Abstract

Regulador de Cullins-1 (ROC1) é uma subunidade chave no complexo de proteínas Cullin-RING ligase (LCR). Superexpressão da proteína ROC1 está associada com a progressão do tumor e mau prognóstico do carcinoma de células transicionais não-invasiva músculo da bexiga (NMIBC). Este estudo foi desenhado para avaliar os efeitos da ROC1 knockdown em células de câncer de bexiga e para determinar os possíveis mecanismos envolvidos. Um total de 112 amostras de tecido de cancro da bexiga foram recrutados para análises de imuno-histoquímica de ROC1 superexpressão. linhas celulares de cancro da bexiga foram usadas para knockdown expressão ROC1 usando ROC1 siRNA. Os nossos dados mostraram que ROC1 knockdown crescimento de células cancerosas da bexiga significativamente inibida, células paradas na fase G2 do ciclo celular, e induziu a senescência celular dependente de p53. detenção molecularmente, G2 foi associada com a regulação positiva de p21, p27, ciclina B1, e proteínas Cdc2. ROC1 knockdown induzida por senescência funcionava através de via p53 /p21. Knockdown de expressão p21 parcialmente resgatado ROC1 inibição do crescimento induzida knockdown em células cancerosas. Além disso, xenotransplante nu rato análises confirmaram esses

in vitro

dados. Em conclusão, os dados do presente estudo indicam que ROC1 desempenha um papel essencial na progressão do cancro da bexiga e poderia servir como um alvo anticâncer da novela para carcinoma de células transicionais da bexiga (BTCC)

Citation:. Wang W, Liu Z, Qu P, Zhou Z, Zeng Y, Fan J, et al. (2013) Knockdown de Regulador de Cullins-1 (ROC1) Expressão Induz o cancro de bexiga parada do ciclo celular na fase G2 e senescência. PLoS ONE 8 (5): e62734. doi: 10.1371 /journal.pone.0062734

editor: Xiaolin Zi, University of California Irvine, Estados Unidos da América

Recebido: 16 Janeiro, 2013; Aceito: 25 de março de 2013; Publicado em: 08 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa ‘Shanghai líderes acadêmicos do Sistema de Saúde (No. XBR2011038). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga é o quarto câncer mais comum e é a oitava causa de morte por câncer entre os homens no mundo [1]. Histologicamente, o carcinoma de células de transição da bexiga (BTCC) é o subtipo mais comum e é responsável por ~ 90% de todos os cancros da bexiga [2]. Clinicamente, 20% a 30% dos casos de cancro da bexiga recentemente diagnosticados invadiram na camada muscular (chamado de carcinoma de células transicionais músculo-invasivo, MI-TCC), enquanto que um adicional de 10% a 30% dos cancros da bexiga nonmuscle-invasiva acabará progresso a MI-TCC [3]. Até à data, o tratamento de cancro da bexiga depende da profundidade de o tumor invadir na parede da bexiga; para pacientes MI-CTP, a quimioterapia baseada em cisplatina é geralmente recomendado após a cirurgia [2]. No entanto, a toxicidade grave de quimioterapias e relativamente baixa eficiência anticancerígeno limitar a sua amplamente aplicação na clínica e maioria dos MI-TCC acabará por evoluir e recorrência, levando ao mau prognóstico de pacientes MI-CTP [2], [4]. Portanto, a identificação de novos alvos anticancerígenos eficazes e agentes é de grande importância clínica e urgentemente necessária.

Para este fim, nós nos concentramos nas ligases Cullin-ring (CRL) (também conhecido como Skp1, Cullin, ou F proteína -box [SCF]), que são a maior família de ligases de ubiquitina E3. Devido à capacidade de mediar a ~ 20% substratos de proteína alvo para a degradação ubiquitinados-proteassoma [5], CRL desempenhar um papel importante na ubiquitinação de proteínas relacionadas com o ciclo celular ou a outras proteínas (por exemplo, proteína de replicação do ADN, de proteínas de transdução de sinal, o gene factor de transcrição) [6]. Disfunção seus associados com o desenvolvimento e progressão do tumor, sugerindo que a LCR pode ser um alvo potencial anticanceroso. MLN4924, um inibidor de molécula pequena para CRL inactivado por inibição da actividade de culinas, pode eficazmente inibir o crescimento de várias células [7] cancerosas, sugerindo ainda a importância de LCR em manter o crescimento do tumor [8], [9]. No entanto, Regulador de Cullins-1 (ROC1), outra subunidade chave da CRL que heterodimerizes com Cullins distintas para constituir os núcleos catalíticos, cuja função associada ao câncer é mal entender [5]. ROC1, também conhecido como caixa do anel de proteína-1 (RBX1), contém um pequeno domínio de ligação de zinco chamado o dedo anelar, é uma proteína evolutivamente conservadas da levedura ao ser humano e desempenha um papel essencial no desenvolvimento embrionário [5]. expressão aberrante de ROC1 leva a disfunção CRL e provoca letalidade embrionária [10]. Recentemente, alguns estudos têm enfatizado o seu papel em cancros humanos desde ROC1 pode ser essencial para a manutenção da integridade do genoma [11]. Na lógica, a superexpressão de ROC1 causada aberração do metabolismo de proteínas devido à desregulamentação de proteína ubiquitinação pós-translacional, e, eventualmente, impactar no desenvolvimento e progressão do câncer. De facto, a expressão ROC1 influenciar o desenvolvimento de melanoma da pele através do controlo cyclinD1 degradação [12]. Consistentemente, os nossos dados preliminares mostraram que a proteína ROC1 é sobre-expresso no cancro da bexiga não-músculo invasivo, sugerindo seu potencial papel no desenvolvimento e progressão do câncer de bexiga. No presente estudo, determinou-se os efeitos da ROC1 knockdown em câncer de bexiga e os potenciais mecanismos subjacentes para fornecer um novo alvo para o tratamento de cancro da bexiga no futuro.

Materiais e Métodos

amostras de tecido

neste estudo, nós primeiro recrutados 112 casos amostras de tecido BTCC de pacientes submetidos a cirurgia em Shanghai Jiao Tong University afiliados primeiro hospital entre janeiro de 2004 e maio de 2006. Estes pacientes incluídos 83 homens e 29 mulheres e foram diagnosticados patologicamente com BTCC primária e idade desses pacientes foi de entre 30 e 86 anos (idade média de 64 anos). Setenta e um pacientes foram submetidos a ressecção transuretral, 24 pacientes foram submetidos a cistectomia parcial, e 17 pacientes foram submetidos a cistectomia radical. O grau e estágio dos tumores foram avaliados de acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) de 1973 critérios e pelo Comité Misto americana sobre o Câncer (AJCC) 2002 sistema TNM. Além disso, os tecidos normais da bexiga distantes também foram recolhidas que eram mais de 5 cm de distância da margem do tumor para este estudo. Um protocolo para o uso de amostras cirúrgicas humanos foi aprovado pela Comissão de Ética Médica do Hospital da Shanghai Jiao Tong University de Xangai Primeiro as pessoas (Permit Number: 2011K047) e consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente

Imunohistoquímica

arquivados blocos de tecido fixados em formalina e embebidos em parafina desses pacientes foram seccionados por 4 mm de espessura e usado para imuno-histoquímica, eo protocolo utilizado foi de acordo com a descrição do Pan [13]. Um anticorpo policlonal contra ROC1 (Abcam, Cambridge, MA) ou Ki67 (Epitomics, China) foi diluída em 1:300 e utilizado para corar imunohistoquimicamente estas secções de tecido utilizando um protocolo normalizado com o kit de Polímero Envision dupla marcado (BioGenex, San Ramon, CA) de acordo com as instruções do fabricante. As secções foram então contrastadas com hematoxilina e avaliada de forma independente por dois patologistas.

linhas celulares e Cultura

cancro da bexiga humana RT4, 5637, BIU87, 253J, T24, e linhas de células EJ foram adquiridos de da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China) e cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco, CA, EUA) com soro fetal bovino a 10% (FBS) (Gibco). As células foram cultivadas numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 ambiente a 37 ° C. Além disso, células uroteliais normais (NUC) foram obtidos a partir de tecidos de bexiga frescas de 2 dadores jovens (30 e 32 anos de idade) e cultivadas a 37 ° C com 5% de CO

2 em meio isento de soro de queratinócitos (KSFM; Gibco) suplementado com 1% FBS, 100 UI mL

-1 penicilina e 100 UI mL

-1 estreptomicina.

ROC1 siRNA e transfecção

diferentes oligonucleotídeos siRNA para o vário genes (tais como ROC1 ou p21) foram obtidos da Invitrogen (Carlsbad, CA) e usado para a transfecção em células cancerosas da bexiga. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 6 poços durante a noite e no dia seguinte, foram transfectadas com ARNsi ROC1 usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As sequências ROC1 siRNA foram 5′-GACTTTCCCTGCTGTTACCTAA-3 ‘; para p21, 5’-GACCAUGUGGACCUGUCAC-3 ‘; e para o controlo scrambled, 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3 ‘. As células foram então sujeitas a extracção de proteínas ou outros ensaios, como listado abaixo.

Extracção de proteínas e de Western Blot

proteína celular foi extraído das células com e sem transfecção de genes utilizando um tampão de lise. Após quantificação, os lisados ​​de proteína foram resolvidas num gel de SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de PVDF (Millipore, Billerica, MA), e coradas imunologicamente com um anticorpo contra ROC1 (Abcam), GAPDH, Rb, ciclina B1 (Epitomics), p16 , p21, p27, p53, pRb, ciclina D1, e cdc2 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) e, em seguida, com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano. O anticorpo ligado foi visualizado utilizando a metodologia de luminescência química padrão.

proliferação celular e ensaios de formação de colónias

Para avaliar os fenótipos celulares alterados pelo knockdown de expressão ROC1, nós células transfectadas com siROC1 ou siCONT para 24 h e, em seguida, dividido e semearam-se as células em placas de 96 poços com 2000 células por poço, em triplicado. Aos 24, 48, 72, 96 e 120 h após a transfecção, a proliferação celular foi avaliada utilizando o Kit-8 kit celular Contagem (Beyotime, China) de acordo com as instruções do fabricante.

Para a formação de colónia, o duplicado As células foram semeadas em placas de cultura de 35 mm a 400 células (253J) ou 1000 (5637 células por poço) em triplicado. Após 9 dias de incubação a 37 ° C, as colónias foram coradas com violeta de cristal em metanol a 50% e o número de colónias de 20 ou mais células foram contadas.

Ensaio de citometria de fluxo

Para detectar a distribuição do ciclo celular alterado, foram primeiro transfectados siRNA em células cancerosas da bexiga e, em seguida, fixa-los durante a noite em etanol gelado a 70%. No dia seguinte, as células foram lavadas duas vezes com solução salina de fosfato gelada tamponada (PBS) e depois coradas com iodeto de propídio (PI; a 20 ug /ml, Sigma) durante 5 min. As amostras de células foram então analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACScan BD para distribuições do ciclo celular. Para a avaliação da fase de mitose, as células foram coradas com PH3 /PI usando o anticorpo específico de H3 Alexa 647-conjugado fosfo-histona (Cell Signaling Technology), de acordo com as instruções do fabricante.

A senescência celular associada a β-Galactosidase Ensaio expressão

senescência celular associada-de-β-galactosidase atividade (SA-β-Gal) foi medida utilizando um kit de detecção de senescência celular (Beyotime, China) de acordo com as instruções do fabricante. As células com actividade β-galactosidase positivo (cor azul) a pH 6,0 foram contadas sob um microscópio de luz e média.

Avaliação do celular Morfologia e Imuno fluorescência de coloração de Phospho-γH2AX

Após transfecção com siROC1 ou siCONT durante 24 h, as células cancerosas da bexiga foram divididos e re-semeadas em placas de cultura de 24 poços e cultivadas durante 72 h. A morfologia celular foi observada sob um microscópio invertido. As células com alterações morfológicas alargada e achatadas foram considerados como senescentes-positivo. Para coloração γH2AX focos, as células foram transfectadas com siROC1 ou siCONT durante 96 h, e, em seguida, fixadas com 4% de paraformaldeído, permeabilizadas com 0,5% de Triton X durante 10 min, e depois bloqueadas com albumina de soro bovino a 5% (BSA). As células foram então incubadas com um anticorpo primário anti-fosfo-γH2AX (Epitomics) a 4 ° C durante a noite. As células foram ainda incubadas no dia seguinte com um anticorpo secundário Alexa 548-conjugado (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 1 h à temperatura ambiente, e contrastadas com 4, 6-diamidino-2-fenilindole solução (DAPI) (1 ug /ml de Sigma) e examinadas e avaliadas sob um microscópio fluorescente.

RT-PCR quantitativo

O ARN total foi isolado utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) e depois reversamente transcrito em ADNc utilizando uma transcrição reversa PrimeScript sistema (Takara, China) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de cDNA foram então amplificados utilizando o kit mestre de mistura SYBR Green (Takara). Sequências dos iniciadores utilizados estão disponíveis mediante solicitação. Todas as medições foram realizadas em triplicado. Amplicon foi analisada utilizando o método ΔΔCt [14].

In vivo

mouse xenoenxertos Ensaio

Para avaliar os efeitos da ROC1 knockdown

in vivo

, realizou-se um rato nu (atímicos, BALB /C nu /nu) ensaio de xenoenxerto, ou seja, 5 x 10

6 5637 células em 50 ul de PBS misturado com um volume igual de Matrigel (BD Biosciences) foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus (com idade entre 4-6 semanas de idade). Uma semana após a inoculação das células tumorais, 12 ratos foram divididos em 2 grupos (6 murganhos em cada grupo, o diâmetro do tumor é de aproximadamente 0,5 cm) e intratumoral injectados com 5 x 10

8 cópias de Lenti-shROC1 na LT grupo -ROC1 ou 5 × 10

8 cópias de Lenti-shCONT na LT-CONT, respectivamente. sequências ShROC1 ou shRNA controle foram de acordo com um estudo anterior [15]. O tamanho do tumor foi medido todos os dias utilizando um compasso de calibre, e o volume do tumor foi calculado utilizando a equação (L x W

2) /2 (em que L e W representados o diâmetro longitudinal e transversal mais longo, respectivamente). Após 7 semanas de observação, os ratinhos foram mortos e xenoenxertos de tumor foram removidos, pesados ​​e fotografado. Este estudo seguiu manejo dos animais e os procedimentos experimentais e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal do Hospital da Shanghai Jiao Tong University de Xangai Primeiro as pessoas.

Análises Estatísticas

Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (SEM). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o método de teste t de Bonferroni após a análise de uma via de variância (ANOVA) para comparação multi-grupo. Duas comparações entre os grupos foram analisados ​​utilizando um teste t de Student.

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL).

Resultados

A superexpressão da proteína ROC1 no BTCC de tecido amostras e linhas celulares

neste estudo, foi detectada pela primeira vez a expressão da proteína ROC1 usando imuno-histoquímica em 112 casos de amostras de tecidos normais e BTCC, e seis linhas celulares. Os nossos dados mostraram que a proteína ROC1 foi fracamente expresso em 18 dos 24 (75%) urotélio bexiga normal, enquanto proteína ROC1 foi altamente expresso em tecidos de cancro da bexiga (fig. 1), isto é, entre estes 112 espécimes de tecidos BTCC, proteína ROC1 foi moderadamente ou fortemente expresso em 29 (25,9%), e 66 (58,9%) amostras, respectivamente. Além disso, a proteína ROC1 foi expressa em todas as linhas humanos BTCC celulares (RT4, 5637, BIU87, 253J, T24, e EJ) em comparação com as células uroteliais humanas primárias (Fig. 1).

A e B, imuno-histoquímica (ampliação de × 400). seções tissue microarray manchadas foram marcados por quatro grupos de acordo com a intensidade de coloração. C, análises de Western blot de expressão ROC1 em várias linhas de BTCC celulares e células uroteliais normais (NUC).

A inibição da BTCC celular Crescimento Seguindo Knockdown de ROC1 Expressão

Para avaliar o papel de ROC1 no cancro da bexiga, que derrubou expressão ROC1 em linhas celulares BTCC usando ROC1 siRNA e uma siRNA mexidos como controle. Nossos dados mostraram que ROC1 siRNA bateu com sucesso para baixo expressão da proteína ROC1 em 253J e 5637 células (Fig 2A e B).

A, células C, E, 253J. B, D, F, 5637 células. Estas duas linhas de células foram transfectadas transientemente com siROC1 ou siCONT de 24-120 h e, em seguida, submetida a Western blot (A e B) as análises de expressão ROC1 às 72 horas pós-transfecção, a viabilidade celular CCK8 (C e D), ou a formação de colónias (e e F) ensaio. Os resultados representativos de três experiências independentes são apresentados como média ± SEM. **

P

. 0,01

Em seguida, avaliamos os efeitos da siROC1 knockdown nestas células de câncer de bexiga e descobriu que células siROC1 cresceu notavelmente mais lento do que os das células siCONT (

P Art 0,01 a 72 h, 96 h e 120 h; a Fig. 2C e D). ensaio de formação de colónias mostraram ainda que o número de colónias foi reduzido para 5 a 10 vezes em células siROC1 comparada com a de células siCONT (

P

0,01; Fig. 2E e F).

ROC1 knockdown preso células na fase G2 do ciclo celular

Nós determinamos a distribuição do ciclo celular após ROC1 knockdown em células de cancro da bexiga e descobriu que ambos 253J e 5637 células após ROC1 knockdown preso no G2-M fase do ciclo celular. Especificamente, as células 253J seguir transfectadas com ROC1 siRNA para 48, 72, 96, 120h aumentou a fase G2-M para 11,88 ± 0,27%, 15,68 ± 0,56%, de 16,8 ± 0,42%, e 10,8 ± 0,78%, respectivamente, em comparação com 6 a 8% nas células de controlo (Fig 3A), ao passo que 5637 células foram de 18 ± 1,41%, de 35,5 ± 0,73%, 54,5 ± 2,12% e 46,27 ± 4,62%, respectivamente, em comparação com 11 a 14% nas células de controlo ( Fig 3B). Estes dados demonstram que a G2-M prisão em ambas as células atingiram pico em 96 horas pós-transfecção.

A e B, induzida ROC1 knockdown detenção do ciclo celular G2-M em 253J (A) e 5637 (B) células. As células foram transfectadas com siROC1 ou siCONT para 48-120h, e o perfil do ciclo celular foi detectada utilizando FACS análises após iodeto de propídio (PI) coloração. C e D, ROC1 knockdown paragem do ciclo celular G2 induzido. 253J 5637 células (D) (C) e foram transfectadas com siROC1 ou siCONT durante 96 h, e submeteu-se a análise por FACS depois de fosfo-histona 3 (PH3) /PI dupla coloração. E e F, a expressão de proteínas do ciclo celular associada em 253J (E) e as células 5637 (F) foram examinadas utilizando Western Blot pós-transfecção no intervalo de tempo indicado. Os resultados representativos de três experiências independentes são apresentados. Colunas, com média de três experimentos independentes; bares, SEM. **

P

. 0,01

Em seguida, investigaram a expressão dos reguladores G2-M de transição-relacionados, ou seja, a transição G2-M do ciclo celular é regulada pela um complexo de cdc2 e ciclina do tipo B. Com efeito, os nossos dados mostraram que a Cdc2 e ciclina B1 expressões eram substancialmente sobre-regulada seguinte ROC1 knockdown em ambos 253J (Fig. 3E) e 5637 células (Fig. 3F). Determinou-se também a expressão de inibidores de CDK, tais como p21 e p27 e descobriram que p21 e p27 foram significativamente acumulado sobre ROC1 knockdown em ambas as linhas celulares (Figura 3E e F). Ciclina D1, um regulador do ciclo celular bem conhecida da fase G1, também foi marcadamente induzido por ROC1 knockdown em ambas as linhas celulares (Fig 3E . F).

Para examinar melhor ROC1 knockdown células cancerosas presos no G2 ou fases M, Foram realizadas análises FACS seguinte fosfo-histona H3 (PH3) /iodeto de propídio (PI) de dupla marcação destas linhas celulares. Histona H3 é um indicador da mitose, quando a Ser10 fosforilada durante a fase M, mas não em fase G2 [16]. Em comparação com células siCONT, siROC1 mostrou menos coloração positiva H3-fósforo-histona em ambos 253J e 5637 células (Figura 3C e D), indicando que as células siROC1 preso na fase G2 em vez da fase M. Consistente com estes resultados, os dados de Western blot mostrou que ROC1 knockdown reduzida expressão PH3 (Fig 3E . F). Diminuição da expressão de proteína PH3 e reduziu células mitóticas indicam que ROC1 knockdown células preso na fase G2, mas as células impedidos de entrar na fase M.

ROC1 Knockdown Induced cancro de bexiga 253J celular Senescence Através da p53 Pathway /p21

Morfologicamente, ROC1 derrubado células 253J se tornou alargada e achatada, morfologia comumente observada em células senescentes (Fig. 4A, painéis superiores), mas não apareceu em 5637 células. Nós actividade determinou ainda associada à senescência β-galactosidase (SA-β-gal) (Fig. 4A, os painéis do meio), um marcador específico de células senescentes. Como mostrado na Fig. 4B, aproximadamente 25% das células foram coradas positivamente 253J seguinte 96h transfecção ROC1 siRNA, em comparação com coloração positiva inferior a 4% nas células de controlo (

P

0,01). Além disso, foi avaliada a expressão de fosfo-γH2AX utilizando a coloração imuno fluorescência fl, que é um marcador para a senescência celular. Os nossos dados mostraram que as células transfectadas com 253J siROC1 tinha mais focos γH2AX comparada com a das células siCONT (Fig. 4A, os painéis inferiores), indicando ainda que ROC1 knockdown induzida células 253J senescência.

A e B, 253J As células foram transfectadas com siROC1 ou siCONT durante 96 h, seguido por observação morfológica (a, painéis superiores, ampliação de × 400), coloração SA-β-gal (a, painéis do meio, ampliação x 400) e quantificadas com células coradas positivamente (B) e imuno fluorescência de coloração de fosfo-γH2AX (A, painéis de fundo, ampliação × 400). C, A expressão da proteína via associada a senescência em células 253J foi examinada utilizando Western Blot pós-transfecção, nos intervalos de tempo indicados. D, ROC1, p53, p21 ARNm em células 253J às 72h após a transfecção foi examinada utilizando quantitativa PCR em tempo real. Os resultados representativos de três experiências independentes são apresentados. Colunas, com média de três experimentos independentes; bares, SEM. **

P

. 0,01

O p16 /RB e p53 /p21 eixos são dois principais vias associadas à senescência em resposta a vários factores de stress. Desde gene p16 é suprimida em células homozygousely 253J [17], a proteína p16 foi detectada em células 253J antes e após transfecção ROC1 siRNA (Fig. 4C). No entanto, ambos os níveis de proteínas totais e de Rb fosforiladas não foram acumulados em cima ROC1 knockdown (Fig. 4C), indicando que ROC1 induzida knockdown senescência celular 253J é independente da via do gene de p16 /RB. Nossos dados mostraram regulação positiva significativa das proteínas p53 e p21 em células siROC1 em 96h e 120h seguinte ROC1 siRNA transfecção (Fig. 4C), e

p53

juntamente com

p21

mRNA upregulation também foram observadas utilizando quantitativa PCR em tempo real (Fig. 4D). Os nossos dados actuais indicam que a via de gene p53 /p21 mediada os efeitos de ROC1 knockdown na senescência celular de cancro da bexiga, uma vez que as células 253J não expressam p16, mas tem um tipo selvagem de p53, ao passo que 5637 células expressaram mutada de p53.

efeitos de ROC1 Queda sobre a inibição do crescimento do tumor celular através da expressão de p21

Para determinar se a p21 é acumulada tanto na paragem G2 induzida por senescência e ROC1 knockdown, determinou-se ainda mais o papel da p21 na mediação dos efeitos de ROC1 siRNA na regulação do crescimento de células de câncer de bexiga. Os nossos dados mostraram que a supressão simultânea do p21 e ROC1 utilizando ARNsi marcadamente atenuada expressão da proteína p21 (Fig 5A . B) e a inibição do crescimento celular atenuada causada por ROC1 knockdown em ambos 253J e 5637 células (Fig 5C . D). Em células 253J, SA-β-Gal coloração revelou que knockdown da expressão de p21 diminuiu a taxa de senescência celular induzida pelo siARN ROC1 (Fig. 5E), enquanto que em 5637 células, ROC1 silenciamentos induzida G2-M prisão foi marcadamente diminuída por knockdown p21 (Fig. 5F).

253J 5637 e as células foram transfectadas com o ARNsi indicados durante 96h, e submetidas a análises de western blot (a e B), ensaio CCK8 (C e D), com a senescência analisa SA- coloração β-gal (e), e a análise por FACS com coloração de PI (F). Os resultados representativos de três experiências independentes são apresentados. Colunas, com média de três experimentos independentes; bares, SEM. **

P Art 0,01 e ***

P

. 0,001

Efeitos de ROC1 siRNA no regulamento de 5637 Celulares xenoenxertos formação e crescimento

Temos mostrou

in vitro

efeitos da ROC1 knockdown em linhas celulares de cancro da bexiga. Nós procurado para confirmar estes dados em xenoenxertos nu do rato. Como mostrado na Fig. 6A C, injecção intratumoral de LT-ROC1 resultou num decréscimo significativo na taxa de crescimento de tumores em comparação com o grupo de controlo tratado com LT-CONT (

P

0,01). coloração imuno-histoquímica de Ki67 indicou que LT-ROC1 injecção reduzida nu xenotransplantes ratos proliferação (Fig. 6B). O peso do tumor nos xenoenxertos de LT-ROC1 foi significativamente menor do que a do grupo de LT-CONT (

P

0,05). dados de Western blot mostrou que a proteína p21 foi regulada no grupo de injeção LT-ROC1 (Fig. 6E).

A, fotografias representativas de tumores isolados de ratos sem pêlo em cada grupo de 7 semanas após a injecção de LTR e LTC. B, coloração IHC de xenoenxertos de tecidos com o anticorpo indicado em ambos os grupos. C e D, a curva de crescimento do tumor (C) e o peso do tumor (D) em ambos os grupos. E, ROC1 e proteína p21 em proteínas extraída a partir de xenoenxertos de ambos os grupos foram determinados utilizando análises de Western blot. No final das experiências, os tecidos tumorais foram excisados ​​a partir de cada rato e pesou. Colunas, o peso médio de 5 tumores de ratos individuais em cada grupo; bares, SEM. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 e ***

P

. 0,001

Discussão

no presente estudo, nós relatamos que a proteína ROC1 foi overexpressed em 112 amostras de tecido de cancro da bexiga e 6 linhas celulares em comparação com os tecidos e células normais. Knockdown de expressão ROC1 inibiu o crescimento de células da bexiga e paragem do ciclo celular G2 induzida e senescência celular dependente de p53. Molecularmente, knockdown de expressão ROC1 regulada positivamente a expressão de p21, p27, a ciclina B1 e Cdc2 proteínas. ROC1 induzida knockdown 253J células senescência foi mediada através da via gene p53 /p21, e knockdown de expressão p21 ROC1 parcialmente resgatado induzida knockdown inibição do crescimento do câncer em células BTCC. Nossa xenotransplante nu rato análises ainda confirmada nossos

in vitro

dados. Os dados atuais sugerem que ROC1 desempenha um papel importante na progressão do cancro da bexiga, e direcionamento de proteínas ROC1 é uma estratégia anti-cancerígeno potencial de câncer de bexiga.

Estudos anteriores mostraram ROC1 superexpressão em vários tipos de câncer e associado com a progressão do tumor [15], [18]. No presente estudo, confirmou estes dados em tecidos de câncer de bexiga e linhas celulares. Foram avaliados ainda mais o papel da proteína ROC1 no cancro da bexiga pelo knockdown da expressão da proteína ROC1 em duas linhas celulares de cancro da bexiga diferentes. Nós mostramos que o crescimento de células de câncer de bexiga inibiu potencialmente ROC1 knockdown

in vitro

e

in vivo

. prisão mecanicamente, induzida ROC1 knockdown ciclo celular fase G2 e senescência celular em linhas celulares de cancro da bexiga.

ciclo celular fase G2-M é um mecanismo de checkpoint do ciclo celular comum, em resposta a pressões externas e indução de G2-M prisão é uma estratégia útil no tratamento de vários cancros humanos [19]. Molecularmente, cinase cdc2 e ciclina B1 constituem M-fase factor promotor (MPF) que controlam G2-M transição e progressão da fase M [20], a actividade de cinase de que é regulado negativamente por CDK-inibidores (CDKIs, tais como p21, p27) e quinases inibidoras Cdc2 (tais como Wee1) [21]. Em nosso estudo, descobrimos que ROC1 knockdown induzida notavelmente prisão G2-M por upregulating expressão de ciclina B1 /Cdc2 proteína em ambas as células 5637 e 253J. Além disso, nossos dados adicionais indicaram que ROC1 knockdown preso células cancerosas da bexiga na fase G2, embora os mecanismos definidos não são claras. A explicação pode ser concebível que ROC1 knockdown induzida CRL inactivação que provocou a acumulação de alguns substratos CRL especiais (tais como p21, p27 e Wee1). Os nossos dados mostraram que a corrente induzida ROC1 knockdown expressão de p21 e p27. Além disso, a ciclina D1, um outro substrato CRL bem conhecido [22], também foi acentuadamente induzido por ROC1 knockdown em ambas as linhas celulares. No entanto, não foram observadas alterações significativas na prisão fase G1-S associada a ciclina D1, que podem ser desde células ROC1 knockdown preso em células em fase G2 são impedidos de entrar na fase G0-G1.

Além disso , nós também revelou que ROC1 knockdown células 253J câncer de p53 do tipo selvagem da bexiga induzida em senescência com uma maneira dependente de p53. Indução de senescência celular foi considerado como um importante mecanismo de supressor de tumor [23], [24]. Várias tensões (tais como a disfunção do telómero, a activação de oncogenes, lesão do ADN, e outros estímulos) podem iniciar a senescência celular [23]. Senescência é mediada principalmente por vias supressores tumorais dois: p53 /p21 e p16 /pRB [23], [24]. O presente estudo mostrou que ROC1 knockdown induzida senescência celular significativa em p53 células 253J do tipo selvagem, mas não induziu p53 mutante 5637 células. Além disso, o bloqueio da via do p53 /p21 por knockdown da expressão de p21 induzida por ROC1 knockdown senescência significativamente atenuadas. Estes achados sugerem que ROC1 senescência induzida knockdown está associada com uma via de p53 /p21 funcional. No entanto, Jia et al. mostrou que ROC1 senescência de pulmão e linhas celulares de cancro do colo do útero em uma p53 ou pRB- forma independente [15] knockdown-induzido. Outra questão semelhante é o que determina as células sofrem uma paragem do ciclo celular ou a senescência ou outros tipos de morte celular. O mecanismo exato permanece desconhecido, e nós supor que essa escolha pode ser associada à dependência linha de células (tais como

p

53 estado do gene, a especificidade de substratos CRL, a duração do stress, et.al) e intensidade da externo estresse [25] (como DNA danos resposta, estresse oxidativo, et.al). Assim, mais estudos são necessários para esclarecer os mecanismos definidos responsáveis ​​pela ROC1 morte celular induzida por câncer de bexiga knockdown-.

Além disso, observamos também que ROC1 knockdown inibe o crescimento do tumor de 5637 células em

in vivo

xenotransplante nu mouse com mecanismos semelhantes. Diferentes estágios de câncer de bexiga mostrou receptividade terapêutico diferenciado para radioterapia e quimioterapia [26]. Um fator determinante de susceptibilidades terapêuticos é

TP53

estado do gene [27]. As células com a proteína p53 disfuncional mostraram um aumento da resistência à radioterapia ou quimioterapia devido a reduzida resposta a danos no ADN [3], [26]. O presente estudo demonstrou que ROC1 knockdown inibiu o crescimento de células de câncer de bexiga, independentemente do status p53. Esse resultado pode ter um impacto importante para o tratamento de cancro da bexiga. ROC1 knockdown utilizando interferência gene ou inibição farmacológica pode ser uma nova abordagem para reforçar a capacidade de resposta da radioterapia e quimioterapia dos doentes com cancro da bexiga. Assim, um estudo mais aprofundado irá investigar tais abordagens em controlar eficazmente o cancro da bexiga.

Em conclusão, o presente estudo mostrou que ROC1 desempenha um papel importante na progressão do BTCC e ROC1 poderia ser um alvo anti-câncer de romance no BTCC. Novos estudos que esclareçam os mecanismos detalhados de envolvimento ROC1 no BTCC são necessários para validar os nossos resultados preliminares.