 minutos após a injeção interna do baço para evitar baço metástase. O estado geral de saúde foi gravado em detalhes uma vez por dia. Fígado focos de metástase foram examinados e medidos. E secção de tecido foi feita para a coloração de hematoxilina-eosina para confirmar a origem patológica.

A análise estatística

A significância estatística foi determinada pelo one-way ANOVA seguido de Bonferroni post-hoc teste para comparações múltiplas ou o teste t de Student. Para todos os testes, P 0,05 ou 0,01 foi considerado estatisticamente significativo ou muito significativo

Resultados

caracterização morfológica e biológica da colonospheres

Quando cultivadas em meio livre de soro. suplementado com 1 × B27, 20 ng /ml de EGF e 10 ng /ml de bFGF, ambas as células de cancro do cólon HCT116 e HT29 crescer em grande redondo, colónias esferóides flutuante não acopladas (colonospheres denominados) (Figura 1). Morfologicamente, a polaridade normal das células aderentes desapareceu em colonspheres. Em seguida, determinou-se a frequência de células formadoras de esfera através da realização de uma análise de diluição limitante extrema (ELDA) para as células HCT-116 parentais e derivados de esferóides. A frequência para formar colonsphere foi encontrado para ser 5,5 vezes superior em células esferóide do que a linha celular parental, indicando que a célula esferóide tinha maior capacidade de auto-renovação.

Ambos HCT116 e HT29 pode formar redonda grande, solto colonsphere flutuante de 50-100 uM quando cultivadas em SFM. análise de citometria de fluxo mostrou que o aumento de expressão de CD133 ≤1.2% até 60% -80%, quando cultivadas em SFM. E fortemente a expressão de Lgr5 foi detectado por coloração de imunofluorescência. Mas como o marcador de células epiteliais diferenciada, expressão CK20 apresentou alteração adversa.

As células esferóides mostraram expressão aumentada de dois pontos CSC marcadores-CD133 e Lgr5, mas a expressão atenuada do diferenciada CK20 marcador de células epiteliais em comparação com suas células parentais correspondentes. A proporção de células positivas CD133 foi determinada por citometria de fluxo em células parentais e esferóides, eles foram encontrados para ser mais do que 80% em colonospheres, em oposição a ≤1% observada em linhas celulares parentais (Figura 1). Quando os colonospheres foram submetidas a coloração por imunofluorescência para Lgr5, observou-se a coloração Lgr5 brilhante na superfície de cada célula esferóide indicando a presença de CSCs em colonosphere (Figura 1). Os resultados sugerem que CSCs foram eficientemente enriquecido em colonospheres. Para o ensaio de múltiplos diferenciação, as células foram transferidos esferóides meio contendo soro. Em seguida, o fenótipo foram detectados após a cultura de 4 semanas. E observou-se que os esferóides de células re-ligado ao plástico e transformado em células aderentes morfologicamente, juntamente com a expressão de CD133 /Lgr5 regulada para baixo e sobre-regulada CK20 (não mostrado). Os resultados sugerem que as células esferóides têm a capacidade de multi-diferenciação [10].

células Spheroid exibir adesão menor, mas maior em migratória vitro /invasiva capacidade

Para corroborar perfil maligno do cólon obtido células cancerosas esferóides, realizamos ensaios in vitro para avaliar a aderência e capacidade migratória /invasiva de células esferóides em comparação com os seus homólogos aderentes. Os resultados do ensaio de adesão de células demonstraram que as células esferóides têm capacidades inferiores de ambos os adesão a FN (um dos componentes chave de ECM) e a aderência aos seus vizinhos homogéneos, em comparação com as suas células parentais (Figura 2A e 2B).

células Spheroid têm capacidades inferiores de ambos os adesões ao FN (a) e para os seus vizinhos homogêneos (B), em comparação com os seus homólogos dos pais. células HCT116 /HT29 esferóides mostrou um 3,8 vezes (p 0,01) e quatro vezes maior (p 0,001) aumento do potencial quimiotáctica às 24 h (C). Mais células esferóides foram capazes de invadir Matrigel, em comparação com as suas contrapartes parentais (p 0,001 e p 0,05, respectivamente, D).

Verificou-se que células de esferóide exibir um aumento significativo da motilidade celular usando Transwell câmaras de migração. células HCT116 /HT29 esferóides mostrou um 3,8 vezes (p 0,01) e quatro vezes maior (p 0,001) aumento do potencial quimiotáctica às 24 h, respectivamente, em comparação com os seus homólogos aderentes (Figura 2C). E também, significativamente mais células HCT116 esferóides /HT29 foram capazes de invadir inserções Matrigel-revestidas em câmaras Transwell migração do que as suas contrapartes parentais (p 0,001 e p 0,05, respectivamente) (Figura 2D). Estes resultados indicam que as células esferóides de câncer de cólon, em comparação com os seus homólogos aderentes são dotados de adesão inferior, e maior capacidade migratória /invasiva, um fenótipo funcional associada com a agressividade do tumor.

células Spheroid possuem maior potencial tumorigénico e metastático em vivo

Para determinar se as células esferóides são mais tumorigénico e metastático do que suas contrapartes aderentes in vivo, realizou-se o desenvolvimento de tumores e metástases hepáticas experimentos. Quando 2 × 10

6 células foram inoculadas subcutaneamente em ratinhos nus, todos os ratinhos desenvolveram tumores. tumores transplantados foram confirmados como cancros do cólon com coloração hematoxilina-eosina. E os volumes dos tumores subcutâneos em grupos de células esferóides foram significativamente maiores do que a dos grupos de células aderentes (Figura 3A, 3B e 3C).

Os volumes de tumor subcutâneo em HCT116 grupo células esferóides foram significativamente maiores do que em grupo células HCT116 (A, B). esferóides de células HT29 mostrou resultados semelhantes (C). As células HCT116 esferóides desenvolvido mais metastático do fígado focos de HCT116 (D, F). Os tumores metastáticos foram confirmados como cancros do cólon com coloração hematoxilina-eosina (E).

Como a metástase hepática estava em causa, quatro ratos (4/5) desenvolveram metástases hepáticas no grupo de células HCT116 esferóide, mas apenas um rato (1/5) fez em grupo aderente (Figura 3D). Os tumores metastáticos também foram confirmados como cancros do cólon com coloração hematoxilina-eosina (Figura 3E). O resultado da contagem de focos metastáticos do fígado mostra os resultados semelhantes (Figura 3F). As condições gerais dos ratos no grupo de células esferóide são piores do que os do grupo de células aderentes, e alguns deles desenvolveram ascite e caquexia grave. Os resultados dos experimentos in vivo ilustrado que as células esferóides derivado possuem capacidades superiores tumorigênicos e metastáticos do que suas contrapartes parentais.

EMT-fenótipo de células esferóides associados com Wnt /β-catenina via de sinalização

Para demonstrar se houve conexões entre os perfis malignas de células esferóides e EMT, detectamos sua EMT-fenótipo. Os resultados da IF e Western Blotting mostrou que a regulação negativa da expressão de E-caderina e a sobre-regulação de α-SMA e expressão de vimentina em HCT116 e HT29 colonospheres, em comparação com as células parentais (Figura 4 e 5). Isto quer dizer, as células esferóides possuem a característica de células mesenquimais. A activação da via Wnt /β-catenina é relatado para induzir EMT [16], [17]. Em seguida, as moléculas chave na via de Wnt /β-catenina foram detectados utilizando a técnica Western Blot. Em comparação com as suas células parentais, HCT116 e células HT29 esferóides demonstrado down-regulação da expressão GSK3β mas up-regulação da expressão de Slug e Caracol. E também, a sobre-regulação da expressão β-catenina em células de núcleo de esferóide indicou que a transferência β-catenina livre do citoplasma para núcleo celular (Figura 5).

fotomicrografias representativas que descrevem a expressão mais elevada de E-caderina e a localização da membrana de β-catenina em HCT116 e células HT-29 aderentes do que as correspondentes células de esferóides por coloração por imunofluorescência. E maior expressão de vimentina em células esferóide foi detectada em comparação com células aderentes.

A sinalização /β-catenina Wnt é constitutivamente ativados nas células esferóides, incluindo a expressão regulada para cima de vimentina, Slug, Caracol, e β-catenina nuclear, mas a expressão de e-caderina e GSK3β regulada para baixo, comparando com as células parentais correspondentes.

Discussão

O conceito de heterogeneidade do tumor, o que presume lá foram diferentes fenótipos no tecido tumoral, foi proposto pela primeira vez por Fidler IJ nos 70 s do século passado [18]. A teoria de células-tronco do câncer foi moldado com base neste conceito. câncer de células estaminais têm sido definidos como “células de um tumor que possuem a capacidade de auto-renovação e que podem causar as linhagens heterogéneas de células cancerosas que constituem o tumor” em uma recente Associação Americana de Pesquisa do Câncer (AACR) oficina [19] . Até agora, a existência de células estaminais de cancro foi confirmada em vários tumores sólidos. E a recente identificação de células iniciadoras de tumores de câncer de cólon aumenta ainda mais suporte à hipótese de células-tronco do câncer [7]. Segundo esta teoria, a pequena subpopulação de células-tronco do câncer carrega toda a característica de malignidade, incluindo invasão e metástase.

Houve vários métodos para obter células-tronco cancerosas. O método amplamente utilizado para isolar ou enriquecer as células estaminais do cancro do cólon é separação de células com base em marcadores da superfície celular, tais como CD133, CD44, Musasai-1, etc [20]. Em seguida, as células da população lado-effluxing corantes que expressam ABCG2, uma cassete de ligação a ATP meia-transportador, foram isolados como cancro de células estaminais [21], [22], [23]. No estudo corrente, obteve-se esferas de tumor a partir de linhas celulares de cancro do cólon HCT116 e HT29 por cultura em meio isento de soro [24], [25]. E a seguinte análise indicou que a expressão de CD133 e Lgr5 destas células esferóide foi maior do que as suas contrapartes parentais, enquanto que a expressão CK20 foi menor que representa a célula endotelial diferenciada. E quando foram cultivadas em meio contendo soro, as células esferóides re-anexado ao plástico e exibidos regulada negativamente CD133 /Lgr5 e supra-regulados expressão CK20 (não mostrado). Os resultados sugerem que as células esferóides possuem a capacidade de multi-diferenciação. Além disso, as células podem formar esferóides as mesmas esferas, indicando que eles têm a capacidade de se auto-renovar. A partir destes resultados, podemos tirar a conclusão de que as células-tronco do câncer pode ser enriquecido nestas células esferóides.

Foi realizada uma série de experimentos funcionais, a fim de ter uma visão mais aprofundada sobre o comportamento biológico destas células esferóides . Em primeiro lugar, os resultados do ensaio de adesão mostrou que as células esferóides demonstrar capacidades inferiores de ambas as adesões à FN (um dos componentes chave de ECM) e a aderência aos seus vizinhos homogéneos. Isso era para dizer, este tipo de células são mais fáceis de separar do ECM e para liberar a partir do tumor granel. E também, células esferóides exibir maior capacidade de migração e invasão in vitro, em comparação com os seus homólogos aderentes. Como todos sabemos, a capacidade de migração e solubilização de membrana basal são obrigatórios para a metástase das células cancerosas. Assim, as células esferóides podem migrar para o factor quimiotáctico mais facilmente. E eles podem ter mais facilidade de enzimas secreção para solubilizar a membrana basal, e mais fácil de invadir o de microvasos, em seguida, migram para outros órgãos, juntamente com o fluxo de sangue. Para determinar se as células de esferóide são mais tumorigénico e metastático in vivo, o desenvolvimento do tumor e metástases hepáticas experimentos foram realizados. E os resultados mostraram que os volumes de tumor subcutâneo em grupos de células esferóides foram significativamente maiores do que a de células aderentes. E também, a contagem hepático metastático focos mostraram os resultados semelhantes. Os resultados de experimentos in vivo ilustrado que as células derivadas de esferóides possuem capacidades superiores tumorigênicos e metastáticos do que suas contrapartes parentais.

As células nas frentes invasivas apresentam alterações na estrutura e função do epitélio, levando a uma dissolução do adherens entroncamentos, perda de polaridade apical-basal, a perda de marcadores epiteliais, a reorganização do citoesqueleto de actina, a indução de um programa mesenquimais gene-expressão e, em seguida, aumentada a motilidade e invasão: um processo referido como transição epitelial-mesenquimal (EMT) [26] , [27], [28]. Geralmente, E-caderina, β-catenina e ligam α-catenina, para formar um complexo. E a ligação do complexo caderina-E-β-catenina-α-catenina com citoesqueleto de actina é muito importante para a manutenção da polaridade celular e adesão celular. Assim, a localização adequada de E-caderina de junções aderentes é muito importante para o estabelecimento e estabilização dessas junções intercelulares entre células HCT116 /HT29. Esta é uma função importante, em especial no contexto de desenvolvimento de neoplasias e de metástases, por causa de uma perda de E-caderina na superfície da célula foi mostrado desempenhar um papel na progressão tumoral e metástase [16], [29]. No nosso estudo, as células de esferóide demonstrado infra-regulação de E-caderina, e a sobre-regulação de α-SMA e vimentina, e as duas últimas moléculas são marcadores de células mesenquimais. Assim, as células esferóides exibir o fenótipo de EMT de acordo com os nossos resultados. E os comportamentos biológicos das células esferóides consistentes com as células mesenquimais, como o caráter morfológico não polar, menor adesão, mas maior em migratória capacidade vitro /invasivo.

Estudos recentes têm relatado o papel central da sinalização de Wnt /β-catenina via na auto-renovação das células-tronco epiteliais [30], [31]. Em contraste, a desregulação da via de sinalização /β-catenina Wnt tem sido implicado na carcinogénese do cólon [32], [33]. É relatado que a via de sinalização Wnt /β-catenina altamente conservada intimamente associada com EMT [34]. via de sinalização Wnt /β-catenina conter diversos componentes, incluindo as proteínas Wnt, Frizzled (Fz), Dishevelled (Dsh), a APC /GSK3β /complexo Axin, β-catenina, o factor de TCF /LEF transcrição, e alguns genes alvo (c-myc , ciclina D, Survivin, Caracol, Lesma, etc.). Geralmente, na ausência de Wnt, o APC /GSK3β /Axin complexo (complexo de destruição) reside no citoplasma, onde se liga e fosforila β-catenina. O último, em seguida, deixa o complexo a ser ubiquitinadas por b-TRCP (que se liga ao fosforilada ‘degron’ motivo em β-catenina), é então degradado pelo proteassoma. Na condição de activação da via de sinalização Wnt /β-catenina, Wnt induz a associação de Axin com PRL fosforilada. O complexo APC /GSK3β /Axin desmorona, e β-catenina está estabilizado. A β-catenina acumulado em citoplasma transloca-se para núcleo, e liga-se a TCF /LEF, aumenta a expressão de genes alvo, tais como Lesma e caracol, que induzem EMT e metástases de cancro do cólon [35]. A ativação do sinal de Wnt, a inibição da APC /GSK3β complexo /Axin, translocação nuclear de β-catenina, e aumento da regulação do Slug e Caracol são pontos-chave de regulação EMT no câncer de cólon [36]. Em nosso estudo, foram detectados down-regulação da GSK3β e aumento da regulação do Slug e expressão Caracol. E também, o aumento da regulação da expressão de β-catenina núcleo em células esferóides indica que a transferência β-catenina livre de citoplasma para núcleo da célula.

Em resumo, o nosso estudo fornece evidências da existência de células-tronco cancerosas . Os esferóides células derivadas de linhas celulares HCT116 e HT29 enriquecer células estaminais semelhante. Em comparação com os seus homólogos aderentes, as células flutuante esfera derivados exibido inferior homot�ica /adesão heterotípica mas maior capacidade migratória /invasiva in vitro, bem como maior potencial tumorigénico e metastático in vivo. E eles demonstram fenótipo típico de EMT (down-regulamentado E-caderina e up-regulada Vimentin), o que pode explicar a sua malignidade. E ativação de Wnt /via β-catenina (down-regulação da GSK3β e aumento da regulação do Slug, Caracol e núcleo β-catenina) pode desempenhar um papel importante na EMT da CCSCS.

Reconhecimentos

gostaríamos de agradecer Qi Zhang, Cui-Ling Qi, Li-Jie Pan, e Yu Yang para a assistência no processo de experiência.