Abstract

peptídeos de penetração celular (CPPs) de penetração celular têm provado muito eficaz como veículos de entrega intracelular para várias terapêutica. No entanto, existem algumas preocupações sobre a penetração não-específica e citotoxicidade de CPPs para tratamentos de câncer eficazes. Aqui, com base no motivo de penetração celular de um péptido anti-cancro, buforin Ilb, concebemos vários derivados de CPP com especificidade de células de cancro. Entre os derivados, um péptido 17-amino ácido (BR2) foi encontrada para ter cancro da especificidade sem toxicidade para as células normais. Após visando especificamente as células cancerosas através da interação com gangliosídeos, BR2 entrou células através macropinocitose mediada por lípidos. Além disso, BR2 apresentaram maior eficiência de translocação de membrana do que o conhecido CPP Tat (49-57). A capacidade de Br2 como um veículo de fármaco específico do cancro foi demonstrada por meio de fusão de Br2 a um anticorpo de cadeia única (scFv) dirigida para um K-ras mutados (G12V). BR2-scFv fundido induziu um grau mais elevado de apoptose do que scFv-Tat fundido em K-ras mutantes células HCT116. Estes resultados sugerem que o novo peptídeo de penetração celular BR2 tem um grande potencial como um veículo de entrega droga útil com especificidade célula cancerosa

Citation:. Lim KJ, Sung BH, Shin JR, Lee YW, Kim DJ, Yang KS , et ai. (2013) um cancro específicos de células-penetrante Peptide, BR2, para a prestação eficiente de um scFv em células cancerosas. PLoS ONE 8 (6): e66084. doi: 10.1371 /journal.pone.0066084

editor: Robert W. Sobol, da Universidade de Pittsburgh, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de novembro de 2012; Aceito: 06 de maio de 2013; Publicação: 11 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Biologia sintética Inteligente de Projeto de fronteira global financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2011-0031955). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os efeitos benéficos de muitos agentes terapêuticos potenciais recém-descoberto, tais como proteínas, ácidos nucleicos, e drogas hidrófilas, são limitados devido à sua incapacidade para atingir os alvos intracelulares apropriados [1], [2]. Assim, numerosas abordagens, tais como microinjecção, eletroporação, formulação lipossómica e a utilização de vectores virais têm sido exploradas para promover a entrega da droga eficiente [3], [4]. Uma das principais preocupações sobre essas técnicas é a sua especificidade celular pobres [4], [5]. Por conseguinte, o desenvolvimento de um sistema de administração de fármaco específico para o alvo é uma preocupação primária para melhorar a eficácia terapêutica da droga, enquanto reduz as suas doses eficazes e os efeitos colaterais [6], [7].

péptidos de penetração celular ( CPP), também referidos como domínios de transdução de proteína, têm chamado a atenção como um veículo de entrega de droga intracelular alternativa desde a descoberta do primeiro CPP, Tat, em 1988 [8]. PPLs são péptidos curtos consistindo em menos de 30 ácidos aminados e composta principalmente de, aminoácidos carregados positivamente básicos (por exemplo, Arg, Lys e His) que têm a capacidade para translocar através da membrana celular e para proporcionar uma variedade de cargas de células-impermeável entre a membrana celular [9], incluindo proteínas [10], ácidos nucleicos [11], siRNA [12], ácidos peptídicos nucleicos (PNAs) [13], moléculas terapêuticas pequenos [14], quantum dots [15], e de contraste para IRM agentes [16]. Embora o mecanismo exato de CPPs é desconhecida, recentes estudos sobre os mecanismos implicam que os seus resultados de captação celular de uma interação eletrostática inicial rápida com a membrana plasmática seguido de captação endossomal [17], [18].

Usando CPPs para o entrega intracelular de uma grande variedade de macromoléculas é uma abordagem poderosa devido à sua versatilidade emparelhado com fácil funcionalização das cargas ligadas e a eficiência de entrega elevada em várias linhas de células, ultrapassar os desafios frequentemente confrontados com outros métodos de entrega de [19], [20]. Por conseguinte, muitos estudos têm-se centrado no desenvolvimento de novos CPP; o número de disponíveis CPPs com características diferentes, tais como maior estabilidade e entrega de carga eficiente, continua a aumentar [17].

Embora o potencial de CPPs como agentes de entrega é grande, a sua falta de especificidade celular, efeitos citotóxicos e os efeitos colaterais inesperados são as principais preocupações para o seu desenvolvimento como veículos de distribuição de drogas [21]. Para a terapia de cancro, a especificidade celular CPP é especialmente importante para que os efeitos secundários sobre as células normais são minimizados [22], [23]. Portanto, existe uma forte necessidade para o desenvolvimento de específicos de cancro e de não-tóxicos PPLs para tratamentos contra o cancro eficazes.

Descrevemos previamente que um péptido antimicrobiano potente, buforin IIb (RAGLQFPVG [RLLR]

3), tem forte capacidade de penetração celular e actividade anti-cancerígena contra várias linhas celulares de cancro [24], [25]. Embora buforin IIb mostrou citotoxicidade selectiva contra células de cancro, também afectou a viabilidade de células normais em concentrações elevadas. Para desenvolver buforin IIb como um veículo de entrega da droga eficiente, a sua citotoxicidade contra células normais devem ser minimizados, mantendo a sua especificidade da célula cancerosa.

Neste estudo, foi elaborado um romance específico do cancro e não-tóxicas de células-penetrante péptido, BR2, com base no motivo de penetração celular de buforin IIb e estudado o potencial como um veículo de entrega de droga eficiente em células cancerosas através da fusão de BR2 a um fragmento variável de cadeia única (scFv) do anticorpo contra o K-ras mutados.

Materiais e Métodos

Cultura de células

linha de células de cancro cervical humano HeLa, linha de células de cancro do cólon humano HCT116, linha de células de melanoma de rato B16 /F10, linha de células de fibroblastos de rato NIH 3T3, humana a linha celular de queratinócitos HaCat e linha celular de fibroblastos humana BJ foram todos obtidos a partir de American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) e cultivadas num meio completo [meio de eagle modificado por Dulbecco] (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) , 100 unidades /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram cultivadas em condições humidificadas a 37 ° C com 5% de CO

2.

Péptido Concepção e síntese |

concebidos vários derivados de buforin IIb (BR3) por eliminação passo a passo da repete regularmente a-helicoidal C-terminal motivo RLLR de buforin Ilb para criar uma célula de cancro específico e não tóxico de CPP. Os péptidos concebidos consistiu de diferentes números de RLLR o motivo α-helicoidal regular, C-terminal e chamado RS1 e RS2 (Tabela 1).

PPLs Tat, BR1, BR2, e BR3 foram sintetizados quimicamente ( Anygen, Kwangju, Coreia) num sintetizador de péptidos MilliGen 9050. A porção de fluoresceina (FITC) foi ligado com a extremidade N-terminal por meio de um ácido espaçador aminohexanóico por tratamento de um péptido ligado à resina (0,1 mM) com FITC (0,1 mM) e diisopropil etil amina (0,5 mM) em N, N-dimetilformamida ( DMF) durante 12 h. Todos os péptidos brutos foram purificados e analisados ​​por cromatografia de fase reversa líquida de alta eficiência (RP-HPLC) numa coluna C18, e os péptidos purificados foram caracterizados por espectrometria de massa por ionização por electropulverização (ESI-MS).

confocal a laser Scanning Microscopy

Para investigar a capacidade de penetração celular e a distribuição intracelular de peptídeos internalizadas, ao vivo microscopia confocal foi realizada em três linhas de câncer (HeLa, HCT116 e B16 /F10) e três linhas de células normais (HaCat, BJ e NIH 3T3). Resumidamente, as células (2 x 10

5) foram plaqueadas numa lamela de vidro colocado em uma placa de 6 poços, cultivadas durante a noite, e, em seguida, incubadas com péptidos marcados com FITC (5 ^ M para cada linha de células) durante 30 minutos. As células foram então lavadas três vezes com salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4), e montada em lâminas de microscópio de fluorescência com uma solução de montagem (Dako Corp., Carpinteria, CA). Colocalização de Br2 com lisossomas foi observada usando Lyso Tracker Vermelho DND-99 (Molecular Probe, Eugene, OR). Para evitar os efeitos de artefactos de fixação, que envolve tanto o metanol e paraformaldeído, células não eram fixas [26], [27]. A distribuição dos péptidos marcados com FITC foi analisada usando um laser confocal de varrimento Zeiss LSM 510 microscópio (Jena, Alemanha) equipado com um 40 × 20 × e objectivo. Fluoróforos foram animado com um laser de argônio (488 nm) para FITC e um laser HeNe (543 nm) para Lyso Tracker Vermelho.

In vitro

Ensaio de citotoxicidade

A citotoxicidade do péptidos a células de mamífero foi investigada através da avaliação da libertação de lactato desidrogenase (LDH) a partir de cancro e as células normais. A quantidade de LDH libertada a partir de células danificadas para o sobrenadante foi medida utilizando o Kit de Detecção de Citotoxicidade (Roche Applied Science, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, as células foram plaqueadas em microplacas de 96 poços (1 × 10

4 células por poço) em DMEM completo suplementado com 10% FBS e incubadas durante a noite a 37 ° C para permitir a fixação e disseminação de células. Após 24 h de incubação, as células foram tratadas com várias concentrações de péptidos (0-100 pM) e incubadas durante mais 24 h a 37 ° C. O meio extracelular de cada poço foi transferido para uma nova microplaca e incubadas durante 10 min com 100 ul bem mistura /reacção, seguido de uma solução de paragem. A absorvância foi medida a 490 nm usando um leitor de placas de ELISA. libertação de LDH a partir de células lisadas com 0,2% de Triton X-100 em PBS foi definida como 100% de vazamento e a libertação de LDH a partir de células não tratadas como derrame 0%.

Ensaio de Hemólise

actividade hemolítica foi ensaiada quanto descrito por Aboudy

et al

com ligeiras modificações [28].; 3 ml de eritrócitos humanos preparados de fresco foi lavada com PBS isotónica, pH 7,4, até a cor do sobrenadante tornou-se límpida. Os eritrócitos foram lavados foram então diluídos para um volume final de 20 ml com o mesmo tampão. As amostras de péptidos (10 ul), diluído em série em PBS, foram adicionados a 190 ul da suspensão de células em tubos de microcentrífuga. Após mistura suave, os tubos foram incubados a 37 ° C durante 30 min e, em seguida, centrifugada a 4000 × g durante 5 min. O sobrenadante (100 uL) foi removido para um novo tubo e determinou-se a absorvância a 567 nm. A densidade óptica relativa, quando comparada com a da suspensão de células tratadas com 0,2% de Triton X-100, foi definida como a percentagem de hemólise. A percentagem de hemólise foi calculada usando a seguinte equação: Percentagem de hemólise = [(Abs

567 nm na solução de péptido – Abs

567 nm, em PBS) /(Abs

567 nm de 0,2% de Triton X-100 – Abs

567 nm em PBS)] × 100

Caracterização de Peptide Captação

placas

Para avaliar a internalização de peptídeos marcados com FITC, células HeLa foram semeados em 12 poços a. uma densidade de 2 × 10

5 células por poço e incubou-se durante 24 h. péptidos marcado com FITC, a várias concentrações variando de 2 a 10 uM, em seguida, foram incubados com as células durante 30 min a 37 ° C. Para comparar a absorção celular de péptidos, o cancro e as células normais foram tratados com péptidos marcados com FITC (cada, 10 mM) e incubou-se durante 30 min a 37 ° C. Após a incubação, as células foram lavadas três vezes com PBS gelado para remover o excesso de complexos extracelulares. Em seguida, as células foram tratadas com tripsina (1 mg /ml) durante 10 minutos para remover quaisquer péptidos remanescentes ligados à superfície da célula. Após tripsinização, as células foram recolhidas por centrifugação (1000 x g durante 5 min), ressuspensas com 500 iodeto ul gelada 2% de FBS /PBS contendo de propídio (PI), e em seguida imediatamente analisada (10.000 eventos /amostra) por activadas por fluorescência de células (FACS).

Para melhor compreender o mecanismo de penetração celular de péptidos, foram examinados os efeitos de temperatura e inibidores metabólicos. Para elucidar a dependência da temperatura, as células HeLa foram incubadas a 4 ° C durante 30 min antes da adição dos peptídeos. Em seguida, as células foram tratadas com os péptidos marcados com FITC (cada, 5 mM) a 4 ° C durante 30 min. Para o estudo de energia-esgotamento, células HeLa foram pré-incubadas com azida de sódio (NaN

3, 10 mM) a 37 ° C durante 1 h e, em seguida, incubadas com péptidos marcados com FITC (cada, 5 uM) a 37 ° C durante . 30 min

para estudar o papel da endocitose da captação de péptido, as células foram pré-tratadas com diversos inibidores de endocitose a 37 ° C durante 1 h: (i) amilorida (5 mM), o qual é conhecido por bloquear macropinocitose inibir um canal de sódio; (Ii) de nocodazole (100 ng /ml), que inibe a via mediada por clatrina; e (iii) metil-beta-ciclodextrina (MßCD, 5 mM), que inibe a processos mediados por jangada de lípidos, com uma diminuição do colesterol da membrana do plasma [29]. Todos os inibidores foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO).

Para examinar os efeitos dos componentes carregados negativamente na superfície da célula para a internalização de péptido, as células HeLa foram pré-tratados com gangliosidos (mono-sialogangliósido GM3 a partir de sangue canino), sulfato de heparina, ou o ácido siálico (Neu5Ac, todos da Sigma) (20 ug /ml) durante 30 min. Para a inibição da biossíntese de gangliósido, as células foram pré-tratados com D

treo

-1-fenil-2-hexadecanoil amino-3-morf olino-1-propanol (PPMP, 5 uM) durante 48 h.

Por todas estas condições experimentais, citometria de fluxo análises foram realizadas com células vivas usando um Becton Dickinson FACSCalibur citômetro de fluxo (BD Biosciences, San Diego, CA). Em cada caso, a fluorescência de 10000 células viáveis ​​foram adquiridos. As células viáveis ​​foram fechado com base em uma dispersão lateralmente e para a frente. Para análise de dados, o software WinMDI (Joe Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA) foi usado. A significância estatística foi avaliada pelo teste t de Student para um intervalo de confiança de 95%.

A clonagem e expressão de proteínas de fusão Péptido-

empregar BR2 como um veículo para a administração de proteínas terapêuticas, um cDNA do fragmento variável gene Y13-259 de cadeia simples (scFv) foi sintetizado pelo Bioneer (Daejeon, Coreia do Sul). Os genes Tat- ou BR2-fundido Y13-259 scFv foram obtidos por PCR recombinante. Os cDNAs recombinantes que codificam o anti-Ras scFv, Tat-scFv e fusões BR2-scFv foram digeridos com

Nco

I e

EcoR

I (ambos da New England Biolabs, Beverly, MA), e clonado no

Nco

I e

EcoR

locais I do pET21c, produzindo pscFv, PTAT-scFv e pBR2-scFv, respectivamente. Anti-Ras scFv, Tat-scFv e BR2-scFv proteínas de fusão foram expressas em

E. coli

Origami (DE3) após a indução com IPTG 0,1 mM durante 4 h a 37 ° C. As células foram colhidas por centrifugação a 3000 × g durante 15 min a 4 ° C. O sedimento de células foi ressuspenso em tampão de fosfato (fosfato de sódio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4); As células foram rompidas por sonicação em 4 ° (instrumentos B. Braun, Allentown, PA) C. O fluoreto de fenilmetilsulfonilo inibidor de protease (PMSF, 1 mM) foi adicionado antes da sonicação. As fracções solúveis e insolúveis foram separadas por centrifugação a 14.000 x g durante 15 min a 4 ° C. O sedimento que contém os corpos de inclusão foi ressuspenso em tampão de lavagem (Tris-HCl a 20, 5 mM de EDTA e 1% de Triton X-100, pH 8,0) e centrifugada a 8000 × g durante 10 min a 4 ° C.

Os corpos de inclusão lavados foram desnaturadas e solubilizadas em tampão de lise (0,3% de N-lauroil sarcosina, 50 mM de tampão CAPS, e NaCl 0,3 M, pH 11,0) durante 3 horas e centrifugou-se a 14000 × g durante 15 min a 4 ° C . Todas as proteínas foram afinidade purificado usando a resina Ni-IDA agarose (ELPIS biotecnologia, Daejeon, Coreia do Sul). Em breve, o Ni-IDA His-Bind A resina foi empacotada numa coluna equilibrada com tampão (idêntico ao tampão de lise) de ligação. O sobrenadante foi lentamente aplicado na coluna, após o que tampão de lavagem (0,3% de sarcosina de N-lauroilo, 50 mM de tampão CAPS, NaCl 150 mM e imidazole 30 mM, pH 11,0) foi aplicada. As proteínas foram eluídas com tampão de eluição (0,3% de sarcosina de N-lauroilo, 50 mM de tampão CAPS, NaCl 150 mM e imidazole 250 mM, pH 11,0) e analisadas por 10% SDS-PAGE. As proteínas eluídas foram re-enroladas por diálise em PBS contendo NaCl 200 mM, 10% de glicerol, 1 mM GSH, GSSG 0,2 mM e 0,4 M de arginina com a redução gradual do pH (pH 10, pH 9, pH 8 e pH 7,4). Cada passo de diálise foi realizada a 4 ° C durante 12 horas contra 20 x volume da amostra para remover o detergente completamente.

Western Blotting

Para monitorar a absorção intracelular mediada por péptidos, de proteínas scFv, o proteínas de fusão internalizados foram examinados por transferência Western. células HCT116 (1 × 10

6) foram tratados com PBS, scFv purificada, Tat-scFv, ou proteínas de fusão scFv-BR2 (cada, 2? M) durante 2 h a 37 ° C. As células foram então lavadas duas vezes com PBS (4 ° C), raspadas para 0,5 ml de PBS e centrifugadas a 1000 x g a 4 ° C durante 5 min. Os sedimentos celulares foram ressuspensos em 100 ul de tampão de lise (20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 150 mM, Na 1 mM de

2EDTA, EGTA 1 mM, 1% de Triton, pirofosfato de sódio a 2,5 mM, beta 1 mM glicerofosfato, 1 mM de na

3VO

4, 1 ug /mL de leupeptina e 1 mM de PMSF (Cell Signaling tech., Danvers, MA) e mantidas em gelo durante 30 minutos. Os lisados ​​celulares foram, então, centrifugadas a 12.000 x g a 4 ° C durante 15 min e os sobrenadantes foram recolhidos. as concentrações de proteína dos extractos celulares foram determinadas pelo método de Bradford [30] (Bio-Rad, Hercules, CA). 50 ug de proteína a partir de extractos de células foi fraccionado sobre um gel de SDS-PAGE a 10%. Depois da electroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose em tampão de transferência (glicina 192 mM, 25 mM Tris-HCl, pH 8,8, e metanol a 20% [v /v]) por electrotransferência. Após bloqueamento com 5% de leite desnatado durante 1 h, a membrana foi incubada com um anticorpo anti-His primária 1:1,000-diluído (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), lavadas três vezes com TTBS (50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, e 0,5% de Tween-20), e subsequentemente incubadas com um anticorpo secundário anti-coelho conjugado com peroxidase (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) em leite contendo TTBS durante 1 h. Após a lavagem final, a membrana foi então exposto e bandas de proteínas foram detectadas utilizando quimioluminescência aumentada (GOLD WESTSAVE; AbFrontier, Seoul, Coreia do Sul).

Proliferação Celular Ensaios (MTT Assay)

Para avaliar a actividade anti-proliferativa de péptidos e proteínas de fusão anti-Ras scFv, células HCT-116 (K-ras células mutantes) foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 2 × 10

4 células /poço em 100 ul de DMEM suplementado com FBS a 10% e cultivadas durante 24 h a 37 ° C. Após 24 h de incubação, as células foram tratadas com scFv ou proteínas de fusão péptido-scFv (0, 0,5, 1 e 2 uM) e incubou-se durante mais 24 h. A viabilidade celular foi medida com o ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil (MTT), utilizando o kit de ensaio de proliferação celular CellTiter 96® não radioactivos (Promega, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. A absorvância da solução foi medida a 570 nm utilizando um leitor de microplacas (Bio-Rad). A viabilidade celular foi expressa como a percentagem de células viáveis ​​tratadas com scFv ou proteínas de fusão scFv-péptido em comparação com o controlo tratado com PBS (100%). Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

Detecção de apoptose

células HCT116 (1 × 10

6 /poço numa placa de 6 poços) foram tratados com scFv fundido com péptido (cada , 2 ^ M) ou uma estaurosporina bem conhecido indutor de apoptose (0,5 uM) durante 24 h a 37 ° C e os extractos celulares foram preparados como descrito acima. poli clivado (ADP ribose) polimerase (PARP), um indicador da apoptose, foi detectada por transferência Western, como descrito acima. Os anticorpos anti-PARP e anti-α-tubulina (Cell Signaling Tech.) foram utilizados a uma diluição 1:1,000 como os anticorpos primários, enquanto que IgG anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) foi usada numa . 1:10,000 diluição como o anticorpo secundário

Além disso, as células apoptóticas foram identificados através de coloração com anexina V-FITC (150 ng /ml) e 7-amino actinomicina D (7-AAD; BD Biosciences, San Diego, CA). 1 × 10

6 células HCT116 foram tratadas com PBS, estaurosporina (0,5 uM), ou scFv fundido com péptido (cada, 2 uM) como descrito acima. No tempo designado, as células foram lavadas duas vezes com PBS (pH 7,4), colhidas e ressuspensas em 500 ul de tampão de ligação suplementado com fluos Anexina-V (1:100 diluída; BioBud, Seul, Coreia), e incubadas durante 15 min a 25 ° C no escuro. Para detectar necrose, 7AAD foi adicionado antes da medição. As amostras foram imediatamente submetidos à análise FACS com um citômetro de fluxo FACSCalibur (FL1 e FL3) e software WinMDI (Joe Trotter, Scripps Research Institute). 1 × 10

4 células por amostra foram analisadas por citometria de fluxo.

A activação de Ras Ensaio

Para estudar a supressão de péptido-proteína scFv-dependente de fusão da actividade de Ras, o nível de Ras -GTP (forma activa) foi medida utilizando um kit de ensaio de activação de Ras (Millipore, Billecia, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Este método baseia-se numa ligação selectiva de Ras-GTP usando o domínio de ligação de Ras (RBD) de Raf-1 (uma quinase a jusante de Ras) que não se liga Ras-GDP (forma inactiva). Resumidamente, 50 uL de proteína RBD fundida com glutationa-transferase (GST) foi revestida sobre uma placa de 96 poços revestidas com glutationa, a 4 ° C durante 1 h e lavados com TBST (Tris 50 mM, NaCl a 150 mM e 0,05% de Tween -20, pH 7,6). As células HCT116 foram tratadas com scFv, scFv-Tat, ou BR2-scFv por 1 ou 2 h, após o que as células foram lisadas usando 1 × Mg

2+ Tampão de Lise /Wash (Millipore). A concentração de proteína foi calculada pelo ensaio de Bradford. Os lisados ​​celulares contendo 50 ug de proteína foram incubadas durante 1 h nas RBD-revestidas com GST poços a 25 ° C. Depois de se lavar três vezes com TBST, adicionou-se solução de anticorpo primário e incubadas a 4 ° C durante 1 h. Depois de se lavar com TBST, adicionou-se o anticorpo anti-ratinho conjugado com HRP secundário e incubaram-se a 25 ° C durante 1 h. Após uma lavagem final com TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6), 50 ul de substratos quimioluminescentes foi adicionado a cada poço. sinais de quimiluminescência de cada poço foram monitoradas usando o luminómetro Berthold (MicroLumat LB96P; Berthold Technologies, Oak Ridge, TN). Os resultados foram expressos como actividade relativa Ras.

Resultados

BR2 eficiente internaliza em várias linhas de células cancerosas sem citotoxicidade para as células normais

A captação celular e distribuição intracelular de peptídeos projetados , BR1 e BR2, foram estudados através de microscopia confocal. BR2 foi facilmente internalizado em células cancerosas (células HeLa, HCT116 e células B16 /F10) dentro de 30 min e distribuído por todo o citoplasma e núcleo das células de cancro (Fig. 1A). No entanto, foi muito pouco internalizados em células normais (HaCat, BJ e NIH 3T3), sob as mesmas condições experimentais. Em contraste, BR1 apresentaram níveis negligenciáveis ​​absorção celular, tanto o cancro e as células normais, indicando que ele não pode translocar através da membrana celular (Fig. 1A). A fluorescência a partir de células tratadas com Tat, também foi claramente detectado em ambos o núcleo e citoplasma de células do cancro e normais. Mais Tat acumulado no núcleo do citoplasma, enquanto que a maioria BR2 estava uniformemente distribuída nas regiões intracelulares (Fig. 1a).

(a) distribuição intracelular de péptidos marcados com FITC examinadas por microscopia confocal a laser. Ambas as células cancerosas (células HeLa, HCT116 e células B16 /F10) e as células normais (HaCat, BJ e NIH 3T3) foram semeadas em placas de 6 poços um dia antes da experiência para alcançar 70% de confluência. As células foram incubadas com péptidos marcados com FITC (5 uM) durante 30 min a 37 ° C e lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). distribuição de péptido foi em seguida analisada utilizando um varrimento confocal a laser LSM 510 microscópio equipado com uma objectiva 40 x. (B, C)

In vitro

citotoxicidade de peptídeos. perturbação (B) da membrana foi medida por lactato-desidrogenase (LDH) de fuga a partir das linhas celulares indicadas 24 h após o tratamento péptido. LDH a partir de células semeadas numa placa de 96 poços a 10.000 células /poço foi medida após exposição a 1, 2, 5, 10, 20, 50 ou 100 uM péptidos durante 24 h. libertação de LDH a partir de células tratadas com PBS foi considerada como 0% e vazamento LDH libertada a partir de 0,2% de Triton X-100 células tratadas como fugas 100%. (C) A actividade hemolítica de cada péptido contra eritrócitos humanos foi analisada em concentrações graduadas (0-200 uM) e comparadas com uma solução a 0,2% de Triton X-100 de controlo positivo, para que a hemólise foi definida como 100%. As barras de erro em todos os números representam os erros padrão das médias (n = 3).

Para avaliar a

in vitro

citotoxicidade dos peptídeos projetados, o vazamento LDH foi medida em linhas celulares de cancro (HeLa, HCT116 e B16 /F10) e linhas celulares normais (HaCat, BJ e NIH 3T3). tratamento BR2 (20-100 uM) estava associado com extravasamento de LDH a partir de células cancerosas; o vazamento aumentou gradualmente com concentrações BR2, atingindo cerca de 40-60% a 100? M (Fig. 1B

a-c

). No entanto, o vazamento de LDH a partir de células normais tratadas com BR2 não foi detectado em concentrações abaixo de 70 uM BR2, e uma fraca de fuga (~17%) foi observada a 100 uM (Fig. 1B

d-f). BR3 LDH induzida substancial de ambos cancro (aprox. 80-90%) e linhas de células normais (aprox. 30%), mesmo a 50 | iM (Fig. 1B

a-f).

Para examinar a citotoxicidade de peptídeos ainda mais, a atividade hemolítica de BR1, BR2, BR3 e Tat contra eritrócitos humanos foi também examinada. De acordo com os resultados de fuga de LDH, sem hemólise foi induzida mesmo após os eritrócitos foram tratados com Tat, BR1 ou BR2 em ≥200 uM, enquanto que BR3 desencadeada hemólise (≥5%) em ≥25 uM (Fig. 1C). Subsequentemente, cerca de 34,3% de eritrócitos foram lisados, após tratamento com 200 uM BR3. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que BR2 eficiente penetra as células cancerosas sem efeitos citotóxicos em células normais, ao passo que Tat mostrou penetração semelhante em ambos os tipos de células.

BR2 Especificamente penetra nas células de câncer em uma forma dependente da concentração

Para comparar a quantidade dos péptidos internalizados em diferentes tipos de células, foi realizada a análise de citometria de fluxo. BR2 foi internalizado mais eficientemente em células cancerosas (HeLa, HCT116 e B16 /F10) do que em células normais (HaCat, BJ e NIH 3T3); mais de 95% de células cancerosas tratadas com BR2 internalizado BR2, enquanto que apenas 23-34% de células normais tratadas com BR2 fez. No entanto, Tat penetrado ambas as células normais e sem cancro muito discriminação (Fig. 2A). penetração específica de Br2 e Tat em células cancerosas também foi analisada na presença de ambas as células de fibroblastos HeLa e BJ por microscopia confocal a laser. BR2 foi preferencialmente captado por células HeLa, enquanto que a captação celular de Tat foi semelhante em ambos os HeLa e BJ células de fibroblasto (Fig. S1). Estes resultados mostram claramente que a BR2 buforin-derivado tem especificidade de células de cancro, enquanto que Tat não.

(A) Análise da eficiência de penetração de células de cada péptido em diferentes tipos de células por citometria de fluxo. Marcado com FITC Tat, BR1 e péptidos BR2 (10 uM) foram adicionados a diferentes tipos de células: células HeLa, células cancerosas e HCT116 /B16 F10 e HaCat, BJ e NIH 3T3 células normais. Após 30 min de incubação a 37 ° C, as células com FITC-positivos foram contadas por citometria de fluxo. Os valores representam a percentagem de células fluorescentes positivas na população total de células. (B) Avaliação quantitativa de penetração de células de cada péptido por citometria de fluxo. As células HeLa foram incubadas com péptidos marcados com FITC em concentrações de 1, 2, 5 ou 10 uM durante 30 min a 37 ° C. Em seguida, as células foram lavadas com PBS frio e colhido e a fluorescência celular foi analisada por citometria de fluxo. As células de controlo não recebeu péptido de tratamento. Antes da análise, a fluorescência extracelular de péptidos ligado à superfície foi removido por um tratamento com tripsina (1 mg /ml durante 10 min).

A intensidade de fluorescência das células tratadas com péptido foi melhorado com concentrações crescentes de Br2 ou Tat. Em concentrações superiores a 5 uM, BR2 entrou mais do que 80% de células HeLa em 30 min (Fig. 2B). BR2 células penetrou de forma mais eficiente do que o péptido Tat em cada concentração testada. Além disso, a internalização BR2 para todas as linhas celulares de cancro (HCT116 e células B16 /F10, dados não mostrados) parecia ser homogénea em toda a população celular, como um único pico no histograma. Entre os peptídeos, BR1 apresentou a menor absorção, indicando a sua incapacidade de penetrar a membrana celular, mesmo a 10 | iM.

interacção electrostática inicial com BR2 carregado positivamente e negativamente carregados gangliósidos sobre a membrana celular do cancro é essencial para a Energia dependente de endocitose de BR2

o mecanismo de captação celular de Br2 foi analisada com células HeLa, a linha celular de cancro mais representativos e amplamente utilizado, para comparar com os de outros péptidos de penetração de células. Em primeiro lugar, examinou o efeito da temperatura sobre a penetração BR2. A redução da absorção de péptido temperatura dramaticamente reduzida em células HeLa (Fig. 3A); a absorção celular de Br2 e Tat, a 4 ° C foi diminuiu de 88,5% e 31,6%, respectivamente, em comparação com a observada a 37 ° C. Além disso, também foi observada uma absorção dependente de energia de peptídeos quando o pool celular de ATP foi esgotada por pré-incubação das células com azida de sódio (NaN

3). depleção de ATP também reduziu a absorção de Br2 e Tat em células HeLa, por 67,7% e 42,5%, respectivamente (Fig. 3A). Estes resultados suportam o envolvimento de endocitose para a absorção BR2 e Tat.

(A) Efeitos da baixa temperatura e esgotamento de energia sobre a internalização dos peptídeos marcados com FITC em células HeLa. As células HeLa foram ou pré-incubado a 4 ° C ou pré-tratados com azida de sódio (NaN

3) para esgotar ATP durante 1 h, e, em seguida, incubadas com 5 pM Tat ou BR2 durante 30 min sob as mesmas condições, como descrito em Materiais e Métodos. captação de péptido foi determinada por citometria de fluxo. (B) Efeitos de inibidores de endocitose sobre a entrada de Br2 e TAT. A influência de drogas inibidoras sobre a captação de péptido foi determinada pela pré-incubação de células HeLa com os inibidores da endocitose nocodazol, amilorida ou metil-beta-ciclodextrina durante 1 h antes da adição de péptidos marcados com FITC. Após o tratamento de péptidos durante 30 min a 37 ° C, as células com FITC-positivos foram contadas por citometria de fluxo. Os valores representam a percentagem de células fluorescentes positivas na população total de células. Os dados representam a média ± S.D. de três experiências independentes. (C) co-localização de BR2 com o marcador lisossomal Lyso Tracker red DND-99 em que vivem as células HeLa. Após 30 min de incubação de Br2 (5 uM) com Lyso Tracker, imagens de células HeLa vivas foram obtidas por microscopia confocal. (d) efeitos de moléculas carregadas negativamente (gangliósidos, heparinas, e ácidos siálicos) sobre a absorção de péptidos. (A, b) células HeLa foram tratados com BR2 e Tat na presença de gangliósidos, heparinas, ou ácidos siálicos (cada, 20 ug /ml) durante 30 min. Em (c, d), as células HeLa foram pré-tratadas com PPMP (5 uM) para esgotar gangliósidos. a absorção celular de Br2 e Tat foi determinada por citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT.