Abstract

Fundo

As mutações e metilação dos promotores de um conjunto de genes do cancro candidato (CAN genes) estão associados com a progressão da câncer colorretal (CRC). Nossa hipótese é que os promotores destes genes são inativados através de silenciamento epigenético e pode mostrar um perfil diferente em populações de alto risco. Nós investigamos o estado de metilação do gene CAN e expressão da proteína CHD5 em microarrays de tecido americana CRC Africano (TMA), utilizando coloração imuno-histoquímica.

Metodologia /Principais Achados

O estado de metilação do promotor dos genes podem foi estudados por PCR específicos de metilação (MSP) em 51 iranianos (uma população branco) e 51 afro-americanos (AA). instabilidade de microssatélites (MSI) foi analisada também. A frequência diferencial de metilação para cada gene foi testado por análise de qui-quadrado entre os dois grupos com base na mesma faixa etária e sexo. a expressão da proteína CHD5 foi avaliada em moderada a carcinomas bem diferenciados e pouco diferenciados em comparação com o tecido normal comparadas com o uso do TMA. Além disso, foram analisadas a correlação entre esses biomarcadores epigenéticos e vários fatores clínico-patológicas, incluindo, idade, localização e estágio da doença.

Setenta e sete anos e 34% dos tumores eram distal em pacientes americanos iranianos e africanos , respectivamente. Em ambas as populações, a percentagem de metilação foi 65% para SYNE1, MMP2, APC2, GPNMB, EVL, PTPRD, e STARD8, enquanto que a metilação foi 50% para LGR6, RET, CD109, e RNA. A diferença de metilação entre as duas populações foi estatisticamente significativa para CHD5, ICAM5 e GPNMB. Trinta e um por cento tumores AA mostrou MSI-H, em comparação com 28% no iranianos.

Conclusões /Significado

Um significativamente maior taxa de metilação foi encontrado para GPNMB, genes ICAM5 e CHD5 em AA pacientes em comparação com os iranianos. Estes genes podem desempenhar um papel na elevada incidência e agressividade de CRC na população AA. A hipermetilação dos genes pode, pode ser considerado como um marcador de carcinogênese do cólon

Citation:. Mokarram P, Kumar K, Brim H, Naghibalhossaini F, Saberi-firoozi M, Nouraie M, et al. (2009) distintos de alto perfil Genes metilados em câncer colorretal. PLoS ONE 4 (9): e7012. doi: 10.1371 /journal.pone.0007012

editor: Ulrich Zanger, Dr. Margarete Fischer-Bosch Instituto de Farmacologia Clínica, Alemanha |

Recebido: 15 Janeiro, 2009; Aceito: 17 de junho de 2009; Publicado: September 11, 2009 |

Direitos de autor: © 2009 Mokarram et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por Grant # CA102681, financiado pelo National Cancer Institute, NIH. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do cólon (CRC) continua a ser o cancro gastrointestinal mais prevalente nos Estados Unidos [1]. A taxa de incidência e mortalidade da CRC são mais elevados em AA [2], [3]. Um aumento significativo na incidência de CRC com uma localização distai predominante também tem sido relatada em Irão ao longo da última década, [4], [5].

Uma das vias de CRC envolve o silenciamento transcricional pela hipermetilação de ilhas de CpG, os quais é referido como o fenótipo methylator (CIMP

+) [6], que a maioria das regiões promotoras alvos de genes supressores tumorais (por exemplo, p16 e os genes hMLH1) [7], [8], [9]. Recentemente foi demonstrado que alterações genéticas e epigenéticas de alguns genes do cancro candidato (CAN genes), incluindo; SYNE1, MMP2, GPNMB, APC2, EVL, PTPRD, CDH5, LGR6, STARD8, CD109, ICAM5, CHD5, RNF, e RET, são importantes na progressão da CRC [10], [11].

a caracterização funcional destes genes no que diz respeito à progressão do tumor não foi clarificado completamente. Estes genes podem ser divididos em 5 classes: (1) supressores tumorais, incluindo tumor de coli da polipose adenomatosa supressor homólogo 2 (APC2) e proteína-tirosina-fosfatase tipo receptor-delta (PTPRD); (2) genes que codificam receptores, incluindo rearranjado durante a transfecção proto-oncogene (RET), G do receptor acoplado a proteína contendo repetição rica em leucina 6 (LGR6) e Ena /VASP como a proteína (EVL); (3) os genes que se sabe estarem envolvidos em interacções proteína-proteína e proteína-ADN, incluindo a transferência de lípidos relacionada-Star (START) contendo o domínio 8 (STARD8), proteína de dedo de anel (RNF182), antigénio CD109 (CD109), NMB glicoproteína (GPNMB); (4) os genes envolvidos em metástase tumoral e o crescimento, incluindo a molécula de adesão intercelular 5 (ICAM5), da metaloproteinase de matriz 2 (MMP2), e sináptica proteína do envelope nuclear 1 (SYNE1); e (5) os genes cuja expressão está associada a alterações na estrutura da cromatina, tal como chromodomain helicase das proteínas de ligação de ADN 5 (CHD5).

Estes genes foram escolhidos a partir de listas de muitos genes do cancro potenciais [11], [ ,,,0],12], porque os estudos recentes mostraram que a CRC não-AA, os seus promotores são metilados e /ou mutante [10]. Este é, de facto, com base na análise abrangente por Sjoblom et ai, em que a sequenciação sistemática dos tumores CRC revelaram a importância destes marcadores na progressão CRC [11]

.

Embora a maioria destes genes são novos, há alguns dados funcionais disponíveis na literatura. Os receptores para hormonas glicoproteicas tais como LGR6 G são receptores 7-transmembrana acoplados à proteína [13]. SYNE1 contém múltiplas repetições espectrina e um ácido homóloga da região C-terminal de 60-amino com o

Drosophila

proteína Klarsicht. Existem duas isoformas de mRNA, e SYNE1A SYNE1B, no músculo esquelético e cardíaco [14], [15].

O potencial metastático de células tumorais, foi encontrada a correlação com a actividade da enzima MMP2 [16] que são funcionalmente activa sobre a superfície dos vasos sanguíneos angiogénicos [16]. CD109 é um antigénio da superfície celular ligada a GPI expressos por linhas de células de leucemia mielóide aguda CD34 +, linhas de células T, linfoblastos T activados, células endoteliais e plaquetas activadas [17]. O motivo dedo anelar é um domínio de dedo de zinco especializado incluindo RNF182 e é encontrado em muitas proteínas reguladoras da transcrição [18]. As mutações no gene RET estão associados com neoplasia endócrina múltipla, tipo IIA e IIB [19].

alteração da expressão CHD5 está associada a alterações na estrutura da cromatina, por meio de modificação de histonas por acetilação e metilação [20]. Notou-se que o nível ICAM5 solúvel aumento no factor de estimulação de colónias de pacientes com encefalite aguda [21]. GPNMB é preferencialmente expresso em linhas celulares de melanoma metastático baixo como glicoproteína [22]. Na metástase do melanoma, existe uma relação inversa entre a expressão de GPNMB e calcyclin ou timosina-beta-10, dois outros potenciais marcadores para a progressão de melanoma cutâneo. Dois terços dos melanomas metastáticos que expressam altamente GPNMB recombinante mostrou crescimento do tumor subcutâneo mais lento, enquanto que um terço apresentou um potencial reduzido para a metástase espontânea em ratinhos nus [22] ou dispersão do pigmento da íris em ratinhos DBA /2J [23]. APC2 está envolvido numa série de sinais moleculares iniciada pela ligação da proteína Wnt a um receptor da família frizzled na superfície da célula alvo e que terminam com uma mudança no estado celular [24], [25]. APC2 proteína interage com uma proteína associada a microtúbulos, que efectua a sinalização de crescimento beta-catenina mediada por [24], [25]. A co-expressão da proteína EVL juntamente com alfa-II espectrina reforça a interacção célula-a-célula. A metilação do gene EVL em todos os tumores pouco diferenciados sugere que é um factor na capacidade de invasão de células [26]. STARD8 foi identificado como um gene supressor do tumor que inibe o crescimento do cancro [27]. Ele está localizado no cromossomo Xq13 e codifica DLC-3 (relacionado com Rho GTPase). A transfecção de células de mama e câncer de próstata humanas com um vector de expressão de DLC-3Alpha inibiu a proliferação celular, a formação de colónias, e crescimento em agar mole [27].

No presente estudo, foram analisadas amostras de pacientes com AA e iranianas para a metilação de promotores de genes podem ‘. Nossa hipótese é que PODE genes foram inativadas através de silenciamento epigenético e pode mostrar perfis de metilação distintas em diferentes populações.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi aprovado pela Universidade de Howard Institutional Review Board, e consentimento informado por escrito foi obtido.

população estudada, e amostras de tumor

Um total de 102 amostras de CRC foram utilizados. Cinquenta e um amostras de CRC esporádicos de pacientes iranianos, recrutados nos hospitais da Universidade de Shiraz de Ciências Médicas de 2003 a 2005 e de 51 amostras de CRC de pacientes com AA, recrutados no Hospital Universitário Howard, pareados por sexo, idade (± 5 anos) e etapa, foram incluídos neste estudo. Todas as amostras foram avaliadas e submetido a diagnóstico histológico por patologistas peritos. Os tecidos foram coletadas (com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional de todos os sites acima e os dados clínico foi obtido (incluindo raça, idade, localização do tumor primário, estágio, e diferenciação do tumor). A história familiar de câncer foi analisado para excluir os pedigrees que atendiam tanto os critérios Amesterdão I ou II. Amsterdão

metilação específicas de PCR

O estado de metilação do promotor dos genes podem foi determinada como descrito anteriormente [28], [29], [30]. A sequências de iniciadores utilizados para a amplificação das regiões promotoras de cada um dos genes podem estão listados na Tabela 1. o MS-PCRs foram realizados como previamente descrito (Tabela 1) [10]. os iniciadores foram concebidos de MSP usando um software desenvolvido no Johns Hopkins University (www.mspprimers.org) [10] com base nas sequências para as quais os números de acesso e a função correspondente é dado na Tabela 2. as condições de PCR foram como se segue: HotStart Taq polimerase (Qiagen), utilizados com a activação inicial e desnaturação 95 ° C × 15 min; 35 ciclos [95 ° Cx45 seg; 60 ° C × 45 seg; 72 ° C x 1 min] seguido de extensão final de 72 ° C x 10 min. Em ADN metilado in vitro e linfócitos não metilados de ADN foram utilizados como controlos positivos e negativos, respectivamente. A temperatura de recozimento foi de 56 ° C para APC2 e CD109 [10], respectivamente, enquanto que era de 60 ° C para todos os outros genes (Tabela 1).

isolamento de DNA e análise MSI

arquivados e blocos de tumor fresco foram cortados em secções de 5 mícrons em lâminas Superfrost (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). As áreas tumorais e normais foram diagnosticados por um patologista usando a H E combinado deslizante e microdissecados para localizar o tumor e zonas normais de, pelo menos, duas lâminas. extração de DNA e MSI (cinco marcadores microssatélites [31] (BAT25, BAT26, D17S250, D5S346 e D2S123) foram feitas de acordo com os nossos estudos anteriores [28], [29], [30]. Os tumores com a instabilidade em apenas um dos marcadores foram marcadas MSI-L, aqueles com instabilidade em dois ou mais marcadores foram marcadas MSI-H, e aqueles sem instabilidade foram marcadas MSS. Devido às características pouco claras de MSI-L, que combinado MSS e MSI-L para um grupo ( não-MSI-H).

Tissue microarrays e análise Immunohiostochemical

Tissue microarrays (TMAs) foram construídas utilizando uma Beecher Instruments MTA-1 arrayer tecido. Cada TMA continha tecido de áreas normais e tumorais ., com base num protocolo publicado [32] duplicado amostras de tumor foram retiradas de cada bloco de tecido no total, 116 casos foram analisadas quanto à expressão CHD5;. moderado a bem diferenciado (55 casos), e mal diferenciados (4 casos) carcinomas com correspondência tecidos normais adjacentes (57 casos) estavam disponíveis para comparações de controle. Uma análise retrospectiva para avaliação dos resultados foi baseada em informações clínico-patológico detalhada vinculada aos modelos TMA. TMA obtido a partir de blocos embebidos em parafina foi utilizado para as experiências de imuno-histoquímica. Secções (5 uM) foram montadas em lâminas de vidro carregadas, desparafinadas com xileno durante 2 × 10 minutos e re-hidratada usando uma série de etanol graduada. A recuperação de antígenos foi realizada colocando-se as amostras num forno de micro-ondas durante 12 min, com interrupção ocasional para evitar a degradação do tecido por calor excessivo. As lâminas foram então tratadas com peróxido de hidrogénio, seguido por incubação com os anticorpos primários e secundários, um complexo de estreptavidina-biotina, um reagente de amplificação, estreptavidina-peroxidase e solução de substrato-cromogénio usando o sistema Envision acordo com o protocolo do fabricante (DAKO) . As amostras foram então contrastadas com hematoxilina, enxaguou-se com etanol, secou-se e visualizadas por microscopia de luz. As amostras de tecido para o qual havia sido adicionado nenhum anticorpo primário foram usadas como controlos negativos. Todos os reagentes foram adquiridos a partir de imuno-histoquímica DAKO (Carpinteria, CA). O anticorpo CHD5 (clone CHD5 H-185, diluição 1/10) foi adquirido de Santa Cruze (San Diego, CA). As lâminas foram lidos por dois patologistas (E.L; R. G.) e a percentagem da coloração citoplasmática foi gravado

A análise histopatológica

patologistas independentes avaliaram características histopatológicas específicas.. A classificação de tumores foi conseguida por coloração com hematoxilina-eosina (H E). Os tumores foram classificados como proximal ou distal (para a flexão do baço). O sistema TNM da União Internacional contra o câncer foi utilizado para o estadiamento do tumor.

A análise estatística

A idade dos pacientes era uma variável contínua, enquanto a raça, sexo, localização, diferenciação, palco, MSI, e os genes podem metilação foram variáveis ​​categóricas. A distribuição das variáveis ​​categóricas foram mostrados pela tabela de frequência e para a idade por média (DP) de computação. As associações entre a metilação de loci com a idade, raça, sexo, diferenciação, MSI, palco e localização do tumor foram avaliados utilizando o teste do qui quadrado. A diferença de idade entre os dois grupos foi testada pela

t

teste de Student. Todas as análises foram realizadas utilizando

SPSS 15.0

software (Chicago, IL).

Resultados

características clínico-patológicos do paciente

Foram analisadas 102 amostras (38 fêmeas e 64 machos) de pacientes iranianos e AA (Tabela 3). A média de idade (DP) para carcinoma em AA foi 61,5 (12) anos e 60 (13) anos de iranianos. Não houve diferença significativa em sexo ou idade entre as duas populações estudadas. Um total de 57% e 24% dos tumores eram proximal nos pacientes com AA e Irão, respectivamente. A maior incidência de tumores distais estava presente em iranianos em comparação com a AA (Tabela 3). A maioria dos tumores estavam em estágios avançados com 57% na fase II no iranianos, e 52% na fase III + IV em AA (Tabela 3). A maioria dos tumores (85%) foram encontrados para ser moderadamente diferenciado em AA enquanto os tumores iranianos foram principalmente bem diferenciado (53%).

SYNE1 e RNF182 perfis de metilação do gene

A promotor SYNE1 foi encontrado para ser metilado em todas as 102 amostras analisadas (Tabela 4). Além disso, a sua metilação não parece ser especificamente associada com qualquer um dos parâmetros clínico considerados neste estudo e aponte para a sua importância na tumorigénese do cólon como um gene supressor de tumor. Em contraste, o promotor do gene RNF182 não metilado era em todas as amostras analisadas (Tabela 4). Esta descoberta vai colocar em causa o seu estatuto como um candidato para a metilação na carcinogênese do câncer de cólon.

Gênero e gene pode metilação

Nove em cada 13 genes apresentaram níveis independente de gênero de metilação (Tabela 5). O gene RET exibido um maior nível de metilação no sexo masculino (45%) do que no sexo feminino (29%). Esta diferença, no entanto, não foi considerado estatisticamente significativo. O APC2, genes PTPRD e STRAD8 foram encontrados para ter significativamente diferentes perfis de metilação nos dois sexos, com APC2 sendo hipermetilado no sexo masculino (98% vs. 90%); PTPRD e STARD8 foram hipermetilado no sexo feminino (90% vs. 67%) e (84% vs. 61%), respectivamente.

Idade e genética pode metilação

Nenhum dos 13 genes analisados ​​mostraram qualquer perfil de metilação dependente da idade, embora ICAM5 e CD109 não mostrou diferenças estatisticamente significativas (Tabela 5). Este resultado é consistente com a maneira como os genes foram escolhidos e apoia a ideia de que a maioria deles são alvo de metilação em um processo cancerígeno.

localização do tumor e gene pode metilação

Ten da analisados genes têm níveis de metilação semelhantes, independentemente da localização do tumor (Tabela 5). No entanto, CD109, LGR6 e ICAM5 exibido níveis de metilação mais elevados em tumores proximais do que nos mais distais. A metilação frequência de CD109 foi de 43% em tumores proximais vs 21% em tumores distais. Estes números foram ICAM5 para 34% em proximal e 16% em tumores distais, respectivamente (p 0,05). Para o gene LGR6, a diferença (51% vs. 33%) não foi estatisticamente significativa.

diferenciação tumoral e gene pode metilação

Enquanto 8 genes exibido diferentes perfis de metilação em diferentes níveis de diferenciação , apenas dois apresentaram diferenças estatisticamente significativas (ICAM5 e MMP2). No entanto, não houve correspondência com a progressão do tumor para pobre diferenciação (Tabela 5). Apenas os genes APC2 e EVL exibida maior metilação na progressão normal de um tumor do bem a moderada a pobre diferenciação, com o gene APC2 que mostra 91%, 97%, e 100% e o gene EVL que mostra 75%, 77%, e 100%, respectivamente. Estas descobertas podem sublinhar o papel destes genes no processo de diferenciação do tumor.

Perfil de metilação

estágio do tumor e gene pode

Oito genes mostraram diferentes perfis de metilação em diferentes fases de tumor, com a LGR6 e APC2 os genes que apresentam diferenças estatisticamente significativas com a maior metilação na fase 1 e inferior a metilação em fases avançadas no caso de LGR6 e inferior metilação na fase 1 e na maior metilação em fases avançadas no caso de APC2 (Tabela 5). O único gene que mostrou uma metilação superior em mais fases avançadas de tumor foi CD109, o qual foi metilado, a uma taxa de 56%, 76%, e 86% em níveis I, II e (III + IV), respectivamente.

MSI e gene pode metilação

A taxa MSI foi de 28% para os iranianos e 31% para AA (Tabela 3), respectivamente. Doze dos 13 genes testados não mostraram diferenças em níveis de metilação entre tumores não MSI-H em ambas as populações MSI-H e. Uma excepção poderia ser feita para o gene PTPRD com uma associação estatisticamente significativa com MSI-H (P 0,05) em ambas as populações (Tabela 5). Por conseguinte, existe uma possibilidade de que a metilação de PTPRD está ligado ao fenótipo MSI-H.

População de comparação População

Os perfis de metilação de, pelo menos, 9 genes nas duas populações foi analisada semelhante sem diferenças significativas (Tabela 4 e Figura 1): APC2, SYNE1, EVL, MMP2, CD109, RNF182, PTPRD, STARD e RET. Para o gene LGR6, houve uma diferença substancial, embora estatisticamente insignificante, nos níveis de metilação com 31% vs. 49% no iranianos e AA, respectivamente. Durante três genes, nomeadamente GPNMB, CHD5 e ICAM5, houve diferenças estatisticamente significativas entre o nível de metilação, com AA exibindo níveis de metilação mais elevados do que os iranianos, 100%, 78% e 40% vs. 89%, 47%, e 7,5 % para os três genes, respectivamente (Tabela 4)

expressão CHD5 por IHC, Diferenciação e Tumor Stage

uma vez que um dos principais focos do nosso laboratório é o de resolver o problema da elevada incidência de CRC em AA e, com base no facto de promotor CHD5 é altamente metilado nesta população e parece estar envolvido nas fases iniciais da carcinogénese, de um modificador de cromatina, analisou-se a sua expressão por IHQ para validar os resultados de metilação. Entre 59 CRC casos disponíveis para análise, o número de indivíduos com estágio I, II, III e IV foram 14 (24,5%), 20 (35,1%), 21 (36,8), 2 (3,5%) e 2 (em falta ), respectivamente. Em geral, não houve diferenças estatisticamente significantes para idade, sexo, localização anatômica, expressão CHD5 com o estágio do tumor (dados não mostrados). Expressão de CHD5 (Fig. 2C) foi perdida em 80% dos pacientes com AA e 52% em pacientes com Irão fase II e III da doença, respectivamente. No entanto, a diferença não foi estatisticamente significativa. A perda de expressão CHD5 foi consistente com a metilação CHD5 no CRC. A expressão citoplasmática de CHD5 estava presente nas células epiteliais do cólon normais (Fig. 2A), em comparação com o controlo negativo sem o anticorpo primário (Fig. 2B), indicando a especificidade do anticorpo.

(A) CHD5 positiva coloração evidente em todas as glândulas normais em amostras de biópsia a partir de biópsias de cólon normais (B) em pacientes falta normal da cor castanho indica ausência de coloração cytoplamic para CHD5 na ausência de anticorpo primário, (C), em pacientes de CRC ( 52%) dos casos apresentaram ausência de coloração citoplasmática para CHD5 nas células epiteliais malignos.

Discussão

análise epigenética de células tumorais desempenha um papel importante na compreensão dos processos cancerígenos e terapias específicas [7]. Sjoblom et ai. sequenciaram milhares de genes em 11 tumores primários da mama e do cólon e concluiu que cada tumor individual tem uma média de 14 alterações genéticas [11]. Um estudo subsequente mutação epigenética e [10] conduziu à identificação de promotores silenciados, dos quais 13 correspondem aos genes podem analisados ​​neste estudo [11]. Decidimos investigar o impacto desses 13 genes no CRC usando duas populações de amostras diferentes. A escolha dos 13 genes foi baseado no facto de terem sido estabelecidas a partir de uma tecnologia de alto rendimento e um estudo abrangente envolvendo ambas as linhas de células e as amostras do cólon branco clínicos que foram validados utilizando ADN de tecido normal e cancro [10], [11] , [33]. Aqui, analisamos o perfil de metilação desses 13 genes em AA e CRC iraniana, o status MSI ea expressão de IHC de CHD5, um gene suspeito de estar envolvido em processos cancerígenos precoces.

A maioria dos genes analisados foram altamente metilada com diferentes níveis de metilação de um gene para o outro e uma população para o outro. SYNE1, uma proteína de envelope nuclear que codifica sináptica, foi metilado em todas as amostras analisadas, enquanto o promotor RNF182, que codifica uma proteína de dedo anelar, foi metilado em nenhum. Nenhuma função conhecida para o gene RNF182 está disponível até à data. SYNE1 proteína foi mostrado para ser envolvido no processo de citocinese [34] em que esta proteína e proteína KIF3B facilitar a acumulação de vesículas de membrana na secção central do eixo.

O perfil de metilação dos genes analisados ​​foi mostrado para ser independente de idade (Tabela 5). Embora exista um processo de metilação geral que é dependente da idade e do gene não é /doença específica, os resultados obtidos com os genes analisados ​​reflectir a importância destes genes no processo de metilação carcinogénico-dependente. Estas conclusões são reforçadas pelo fato de que muitos dos pacientes envolvidos neste estudo, especialmente iranianos, são relativamente jovens (40 anos).

Pelo menos quatro genes mostrou um nível de metilação que depende do sexo do paciente. Um maior nível de metilação em pacientes do sexo masculino foi encontrado para APC2 e RET, enquanto que um maior nível de metilação em pacientes do sexo feminino foi exibida para os genes e PTPRD STARD8 (Tabela 5). Pelo menos quatro genes (CD109, CHD5, LGR6, e ICAM5) exibiu um nível diferente de metilação, dependendo da localização do tumor. Estes genes mostraram um menor grau de metilação no cólon distai. Esta descoberta está de acordo com a presença de um gradiente descendente de metilação de proximal para a distai do cólon. Foi observado um maior nível de metilação do bem para os tumores pouco diferenciados apenas para o promotor do gene da EVL. Bournier et ai. mostraram que a co-expressão da proteína EVL juntamente com alfa-II espectrina reforça a interacção célula-a-célula [26]. A metilação do gene EVL em todos os tumores pouco diferenciados e mais de 75% dos já bem e moderadamente diferenciados aumenta a sua capacidade invasiva. Esta conclusão é reforçada pelo fato de que esta metilação do gene também aumenta em tumores avançados, onde apenas 65% dos tumores fase-I foram metilados em comparação com 75% no estágio IV. Observou-se uma metilação aparentemente dependente de fase para LGR6, que codifica uma repetição contendo proteína-G-ricas em leucina receptor acoplado, e é, portanto, envolvido na proliferação de células [13]. No entanto, este decréscimo no estado de metilação de fase I do estádio IV (71% a 43%) não podem ser explicados à luz desta função do gene como promotor de proliferação. APC2 metilação dependente da fase da fase I para a fase IV (82% a 97%) também foi observado e isso pode ser consistente com a actividade supressora de tumor do gene APC2 no CRC e sua ligação com a via Wnt.

a análise multivariada para o efeito de confusão (local, diferenciação e fase) é diferente entre as duas populações (Tabela 3). Para ser fatores de confusão destas variáveis ​​precisam ser correlacionados com a metilação também. Como mostrado na tabela 5, ICAM5 está correlacionada com a diferenciação e local, enquanto GPNMB e CHD5 não estão relacionados com qualquer uma dessas variáveis. Com base nestes resultados, local e diferenciação pode ter um papel confundindo ICAM5. Para ser coerente e inclusivo na análise estatística, foram desenvolvidos três modelos de regressão logística usando a frente seleção com cada gene como fator dependente e local, a população (Iranian vs. AA), palco, e diferenciação como fatores independentes. Para todos os três modelos AA continua a ser o fator significativo para a metilação.

O perfil de metilação para todos, mas um gene PTPRD foi semelhante em ambos os tumores não-MSI-H MSI-H e, confirmando uma dissociação já estabelecido entre a CpG fenótipo ilha methylator (CIMP) eo fenótipo instabilidade de microssatélites em tumores de câncer de cólon. O gene PTPRD codifica uma proteína que é um membro da família da proteína tirosina fosfatase, moléculas que regulam uma variedade de processos celulares, incluindo crescimento celular, diferenciação, ciclo mitótico, e a transformação oncogénica de sinalização. Mori et ai. (2004) já demonstraram que PTPR tipo O é altamente metilados em tumores MSI-H, fortalecendo nossa descoberta [35]

Uma comparação população-população revela um perfil de metilação diferente entre os iranianos e AA para.: GPNMB (89 vs. 100%), CHD5 (47 vs. 78%), LGR6 (31 vs. 49%), e ICAM5 (7,5 vs 40%) com, pelo menos, 3 diferenças estatisticamente significativas (GPNMB, CHD5 e ICAM5) . GPNMB, um tipo de I-glicoproteína transmembranar, mostra a expressão em linhas de células de melanoma metastático humano inferiores, mas não mostra expressão nas linhas celulares altamente metastáticas [36]. Este produto de gene “pode ​​estar envolvido no atraso do crescimento e redução do potencial metastático. Portanto, o nível mais elevado de metilação GPNMB em AA pode, em parte, explicar a alta agressividade e rápida progressão de tumores do cólon em AA. Esta descoberta é ainda reforçada pelo facto de um outro gene envolvido na metástase, ICAM5, é altamente metilada em AA quando comparado com iranianos. ICAM5 codifica uma glicoproteína transmembranar de tipo I que é um membro da família de molécula de adesão intercelular (ICAM). nível elevado de metilação ICAM5 diminui a adesão célula-a-célula nas células tumorais correspondentes, aumentando o seu potencial invasivo. Este resultado é consistente com os resultados GPNMB levando a efeitos cumulativos que aumentam a capacidade de invasão e ocorrência de metástases. Ao contrário GPNMB e ICAM5, CHD-5 (proteína de ligação DNA helicase chromodomain 5) parece estar envolvido em processos tumorigênicos primeiros a nível cromatina remodelação e controla os eventos, como a proliferação, apoptose e senescência, através da p19 (IRA) /p53 caminho [37]. O nível de metilação deste gene em AA (78% vs 47% em iranianos) pode reflectir o elevado grau de incidência de cancro do cólon em AA. Na verdade, a modificação da cromatina afeta os perfis de expressão de muitos genes de uma só vez e impactos a rápida progressão do tumor. As publicações recentes têm mostrado que os tumores do cólon AA exibir uma histona mundial aberrante (H3, e H4) acetilação e HDAC2 expressão [38]. A hipermetilação dos genes que mostraram semelhanças entre as duas populações pode ser um marcador para o silenciamento início CRC iniciação.

Com base nos resultados obtidos e as características conhecidas de CRC AA, os resultados genes podem apoiar a metilação CHD5 altamente metilada e ICAM5 nos tumores AA, apontando para um papel proeminente de CHD5 e ICAM5. Houve um resultado consistente entre metilação CHD5 e falta de expressão da proteína CHD5 utilizando IHC (Fig. 2). Além disso, a expressão e análise funcional destes genes será uma importante perspectiva deste trabalho que estamos planejando para resolver no futuro. Recentemente CHD5 tem sido referido como um gene supressor de tumor, que suporta o nosso pedido de silenciamento epigenético [39] e a sua análise de expressão de IHC. A metilação de CHD5 é um factor que participam na maior incidência de CRC em AA, juntamente com outros marcadores genéticos (e) epigenética. As diferenças de factores genéticos dietéticos, ambientais e moleculares podem também desempenhar um papel [2], [40], [41], [42]. disparidades raciais têm sido observadas em polimorfismos lipoxigenase [43], microsatélites instabilidade [44], polimorfismos do gene metabólicas de folato [45], e vitamina D haplótipos do receptor [39], [46].

Os genes podem poderia ser referido como marcadores CIMP já que não há é acordado lista e diferentes laboratórios padrão CIMP ter lista de genes CIMP diferente [12], [47], [48], [49], [50].

Em conclusão , nosso estudo confirma a hipermetilação de genes candidatos câncer como biomarcadores e um perfil de metilação maior de GPNMB, observou genes ICAM5 e CHD5 em AA. Portanto, isto pode explicar, até certo ponto a alta incidência ea agressividade do CRC em AA. Para uma visão global dos processos epigenéticos na tumorigênese cólon nestes grupos de pacientes, uma análise completa dos tumores de ambas as populações podem precisar ser feito em linhas celulares estabelecidas, utilizando agentes de direccionamento ambos inibidores de metilação e /ou modificação da cromatina todo o genoma seguido de diferencial estudos de expressão microarray.

Reconhecimentos

gostaríamos de agradecer Mohammad Daremipouran para a execução de alguns do ensaio de metilação.