Abstract

Fundo

Os factores que influenciam as respostas diferenciais de tumores de próstata ao receptor de andrógeno (AR) de cada eixo terapêuticas dirigidas são mal compreendidos, e são necessárias preditores de eficácia do tratamento. Nossa hipótese é que a eficácia da inibição da síntese ligando DHT iria associar com razões de andrógenos intra-tumorais indicativos de dependência em relação ao crescimento mediada por DHT.

Métodos

Nós caracterizados dois xenoenxerto de cancro da próstata sensível ao andrógeno modelos após a supressão androgênica pela castração em combinação com o inibidor SRD5A, dutasteride, bem como um painel de metástases resistentes castração obtidas através da autópsia rápida.

Resultados

em LuCaP35 tumores (intra-tumoral T : DHT proporção 02:01) dutasteride suprimida DHT a 0,02 ng /sobrevivência gm e prolongada vs. sozinho castração (337 vs.152 dias, HR 2.8, p = 0,0015). Nos tumores LuCaP96 (T: DHT 10:01), a sobrevivência não melhorou apesar da redução DHT semelhante (0,02 ng /g). LuCaP35 demonstrou maior expressão de enzimas biossintéticas de esteróides, mantendo os níveis de DHT (5 vezes maior SRD5A1, 41 vezes maior, 99 vezes maior RL-HSD, p 0,0001 para ambos), a reconstituição de DHT intra-tumoral (para ~ 30% de não tratada tumores), e ~ 2 vezes maior expressão de AR comprimento completo. Em contraste, LuCaP96 demonstraram níveis elevados de enzimas catabolizante esteróides (6,9 vezes maior AKR1C2, 3000-vezes superior UGT2B15, p = 0,002 e p 0,0001, respectivamente), a supressão persistente de DHT intra-tumoral, e 6-8 indução de dobragem do pleno AR comprimento e o ligando independente V7 AR variante de processamento. metástases humanos demonstraram níveis de andrógenos bio-ativos e AR comprimento e AR emenda variante plena expressão consistentes com a gama observado em xenotransplantes.

Conclusões

diferenças intrínsecas na esteroidogênese basal, assim como expressão variável de corpo inteiro e AR emenda variante, associado com a resposta e resistência à pré-receptor do ligando AR supressão. Expressão de enzimas esteroidogênicas e isoformas AR podem servir como potenciais biomarcadores da sensibilidade à inibição do eixo AR potente e deve ser validado em modelos adicionais

Citation:. Mostaghel EA, Morgan A, Zhang X, Marck BT, Xia J , Hunter-Merrill R, et al. Características do Câncer (2014) da próstata associada a uma resposta ao Pré-Receptor Segmentação do Eixo andrógeno. PLoS ONE 9 (10): e111545. doi: 10.1371 /journal.pone.0111545

editor: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de fevereiro de 2014; Aceito: 01 de abril de 2014; Publicação: 30 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Mostaghel et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Câncer de Próstata Award Foundation Career Development (EAM) e Challenge Award (EAM, SP, RLV, AMM, RBM, PSN), Damon Runyon Genentech-Clinical Investigator Award C-40-08 (EAM), NIH conceder 1K23 CA122820-01 (EAM), DOD New Investigator Award W81XWH-10-1-0228 (EAM); GlaxoSmithKline (A.M. e P.S.N.); 1rc1 CA146849 (P.S.N.); PC093509 (P.S.N.); PO1 CA 85859 (J.X., R.G., R.V., P.S.N.); o NIH /NCI Pacific Northwest do cancro da próstata SPORE P50CA97186 (J.X., R. H., R. G., P.S.N., R. V.); e do Departamento de Assuntos de Veteranos (B.T.M., S. P. e A.M.M.). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: A.M.M., R.B.M. e P.S.N. ter consultado e recebeu apoio de pesquisa da GlaxoSmithKline. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Embora inicialmente altamente eficaz, a terapia da privação do andrógeno para o cancro da próstata é uniformemente marcado pela progressão para cancro da próstata resistentes à castração (CRPC) ao longo de um período de 18-36 meses, com uma sobrevivência média de 1-2 anos que se seguiu. [1] Embora receptor de androgénio (AR) a expressão do gene -regulated é inicialmente suprimidos, [2], [3] o programa transcricional regulada pela AR é reactivado no CRPC através de mecanismos que mantêm tanto ligando e receptor contribuições para sinalização mediadas AR. [4] – [6] Estes incluem androgénios intratumorais residuais em níveis suficientes para activar o programa de AR, [7] – [9] e o aumento da actividade de AR, quer através de amplificação ou sobreexpressão (resultando num aumento da sensibilidade a níveis baixos de ligando) [10 ], [11] ou através da expressão recentemente descrita de variantes de splicing AR independente de ligandos truncados (AR

SV) a que falta o domínio de ligação ao ligando (LBD). [12] – [17] Nomeadamente, os estudos de bloqueio androgênico máximo ou combinada utilizando antagonistas de AR esteróides ou não esteróides que visam o AR LBD ter só demonstrou uma pequena, embora estatisticamente significativa, a melhoria nas taxas de sobrevivência de 5 anos (27,6 vs. 24,7 %; p = 0,005). [18] A explicação mais simples para a falta de uma maior eficácia é a incapacidade destes antagonistas de AR para outcompete testosterona residual (T) e di-hidrotestosterona (DHT) (que têm AR afinidades que excedem em muito aquelas dos anti-androgénios sintéticos de ligação), [ ,,,0],19] ou um fracasso para atingir efetivamente AR

sv falta o LBD.

as respostas clínicas para novos antagonistas potentes de AR e de novos inibidores da síntese de esteróides, juntamente com a evidência da biossíntese de andrógenos intracrine no cancro da próstata sugerem que os conceitos de bloqueio androgênico máximo deveria ser revista e refinada. Um estudo recente concebido para segmentar vários passos na biossíntese de androgénio em homens de falha ADT (utilizando hidrocortisona, o cetoconazol inibidor CYP17A1, e o inibidor de esteróide 5-alfa-redutase (SRD5A) dutasterida) produziu quedas PSA substanciais na maioria dos pacientes e uma duração da resposta média de 20 meses. [20] Assim, a eficácia clínica pode não requerer um antagonista de AR na definição de supressão mais eficaz do ‘pré-receptor “sinalização por meio da redução de ligandos de AR. É importante ressaltar que a eficácia de inibir a ativação AR em cancros da próstata, seja através de abordagens pré-receptores melhorados ou aquelas voltadas diretamente AR, varia substancialmente entre os pacientes e os fatores que contribuem para esses resultados diferenciais são desconhecidos. Por exemplo, ensaios de prevenção do uso de inibidores de SRD5A diminuiu significativamente a taxa de detecção de cancros da próstata localizado, mas esta intervenção não foi claramente eficaz na prevenção da progressão do cancro ou de detecção em todos os homens. [21], [22] Da mesma forma, recentes ensaios clínicos de novos inibidores da CYP17A1 e AR em homens com CRPC relataram substanciais diferenças inter-pacientes nas respostas objetivas [23], [24].

Neste estudo , procurou-se determinar as características específicas do tumor que influenciam a resposta de cancros da próstata para a inibição da sinalização do receptor pré-AR, utilizando privação de androgénio combinado com o inibidor dual dutasterida SRD5A. T e de DHT são biologicamente AR ligandos de alta afinidade activas. No entanto, entre 3-10 vezes mais elevadas concentrações de T são necessárias para exercer os mesmos efeitos da transcrição mediada por AR de DHT. [25], [26] Assim, a redução dos níveis de DHT por inibição da conversão de T em DHT pode representar um método eficaz pré-receptor para suprimir a magnitude global da sinalização AR bioactivo. Colocámos a hipótese de que o impacto de inibição SRD5A no crescimento do tumor seria associado com níveis de andrógeno intra-tumorais e /ou a expressão de enzimas de biossíntese de esteróides sugestivos de uma dependência relativa crescimento mediada por DHT. Os factores que determinam a resposta relativa de tumores na próstata pré-receptor de supressão de androgénios com agentes tais como inibidores de SRD5A são desconhecidos, mas pode servir como indicadores de eficácia para esses agentes na prevenção do cancro da próstata, ou como um componente de ADT na doença avançada.

Materiais e Métodos

LuCaP Prostate Cancer Humano xenoenxertos

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações contidas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes de Saúde. Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Serviço de Atendimento Institucional animal Comitê de Uso do Fred Hutchinson (arquivo de 1775). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia isoflurano, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. As linhas LuCaP35 e LuCaP96 são pacientes derivado xenotransplantes que foram estabelecidas como parte do banco de tecidos da Universidade de Washington, como descrito anteriormente [27], [28] e foram selecionados para análise de ambas as linhas de demonstrar o crescimento sensível castração em camundongos machos intactos. Resumidamente, LuCaP35 foi derivada a partir de uma metástase de nódulo linfático obtida a partir de um homem caucasiano de 66 anos de idade com CRPC. LuCaP96 foi derivado de ressecção transuretral da próstata de um carcinoma primário Gleason 9 obtido num macho caucasiano 61 anos de idade, um mês antes da documentação de doença resistente à castração. Em ambos os xenoenxertos a sequência de ADN é exônico AR de tipo selvagem (dados não mostrados).

Homem CB-17 SCID (Charles River Laboratories, Wilmington MA) foram implantados subcutaneamente com 30 mm

3 peças tumorais . Quando os tumores atingiram uma média de 300 milímetros

3, os ratos (LuCaP35 n = 62; LuCaP96 n = 65) foram castrados (Cx) e randomizados para o tratamento com veículo ou dutasteride terapia (DUT) ao longo de 8 semanas. Dutasterida foi administrada (PEG monolaurato (Sigma 460133) /1% de Tween 80 (Sigma P4780)) por gavagem oral, 5 dias por semana, num volume de 200 ul. O volume do tumor foi determinado pela seguinte fórmula (comprimentos longos e curtos do eixo em mM): longa × (Short∧2) /2. Os tumores de um subgrupo de ratos em cada grupo foram colhidas nos pontos de tempo iniciais de tratamento (o tamanho do tumor de -500 mm

3; gama 7-21 dias). Quando os tumores atingiram cerca de 750-1000 mg de tamanho, os animais foram sacrificados de acordo com o protocolo institucional e os xenoenxertos colhidas e rapidamente congelados para determinação dos andrógenos do tecido e a extracção de ARN total. O número médio de dias de ratos nos grupos Cx + Dut tinha sido fora de tratamento dutasteride no foram ressecados os tumores tempo foi de 211 dias para LuCaP35, e 96 dias para LuCaP96. Dutasterida foi generosamente fornecidos pela GlaxoSmithKline.

Todos os procedimentos envolvendo seres humanos foram aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Washington Medical Center, e todos os participantes assinaram termo de consentimento informado. Os pacientes com cancro da próstata metastático sofreu autópsias rápidas sob a égide da Universidade de Washington dador de cancro da próstata Programa Autópsia como previamente descrito [9], [27]. As autópsias foram realizadas dentro de 4-10 horas após a morte. As amostras de todos os sítios tumorais metastáticas brutos foram obtidos sob condições estéreis e o local e o volume de metástases ósseas e não-ósseos foram registados. tecido fresco foi congelados em nitrogênio líquido imediatamente após a colheita e mantida a -80 ° C.

dosagem de esteróides

os níveis de andrógenos nos tecidos de xenoenxerto foram determinados por espectrometria de massa (MS), utilizando métodos não temos descrito. [29] Este procedimento resultou em um limite inferior de quantificação de 1 pg por amostra para a testosterona e DHT. coeficientes intra-ensaio de variação gerados usando soro humano para amostras alta, média e baixa gama foram de 3,5, 3,1 e 3,8% para a testosterona e 6,3, 4,3 e 15,8% para DHT respectivamente.

Isolamento de RNA, RT quantitativa -PCR e imuno-histoquímica

As amostras foram utilizadas para o isolamento de ARN, a síntese de ADNc e quantitativa de RT-PCR utilizando métodos e iniciadores que foram previamente descritos. [9], [30] coloração imuno-histoquímica e de pontuação para AR e PSA foi realizado como já descrito anteriormente [31], utilizando um anticorpo policlonal anti-PSA (Dako, Inc.), um anticorpo anti-AR dirigida ao N terminal (clone F36.4.1, Biogenex), e um anticorpo anti-AR dirigido para o terminal C (C-19, Santa Cruz). immunostains de controlo negativo, substituindo imunoglobulina pré-imune da mesma espécie como daquele em que foi gerado o anticorpo, não mostrou nenhum produto de reacção.

Análises Estatísticas

Para avaliar as diferenças de trajetória volume do tumor, determinou-se primeiro os pontos de mudança nas curvas de crescimento do tumor usando t-testes sequencialmente comparar os volumes dos tumores a cada dois dias. Após a segmentação das curvas, foi aplicado um modelo linear misto para quantificar o efeito do tratamento sobre o crescimento do tumor em cada período linear pela regressão do volume tumoral de log no dia da medição, no grupo de tratamento, e em uma interacção entre o dia e o tratamento enquanto representando variabilidade em o volume inicial do tumor entre os ratinhos. sobrevida livre de progressão em castração vs. ratos castração + dutasterida tratada (definidos como tamanho 750 mm

3) foi determinado por análise de Kaplan-Meier com a comparação de curvas usando o Mantel-Haenszel Logrank teste. Para prever a dimensão aproximada da amostra em cada grupo de tratamento que pode ser necessário para detectar um efeito estatisticamente significativo da castração mais dutasterida contra castração sozinho, utilizou caso completa reamostragem para uma gama de tamanhos de amostra n = 10, 20, …, 200 mais de 500 réplicas de bootstrap. Para cada tamanho de amostra e replicar de bootstrap, nos encaixamos um modelo de riscos proporcionais de Cox e gravou o p-valor da relação e risco estimada.

Para a análise dos dados qRT-PCR, o limiar de ciclo médio (Ct) para cada gene foi normalizado para expressão do gene de manutenção RPL13A na mesma amostra (delta CT). A expressão média de RPL13A foi de 15,6 +/- 0,5 (média +/- SD) e 14,1 +/- 0,8 em tumores LuCaP35 e LuCap96 respectivamente. duas amostragens testes t de Welch foram usados ​​para comparar as diferenças nos níveis de andrógenos e diferenças na média delta Ct do para cada gene entre os grupos de tratamento sem correção para testes múltiplos. valores P 0,05 foram considerados significativos. A mudança vezes foi calculado pelo método Ct delta-delta (dobre = 2

ΔΔCt). A matéria-DCT, DDCT de e dobre as alterações são apresentadas nos dados suplementares.

Resultados

cancros da próstata que respondem a supressão androgênica demonstrar diferenças intrínsecas em níveis basais de androgênios intratumorais e gene esteroidogênica expressão

para avaliar as características do tumor associados com a resposta e resistência à terapia AR via-dirigida, determinou-se primeiro andrógenos intratumorais e expressão do gene esteroidogênica no paciente com câncer xenotransplantes derivados de dois próstata, LuCaP35 e LuCaP96. Estas linhas expressam AR e PSA, (Figura 1A) e responder à castração com a regressão do tumor e prolongamento da sobrevida livre de progressão (PFS), mas finalmente progredir para o crescimento resistente à castração (p 0,0001 para ambos; Figura 1B, 1C). Notavelmente, LuCaP35 e LuCaP96 tumores ressecados de ratos com a função gonadal intacta exibiram marcadas diferenças nos níveis basais de androgênios intratumorais (Figura 1D): tumores LuCaP96 têm níveis mais elevados de T e níveis semelhantes de DHT e, portanto, uma maior proporção de T intratumoral: DHT em comparação com tumores na LuCaP35, 10:01 e 02:01, respectivamente (LuCaP96 T = 10,2 ± 6,5 ng /g; DHT = 0,9 ± 0,4 ng /g; LuCaP35 t = 2,6 ± 2,0 ng /g; DHT = 1,4 ± 0,8 ng /g, Tabela S1)

(a) as amostras representativas FFPE de cada xenoenxerto foram coradas com hematoxilina e eosina (H . e) e para a expressão do receptor de andrógeno (AR) e PSA, como indicado. A barra de escala (representado sobre as figuras de PSA para facilitar a visualização) são de 50 um. Curvas de Kaplan-Meier de sobrevivência livre de progressão (definida como o tamanho do tumor 750 mm

3) em ratinhos portadores de LuCaP35 (B) ou LuCaP96 xenoenxertos (C). SCID machos intactos foram implantados subcutaneamente com 30 mm

3 peças do xenotransplantes indicados. Quando os tumores atingiram -300 mm

3, os ratos foram inscritos aleatoriamente em grupos que foram ou esquerda intacto (sem Cx) ou castrados (Cx). P-valores para comparações curva foram gerados por meio do teste de Mantel-Haenszel logrank. (D) Média e desvio padrão de testosterona tecido (T, barra preta) e os níveis medidos por espectrometria de massa em tumores do xenoenxerto indicada DHT (barra cinza) (passadas em ratos intactos). (E) A expressão relativa de transcritos para os genes esteroidogênicas indicados foi calculado usando o método delta dCt (dobre mudança = 2∧ddCt). Os genes diferencialmente expressos em LuCaP35 vs LuCaP96 dentro de uma ordem de grandeza são indicados dentro das linhas cinzentas. Diferenças significativas (pelo teste t de Welch; p 0,05) são indicados por círculos pretos; círculos brancos indicam genes que não foram significativamente diferentes entre LuCaP35 e LuCaP96 (todos os valores apresentados nos dados Suplementar 2) triângulos .Upward indicam genes altamente diferencialmente expressos especificamente levando a um aumento T (AKR1C3, 40 vezes) ou o aumento dos níveis de DHT (SRD5A1, 5,0 vezes ; 17BHSD10 4,8 vezes; RLHSD, 99 vezes). triângulos para baixo indicam genes altamente diferencialmente expressos especificamente mediando DHT catabolismo (AKR1C2, 7 vezes; UGT2B15, 3000 vezes).

Para identificar mecanismos contribuir para diferenças basais nas concentrações de DHT T intra-tumoral e, avaliamos a expressão específica de tumor de transcritos que codificam as enzimas principais envolvidas na síntese e degradação (Figura S1) de esteróides. Enquanto muitos genes foram expressos em esteroidogênicas LuCaP35 dentro de uma ordem de grandeza da sua expressão em LuCaP96 (Figura 1E), várias diferenças consistentes com os diferentes perfis de androgénio tumorais estavam presentes. Em particular, a expressão de genes em LuCaP35 foi consistente com a produção de androgénio e manutenção dos níveis de DHT, demonstrando níveis elevados de genes da biossíntese de esteróides, tais como a estrela (10 vezes) e HSD3B1 (10 vezes), maior expressão de genes que medeiam a produção de DHT (SRD5A1 , 5 vezes; 17BHSD10 de 4,8 vezes, RLHSD, 99 vezes), e uma menor expressão de genes mediadores de DHT catabolismo (AKR1C2, 7 vezes mais baixa; UGT2B17, 3000 vezes inferior). Em contraste, a expressão de genes em LuCaP96 foi consistente com a produção e manutenção de T, com níveis significativamente mais elevados de AKR1C3 (40 vezes; consistente com um aumento na produção de T a partir da androstenodiona), em conjunção com os níveis mais baixos de SRD5A1 (a principal enzima responsável para conversão de T em DHT no tecido prostático neoplásico) [32] e os níveis mais elevados de enzimas do catabolismo de DHT e AKR1C2 UGT2B17. (Limiares ciclo e dobre alterações para todos os genes na Figura 1E são apresentados na Tabela S2). Uma vez que estes tumores foram propagados em hospedeiros murino geneticamente idênticos, estes dados identificar a variação específica do tumor intrínseca em programas metabólicos andrógenos culminando com diferenças intratumorais marcados em concentrações de ligando AR.

Pré-receptor supressão pathway de andrógeno com a castração mais SRD5A inibição demonstra um impacto específico do tumor em retardar a progressão para CRPC

Dada a 5-10 vezes maior potência de DHT em se engajar e ativar AR em comparação com T, [25], [26] estratégias que visem a redução DHT inibindo metabolismo de T em DHT pode representar um método eficaz pré-receptor para suprimir a magnitude global da sinalização de AR. Para determinar se as diferenças específicas do tumor na razão basal da T intratumoral: DHT iria influenciar a resposta clínica aos agentes de segmentação conversão de T em DHT, que tratada coortes de ratinhos portadores de tumores LuCaP35 e LuCaP96 com castração sozinho, ou castração mais o inibidor SRD5A duplo dutasteride. SCID machos intactos foram implantadas subcutaneamente com 30 mm

3 peças de tumores LuCaP35 ou LuCaP96. Após crescimento até -300 mm

3, os ratinhos foram castrados e randomizados para veículo ou dutasterida administrado por sonda oral durante 8 semanas.

volumes médios de tumor em tumores LuCaP35 foram marcadamente suprimida pela combinação de castração mais dutasterida vs castração sozinho (Figura 2A). O crescimento do tumor ocorreu em três fases distintas, após o início do tratamento: um breve período de crescimento contínuo (0-14 dias), uma fase prolongada da regressão do tumor ou a sua estabilidade (dias 14-75), e uma fase final de tumor de re-crescimento ( 75-200 dias). Para melhor quantificar o impacto de dutasterida, comparou-se o volume do tumor em trajectórias castração vs grupos de castração mais dutasterida usando um modelo misto linear aplicada a cada fase de pós-tratamento. Dutasterida mais castração diminui significativamente a percentagem de aumento no volume do tumor por dia em relação a castração só na fase inicial “durante o tratamento ‘(a partir de 3,2% [IC 95% 2,7-3,7] a 0,9% [IC 95% 0,2-2,0], p 0,0001), e aumentou a percentagem de regressão do tumor por dia na fase subsequente (a partir de 1,2% [IC 95% 0,5-1,8] a 3,6% [IC 95% 2,0-5,3], p 0,0001). No entanto, após a interrupção da terapia, os tumores tratados com dutasterida demonstrado por cento re-crescimento mais rápido por dia (a partir de 1,1% [IC 95% 0,9-1,3] a 2,3% [IC 95% 1,8-2,9], p 0,0001), sugerindo a continuação do tratamento seria necessário para manter a eficácia terapêutica.

a média de volume de tumor em ratinhos portadores de LuCaP35 (a) e (B LuCaP96 xenoenxertos). SCID machos intactos foram implantadas subcutaneamente com 30 mm

3 peças do xenotransplante indicada. Quando os tumores atingiram ~300mm

3, os ratinhos foram castrados e escolhidos aleatoriamente em grupos tratados com veículo (Cx) ou dutasterida (Cx + Dut) durante 8 semanas (indicado pela linha preta acima eixo-X). A média de volumes tumorais são descritos para cada grupo de tratamento nos dias indicados postar inscrição (Cx, quadrados pretos; Cx + Dut, círculos brancos).

Por outro lado, os volumes dos tumores em tumores LuCaP96 não foram reprimidas pela adição de dutasterida a castração (Figura 2B), sem qualquer alteração na taxa de risco (RR) para PFS (HR 0,9, p = 0,97; não mostrado). Para examinar quanto a diferença não significativa foi devida ao número de animais, que bootstrap a partir dos dados originais 500 vezes e verificou que, mesmo com n = 170 ratinhos por grupo de tratamento, uma modesta (HR 1,4), mas uma melhoria estatisticamente significativa na sobrevivência foi observado em apenas 50% de iterações, o que sugere a probabilidade de detectar um efeito de tratamento clinicamente significativa em um estudo maior era baixa. Em geral, estas observações demonstram que o pré-receptor de androgénio com supressão via castração mais SRD5A inibição pode retardar a progressão para o crescimento resistente a castração. No entanto, esta resposta não é universal, mas, em vez parece ser específico do tipo de tumor, e está associada com os tumores exibindo um perfil de enzima metabólica androgénio dirigida a manter os níveis de DHT intratumorais tais como LuCaP35, em vez de um tumor t-predominante, tais como LuCaP96.

o tamanho do tumor no início do tratamento influencia a resposta a longo prazo para supressão androgênica mais SRD5A inibição

para examinar melhor as características do tumor associados com a resposta de pré-receptor inibição da via AR, determinou-se a resposta para o tratamento estava relacionado com o tamanho do tumor no início do tratamento. Embora o estudo foi concebido para iniciar o tratamento com um volume de tumor de -300 mm

3, logística das experiências com animais resultou em uma variação mensurável do tamanho do tumor no início do estudo. Nós arbitrariamente agrupados tumores em coortes de 250 mm

3, 250-400 mm

3 e 400 mm

3 no momento da inscrição e comparou o efeito da castração vs castração mais dutasteride dentro de cada grupo . Notavelmente, a melhoria significativa na sobrevivência média transmitida pelo dutasteride em toda a coorte LuCaP35 (de 152 para 337 dias, a HR para a progressão de 2,8 [IC 95% 1,4-4,6], p = 0,0015; Figura 3A), apareceu predominantemente devido a um impacto em tumores que eram menores ( 250 mm

3) no momento da inscrição (HR para a progressão de 7,3 [IC 95% 2,2-30], p 0,0015, contra a castração só; Figura 3B). Em contraste, a combinação de castração além de 8 semanas de dutasterida fez impacto não estatisticamente PFS em tumores medindo 250-400 mm

3 ou 400 mm

3 no momento da admissão (não mostrada); no entanto, isso pode refletir diminuição da potência associada com o post-hoc sub-classificação dos grupos

Gráficos de Kaplan-Meier de sobrevida livre de progressão. (definido como o tamanho tumor de 750 mm3) em todos os tumores tratados com LuCaP35 castração sozinho (Cx) vs castração + dutasterida (Cx + Dut) (a), e em tumores inscritos em tratamento quando os tumores eram 250 mm

3 (B). P-valores para comparações curva foram gerados por meio do teste de Mantel-Haenszel logrank. A média de curvas de crescimento do volume do tumor nos dias indicados postar a inscrição em tumores LuCaP35 inscritos em tratamento quando os tumores foram 250 mm

3 (c), entre 250-400 mm

3 (D), e 400 mm

3 (E). tratamento dutasterida foi continuada durante 8 semanas (indicado pela linha preta acima eixo x) no grupo de castração + dutasterida.

de inspecção das curvas de volume de tumor sugeriu um efeito supressor da dutasterida foi mantida mesmo após a descontinuação do terapia para tumores 250 milímetros

3 no início do estudo (Figura 3C). Em contraste, o crescimento do tumor foi suprimido em relação à castração em tumores 250 mm

3 no início do estudo (Figura 3D, 3E), mas apenas enquanto os tumores estavam sob terapia. Após a interrupção, o tamanho do tumor nestes coortes arrebatados para os tumores tratados com a castração sozinho, de modo que foi observada em última análise, não houve diferença na sobrevivência. O volume de tumor de partida não foi associada com a sobrevivência em tumores tratados com LuCaP96 dutasterida (não mostrado).

supressão sistémica androgénio mais inibição SRD5A diminui significativamente os níveis de DHT supressão do tumor comparada com androgénio sozinho

Para determinar se o impacto diferencial da inibição SRD5A no crescimento do tumor refletiu uma diferença de supressão de andrógenos intratumorais, medimos os níveis de T e DHT em tumores ressecados após o tratamento. Em ambos os tipos de tumor e LuCaP35 LuCaP96, média do tumor medidos os níveis de DHT em 3-21 dias (indicado por duas cabeças setas na Figura 4A e 4B) eram substancialmente mais baixos em castração mais dutasterida versus os grupos de castração sozinho, com valores em LuCaP35 suprimidos de 0,40 ± 0,56 ng /g para 0,02 ± 0,04, p = 0,007 e em LuCaP96 de 0,10 ± 0,08 ng /g para 0,02 ± 0,01, p = 0,005 (resumidos na Tabela S1).

testosterona do tecido (T , barras pretas) e os níveis de DHT (barras cinzentas) foram medidos por espectrometria de massa em LuCaP35 (a) e LuCap96 (B) tumores ressecados a partir de ratinhos intactos (n Cx), e de ratinhos tratados com castração sozinho (Cx) ou castração + dutasterida (Cx + Dut) em pontos de tempo iniciais (d3-21, enquanto ainda está em terapia, indicado pelas setas de cabeça dupla), ou pelo re-crescimento resistente à castração (definida como 750 mm

3). Os valores de P calculados a partir do teste t de duas amostras de Welch (p 0,05 foram considerados significativos). estrelas individuais indicam uma diferença estatisticamente significativa nos níveis de DHT entre Cx vs. Cx + Dut tratados amostras a d3-21 do tratamento. estrelas duplas indicam uma diferença significativa nos níveis de DHT entre amostras Cx vs. Cx + Dut tratados, mesmo após re-crescimento castração recorrente. Nenhum outro comparações entre Cx versus grupos tratados Cx + Dut foram significativas. Expressão de comprimento completo (FL) e a AR AR variante 7 (ARV7) variante de splicing truncado foi medida em LuCaP35 (C) e LuCaP96 (D) no momento do re-crescimento do tumor de 750 mm

3. expressão transcrição foi medida por qRT-PCR e normalizado para expressão do gene de manutenção RPL13A dentro de cada amostra para se obter o ciclo limiar delta (dCt). A diferença relativa na expressão entre os grupos de tratamento indicados foi calculado usando o método delta dCt (dobre mudança = 2∧ddCt). Os valores de p calculado a partir de testes t de duas amostras de Welch (p 0,05 foram considerados significativos)

Curiosamente, enquanto que os níveis de T em tumores LuCaP35 permaneceram suprimidos em cada grupo de tratamento (Figura 4A, barras pretas), DHT. níveis em tumores LuCaP35 recorrentes terapia depois de combinados foram semelhantes aos tumores recorrentes após a castração sozinho (211 dias após a descontinuação do dutasteride médio) (0,54 ± 0,46 ng /g e 0,61 ± 0,63 ng /g, respectivamente; barras cinzentas). Em contraste, os níveis de DHT em LuCaP 96 tumores recorrentes terapia após combinada (média de 96 dias após a descontinuação do dutasteride) permaneceu suprimida meses após a cessação do dutasteride (Figura 4B, 0,04 ± 0,04 ng /g em comparação com 0,53 ± 0,46 ng /g para sozinho castração ), enquanto que os níveis T mostrou a reconstituição significativa após uma castração sozinho ou após a terapia combinada (1,34 ± 0,89 ng /g e 0,79 ± 0,71 ng /g, respectivamente, e Tabela S1). De nota, a meia-vida da dutasterida em ratinhos é inferior a 2 dias [33], que impedem um efeito residual de inibição SRD5A em concentrações de esteróides em 96 versus 35 tumores no momento da ressecção. níveis de androgénio do tumor em tumores LuCaP35 no momento do re-crescimento não foram associados com o tamanho do tumor no início do estudo (dados não mostrados).

A tendência para a reconstituição dos níveis de DHT no LuCaP35 e de T em LuCaP96 é consistente com a variação intrínseca em programas de androgénio metabólicos favorecem DHT vs t identificado nos tumores não tratados (Figura 1E). Além disso, a expressão relativa de genes esteroidogênicas em LuCaP35 contra tumores LuCaP96 recorrentes após a castração vs castração mais dutasterida foi muito semelhante aos padrões de expressão observados em tumores não tratados (Figura S2). Colectivamente, estes dados mostram que a dutasterida inibiu eficazmente a produção de DHT em ambos os tipos de tumores, e que o crescimento tumoral é susceptível LuCaP35 para a supressão de pré-receptor de DHT aumentada conseguida com a combinação de castração mais SRD5A inibição, ao passo que não é LuCaP96.

supressão sistémica androgénio mais inibição SRD5A está associada com as diferenças específicas do tipo de tumor na indução de AR de comprimento completo e de splice variants AR

tumores da próstata resistentes à castração são frequentemente caracterizadas por um aumento da expressão de AR de comprimento completo ( AR

FL), e como relatado recentemente, por aumento da expressão de AR

SV que falta o LBD e consequentemente conferir actividade de AR independente do ligando constitutiva. Diferenças na AR

FL e AR

SV níveis pode contribuir para a variação das respostas de crescimento tumoral após a supressão do ligando pré-receptor. Portanto, avaliamos a expressão de AR

FL ea AR prevalente

sv identificados em amostras CRPC humanos, AR

V7 (que codifica a mesma proteína como AR

V3) em tumores LuCaP35 e LuCaP96 recorrente após ADT e dutasteride [13], [14], [16], [17], [34].

em comparação com tumores ressecados de ratos intactos, tumores LuCaP35 recorrentes após a castração ou após a castração mais dutasterida demonstrou uma aumento de 2,0 vezes na expressão de AR

FL, e nenhum aumento na AR

V7 (Figura 4C, e Tabela S3). Em contraste, enquanto que os tumores recorrentes após a castração LuCaP96 sozinho demonstrou uma 1,9 vezes o aumento da expressão semelhante da RA

FL, eles também demonstraram um aumento de 10 vezes na expressão substancial de AR

V7 (Figura 4D).