Abstract

Fundo

O osteossarcoma humano é o tumor primário mais comum do osso. Os tumores sólidos são feitos de populações de células heterogéneas, que apresentam objetivos e papéis diferentes na economia tumor. Um subconjunto de células bastante pequena pode conter ou adquirir potenciais do tronco, ganhando agressividade e aumento da esperança de recorrência. O antigénio CD133 é uma glicoproteína de membrana pentaspan, que tem sido proposto como um marcador de células estaminais do cancro, uma vez que foi anteriormente demonstrado ser capazes de identificar um cancro iniciar subpopulação no cérebro, cólon, melanoma e outros tumores sólidos. Portanto, nosso objetivo foi observar a possível presença de células que expressam o antígeno CD133 dentro de linhas celulares de tumores sólidos de osteossarcoma e, então, compreender as suas características biológicas e performances.

Metodologia e principais conclusões

neste estudo, usando SAOS2, MG63 e U2OS, três linhas celulares de sarcoma humanos isolado de jovens indivíduos caucasianos, fomos capazes de identificar e caracterizar, entre eles, CD133

+ células que mostram as seguintes características: alta taxa de proliferação, ciclo celular detecção numa fase G2 M \\, positividade para Ki-67, e de expressão dos transportadores ABCG2. Além disso, no FACS, fomos capazes de observar a CD133

+ fração de células que mostra perfil da população lado e formando esfera-clusters em meio isento de soro com uma alta eficiência clonogênica.

Conclusões

no seu conjunto, os nossos resultados levam ao pensamento de que podemos assumir que temos identificado, pela primeira vez, CD133

+ células dentro de linhas de células de osteossarcoma, mostrando muitas características de células-tronco cancerosas. Isto pode ser de bastante interesse, a fim de conceber novas terapias contra o câncer ósseo

Citation:. Tirino V, Desiderio V, d’Aquino R, De Francesco F, Pirozzi G, Galderisi L, et al. (2008) detecção e caracterização de CD133

+ Cancer Stem Cells em tumores sólidos humanos. PLoS ONE 3 (10): e3469. doi: 10.1371 /journal.pone.0003469

editor: Thomas Zwaka, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de maio de 2008; Aceito: 29 de setembro de 2008; Publicação: 21 de outubro de 2008

Direitos de autor: © 2008 Tirino et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. MURST ( Itália), 2 Universidade de Nápoles. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o osteossarcoma é o tumor primário mais comum do osso. Ela ocorre em ossos e sítios ósseos extras, e apresenta uma distribuição bimodal idade, com um primeiro pico durante a segunda década de vida, relacionada com o surto adolescente de crescimento (400 novos casos pediátricos por ano nos Estados Unidos Estados Unidos) e um segundo pico em adultos mais velhos [1]. A incidência é um pouco maior em afro-americanos do que em caucasianos e da morte é geralmente o resultado de metástase pulmonar progressiva, com insuficiência respiratória devido à doença generalizada [2]. alterações genéticas Sarcoma incluir tanto oncosuppressor e as vias de oncogenes, cujos produtos regulam o ciclo celular progressão [3]. Na verdade, é bem sabido que os tumores sólidos são povoadas por populações de células heterogéneas que incluem células estaminais com propriedades semelhantes, como a elevada taxa de proliferação, a expansão rápida e crescimento invasivo [4], [5].

A tumor pode ser encarado como um órgão inteiro, formado por células que apresentam diferentes papéis distintos na economia do tumor. É bem sabido que a função de células-tronco é o de manter e reparar tecidos. Stem potencial pode também ser adquirida pela célula cancerosa e este evento é muito importante para a progressão do tumor.

A opinião corrente é que os tumores podem derivar a partir de um pequeno número de células estaminais que têm características semelhantes. Novas terapias dirigidas a estas células, que são fundamentais para a progressão do tumor, poderia melhorar significativamente o tratamento clínico de câncer. Portanto, é de suma importância para identificar, dentro dos tumores, subpopulações de células que apresentam diferenças significativas em termos de proliferação, tronco expressão do marcador e comportamento.

O antígeno CD133 é uma glicoproteína de membrana pentaspan, caracterizada por dois estudos independentes [6], [7] e originalmente identificado em células estaminais neuroepiteliais [8]. Seu interesse como um marcador de haste do cancro tem crescido dramaticamente desde que apareceu que ele foi capaz de identificar um câncer iniciando subpopulação no cérebro [9] e do cólon [10]. Além disso, CD133

+ células também foram encontrados em hepatocarcinoma [11] e melanoma [12], mas, até agora, ainda não em osteossarcomas, em que a presença de células-tronco como supostos formando esferas tem sido relatada [13 ].

por isso, buscamos usar o CD133 como um marcador para detectar a possível presença de câncer de células estaminais dentro SAOS2, MG63 e U2OS linhas celulares de sarcoma humano isoladas de osteossarcoma de jovens indivíduos caucasianos. Estas linhas celulares foram previamente utilizados como modelos de osteossarcoma [14], [15] e células semelhantes a osteoblastos [16], [17]. Neste estudo, a fim de identificar especificamente CD133

+ cancro de células estaminais, que investigaram a relação entre as características de haste e a cinética da expressão do marcador de CD133.

Os resultados, em primeiro lugar demonstrar, por Pela primeira vez, que o antigénio CD133 é observável em células de osteossarcoma em diferentes linhas de células estabilizadas. Além disso, mostrámos que estas células exibem elevada taxa de proliferação e de que eles são capazes de formar esferas de fragmentação. Além disso, descobrimos que estas células são altamente clonogênica e tumorigénico. Tomados em conjunto, a nossa liderança de dados para o pensamento de que as células-tronco cancerosas (CSCs), que são células tumorais de iniciar, pode ser encontrado em osteossarcomas e isso pode ser de extrema importância na concepção de novas terapias anti-cancro para o osso.

resultados

SAOS2, U2OS e MG-63 linhas de células de osteossarcoma foram testadas a fim de detectar, no seu interior, a presença de um CD133

+ população de células. CD133 é um marcador de células-tronco descrita pela primeira vez em progenitores neuro-endotelial, e foi recentemente suposto ser um marcador selectivo para células-tronco cancerosas (CSC) em alguns tipos de câncer. Os nossos resultados mostram claramente que, em cada uma das três linhas de células, duas subpopulações: uma CD133

+ (variando de 3% a 5%) e um CD133

-, podem ser identificadas (Fig. 1). Usando o FACsorting, obtivemos uma

+ população CD133 enriquecido (98,8%) e um CD133

– população de células. A expressão do antigénio CD133 foi analisada usando dois anticorpos diferentes. Os resultados confirmaram que as células negativas para CD133 não expressam o antigénio na superfície celular e que as células positivas CD133 foram expressas no mesmo nível percentual utilizando ambos os anticorpos.

Um CD133

+ população de células pode ser detectada em todas as três linhas celulares.

Além disso, todas as três linhas celulares foram negativos para o antígeno CD34, mas eles evidenciado igual forte positividade para CD29, CD44 e CD90, células mesenquimais e tronco cancerosas marcadores. Ambas as frações de CD133

+ e CD133

– as células foram positivas para antígenos CD29, CD44 e CD90 em todas as três linhas celulares (Fig. 2)

Todos os três linhas de células são negativas para CD34. antígeno mas fortes evidências de positividade igual para CD29, CD44 e CD90

As duas populações de células (CD133

+ e CD133

-). foram então usados ​​para realizar a análise do ciclo celular, o crescimento análise, o ensaio de formação de cluster esfera, ensaio em agar mole e detecção população lado.

ciclo celular, ensaios de proliferação e analisa Crescimento

iodeto de propídio ensaio (PI) mostrou uma diferença marcante no ciclo celular de CD133 células classificadas. CD133

+ células foram principalmente na fase G2 \\ M, enquanto CD133

– células eram predominantemente em G0 \\ G1 (Fig 3A.), Indicando que a CD133

+ subpopulação é a fração de células em proliferação activa. Além disso, todo o CD133

+ células resultou ser Ki-67

+ (Figura 3B). Embora a maioria das células CD133

– células foram negativos para este marcador. Ki-67 é uma proteína expressa apenas nas células em proliferação, assim, os nossos resultados confirmam que a CD133

+ fracção é a fonte das células recém-gerado.

(A), Figura do ciclo celular análises realizadas sobre SAOS2, linhas de células MG63 e U2OS. A CD133

+ população de células é principalmente observável na fase G2 \\ M, enquanto CD133

– células eram predominantemente em G0 \\ G1; (B) Figura mostrando reactividade Ki-67. CD133

+ células resultou ser Ki-67

+, enquanto que CD133

– foram principalmente negativo para este marcador; (C) Figura mostrando curvas de crescimento de CD133

+ células com respeito CD133

– células em SAOS2, MG63 e linhas celulares U2OS. CD133

+ células possuem um elevado potencial proliferativo em todas as três linhas de células.

Além disso, a fim de mostrar se CD133

+ células eram capazes de proliferar extensivamente em quando comparado com CD133

– células, observou-se o seu crescimento. Os nossos dados mostraram que as culturas de tumores derivados de CD133

+ células exibir maior potencial proliferativo com respeito a CD133

– células em todas as três linhas de células. Na verdade (Fig 3C) CD133

+ células exibiram um tempo médio de aproximadamente 40 h, 33 h e 38 h em linhas celulares SAOS2, MG63 e U2OS dobrando respectivamente, enquanto CD133

– células mostraram um tempo médio de dobrar 48 h, 44 h e 42 h em SAOS2, MG63 e linhas de células U2OS respectivamente. Quando as células eram aderentes, após separação, a percentagem de células que expressam CD133 diminuiu significativamente (p 0,001) com o tempo de cultura (dados não mostrados)

Formação Esfera Cluster

a capacidade de crescer. em suspensão em meio isento de soro, descrito pela primeira vez para seleccionar células estaminais neurais através neuroesfera formação, tem sido largamente investigado como um método de selecção de células de tumor de início. Glioblastoma, cancro do cólon, melanoma e células acima de tudo, seleccionados pela sua capacidade de formar agregados esfera, verificou-se ser altamente tumorigénicas e capaz de propagar e reconstituir arquitectura do tumor original quando injectado em hospedeiros permissivos. Os nossos resultados sobre as linhas de células de osteossarcoma indicado que os aglomerados esfera foram claramente observados já após 24 h em CD133

+ culturas, enquanto CD133

(Figura 4A, C, D.) – Não formam esferas (figura 4B.). Após 7 dias de cultura, as esferas obtidas na CD133

+ células foram semeadas em placas padrão com 10% de FBS. As células migraram a partir das esferas dentro de algumas horas e aderiram ao fundo dos frascos, assumindo uma forma poligonal. Estas células resultou ser menor em tamanho, em comparação com CD133

– células. Depois de uma semana, foi realizado um teste adicional para o antígeno CD133 em células aderentes. Curiosamente, novamente um CD133

– foi observada população, fornecendo evidências de que CD133

– células, neste momento, decorrem de CD133

+ celular. Em seguida, foi realizada uma nova classificação destas células e observaram que a CD133

+ fração ainda mantinham a capacidade de formar esferas, enquanto o CD133

-. Não

clusters (A) Sphere formado por CD133

+ células em meio semi-sólido após 24 horas (Ampliação original × 100); (B) CD133

– células em meio semi-sólido após 7 dias, não se formam esferas. (Ampliação original × 100); clusters (C) Sphere formadas por CD133

+ células após 48 horas (aumento original x 200); (D) clusters de Sphere formadas por CD133

+ células após uma nova classificação (Ampliação original × 400).

Além disso testamos expressões OCT3 /4 e CD133 às 6

th celular passagem e a 4

th e 6

th passagem, respectivamente, em sarcospheres derivados de CD133

+ células após separação. Os resultados mostraram que as esferas foram enriquecidos em ambos OCT3 /4 e CD133 com o tempo de cultura (Fig. 5).

A linha azul indica controlos isotípicos, linhas vermelhas e verdes indicam a expressão de CD133 na posição 4

th e 6

th passagem de células, respectivamente. Nos histogramas, OCT3 expressão /4 é analisado a 6

th passagem celular; a linha verde indica controles isotípicos. Sarcospheres tanto no CD133 e OCT3 /4 são fortemente positivo.

macio Agar Ensaio

ensaios de agar mole foram realizados a fim de observar as diferenças de tumorigenicidade de células por meio da capacidade de CD133

+ células para formar colônias com respeito CD133

– células. Como mostrado na Tabela 1, as colónias foram formadas com mais eficiência, CD133

+ células, o que deu origem a um 5,5 ± 1,8 vezes maior número de colónias do que os detectados em CD133

– população (

p

0,005) em SAOS2; 7,7 ± 1,5 vezes maior número de colónias do que as observadas em CD133

– população (

p Art 0,001) no MG63, e 6,8 ± 1,7 vezes maior número de colónias do que as observadas em CD133

– população U2OS (P 0,005)

população Side e ABCG2

dentro do CD133

+ fração de um subconjunto muito pequeno (0,97%) expressaram a característica. perfil de uma população de lado. Sabe-se que o fenótipo população lado é o atributo mais importante de cancro de células estaminais. Neste estudo mostramos pela primeira vez que em linhas celulares de osteossarcoma lado uma população pode ser detectada. Além disso, verificou-se que todas as três linhas celulares expressavam o transportador ABCG2 (Fig. 6), que são normalmente associados com o fenótipo população lateral e resistência aos medicamentos.

analisa (A) Citometria da população lado. O CD133

+ fração inclui um pequeno subconjunto (0,97%), expressando o perfil característico de uma população lado de FACS. (B) a expressão ABCG2 na linha de células SAOS2, mostrando uma positividade evidente; a linha cinza indica o controlo de isotipo.

A imuno-histoquímica e imunofluorescência

Ambos imuno-histoquímica e imunofluorescência em células aderidas e esferas flutuantes foram realizadas neste estudo. Os nossos resultados, de acordo com análises de FACS, confirmou a presença do antigénio de CD133 na membrana celular de CD133

+ células separadas. Além disso, esferas flutuantes mostrou uma coloração amplamente difusa para CD133, corroborando o fato de que as esferas são formadas por CD133

+ células. Curiosamente, o CD133

– fracção classificadas foram coradas para CD133, que estava localizada no interior de vesículas intra-citoplasmático, como mostrado na microscopia confoal (Figura 7A, B, C, D, E, F.). A fim de compreender profundamente este aspecto, foi realizada, no FACS, uma coloração intra-celular de CD133. Nós descobrimos que em todas as três linhas de células de uma positividade intracelular foi observado (Fig. 8A), enquanto que os isotipos de controlo foram negativos.

analisa (A) imuno-histoquímica de células aderentes e (B) as esferas flutuantes que mostram a presença de antigénio CD133 (setas). (Ampliação original × 100.); (C) Análise por imunofluorescência em SAOS-2 para CD133 PE, citoesqueleto está manchado com faloidina-FITC, núcleo com DAPI (Ampliação original × 400.); (D) Immunoflurescence análise em SAOS-2 esferas para CD133 PE após 24 horas em aderência. (Ampliação original × 200); (E) confocal análises em células aderentes e (f) as esferas confirmando a presença do antigénio CD133 flutuantes. (Ampliação original. × 400).

(A) Figura realizado em FACS mostrando a expressão intracelular do antígeno CD133 em SAOS-2, MG-63 e U2OS. (B) Figura mostrando a PCR em tempo real da expressão mRNA transcrito no CD133

+ e CD133

– células. Os níveis são quase idênticas, como detectado por em ambas as células positivas e negativas CD133.

Time-PCR real análise

A expressão de níveis de mRNA CD133 em CD133

+ e CD133

– células aderentes foram quase idênticas, como detectado por PCR em Tempo real (Fig 8B.). Isto confirma ambos os FACS e resultados de imunofluorescência, como mostrado acima.

Discussão

O osteossarcoma é um tumor altamente agressivo, que afeta predominantemente os jovens. Seguintes estudos recentes [10] – [13], [18] apoiando a presença de um subconjunto de células altamente tumorigênico – comumente chamada de Cancer Stem Cells (CSCs) – dentro da massa tumoral, tentamos isolar e caracterizar essa subpopulação em linhas de células de osteossarcoma . lesões tumorais abranger populações de células heterogéneas, entre os quais a presença de antígenos-tronco podem ser comprovados por meio de análises fenotípicas. A presença de um CD133

+ subpopulação dentro dos tumores sólidos humanos tem sido documentada por diversos relatórios [10] – [13], [18] – [21], e as células que expressam este marcador parece ser diferente das outras células cancerosas . Em particular, CD133

+ células-tronco possuem características semelhantes, tais como a capacidade de diferenciação, alta taxa de proliferação, formação de cluster esfera ea capacidade de propagar tumores em hospedeiros permissivas. falhas terapêuticas câncer pode ser devido a efeitos ineficientes da terapia atual sobre CSCs potencialmente quiescentes, que permanecem vital e manter a capacidade de regenerar o tumor [22], [23]. Desenvolvimento de novas estratégias CSC-alvo se actualmente travado pela falta de marcadores confiáveis ​​para a identificação de CSCs ea má compreensão do seu comportamento e destino. linhas de células, derivadas de tumores, manter padrões hierárquicos de células-tronco, demonstráveis ​​com diferentes habilidades clonog�icas, relacionados com propriedades celulares, como o tamanho, a adesividade, a exclusão de corante e padrões de expressão genética [24].

Neste estudo, foi utilizado o antigénio CD133 como um marcador de células-tronco do cancro, a fim de identificar, dentro estabilizado linhas celulares de osteossarcoma, células apresentando propriedades diferentes em termos de taxa de proliferação, a eficiência clonogénicas, a formação de aglomerado esfera-e corante de exclusão. Rastreio três linhas de células de osteossarcoma, CD133

+ subconjuntos foram encontrados para ser de 3% a 5% do total de células, de acordo com o pressuposto de que os CSCs deve ser apenas um subconjunto de células muito pequenas. Não há diferenças na CD29, CD44 e CD90 expressões tanto no CD133

+ e CD133

– células. Na verdade, as células-tronco do câncer são considerados de repouso

in vivo

e raramente dividir assimetricamente, dando à luz altamente proliferando progênie [5]. No entanto, se uma hierarquia haste existe em linhas de células, as células estaminais com características podem não ser quiescente; Caso contrário, eles devem ser perdido em algumas passagens. De acordo com esta análise, descobrimos que CD133

+ células foram altamente proliferativa, quando comparado com CD133

– células, como confirmado pela análise PI, Ki-67 de rotulagem e crescimento analisa

CD133

+ mostrou muitas diferenças no que diz respeito às suas contrapartidas negativas, tendo a capacidade de crescer como esferas num meio semi-sólido e para formar eficientemente colónias em agar mole. Estes ensaios são geralmente considerados, respectivamente, como índices de auto-renovação, tumorigenicidade e clonogenicidade. Além disso, sarcospheres, derivados de CD133

+ células, expressa elevados níveis de OCT3 /4, que são factores de transcrição envolvidos criticamente na auto-renovação e na manutenção da pluripotência das células-tronco indiferenciadas embrionárias [25]. Em nossas mãos a CD133

+ células mostrou todas essas habilidades e expressou ABCG2, que é um transportador de membrana, geralmente associada com o lado fenótipo população e resistência drogas [26]. Por conseguinte, este pode ser considerado como um marcador adicional para os CSCs. Além disso, no presente estudo, mostrou eficaz, pela primeira vez, que um lado da população pode ser detectada também em linhas de células de osteossarcoma. A população lado é definida pela Hoechst exclusão em citometria de fluxo de [27], [28]. Ela representa apenas uma pequena fracção da população total de células e expressa níveis elevados de vários membros da família transportadora de ABC, tais como MDR1, ABCG2 e que são responsáveis ​​pela resistência a drogas [29], [30]. Como esperado, verificou-se que a população lado foi feita por uma fracção muito pequena (0,97%) das células totais, e, curiosamente, foi completamente incluídas dentro do CD133

+ subconjunto.

Nossos dados , tomados em conjunto, podem levar à ensinei que CD133

+ células são as células-tronco do câncer. Na verdade, embora isso deve ser apoiado por um

in vivo

xenotransplante tumoral, como mostrado em outros tumores sólidos [10] – [13], [18] – [21], infelizmente, não foram capazes de realizar

in vivo

experimentos porque as linhas de células de osteossarcoma não enxertar com qualquer máquina. Nós efetivamente tentou executar

in vivo

transplante de nossas células-tronco CD133, mas sem sucesso, como todos os outros pesquisadores.

Além disso, também podemos supor que a CD133

+ subconjunto engloba uma CD133 menor

+ \\ ABCG2

+ \\ SP

+ população, o que poderia ser resistente a drogas, possui tronco características e pode leva efetivamente a progressão do câncer.

Curiosamente e inesperadamente, nas nossas mãos, algumas células que não expressam o marcador CD133 resultou na membrana para produzir uma quantidade detectável de transcritos de ARNm de CD133, e expressa o antigénio CD133 em vesículas citoplasmáticas, como mostrado por microscopia confocal. No entanto, CD133

+ e CD133

– populações classificadas mostrar claramente diferentes comportamentos. Isto leva-nos a especular sobre o papel funcional de CD133 na organização da membrana e na selecção das CSCs, como se segue: i) sendo CD133 altamente envolvido na formação do aglomerado esfera, que é necessária para o crescimento de células não aderentes, bem como para a célula-a -cell conversas cruzadas, o que permite que as células para se comunicar e receber estímulos que normalmente são fornecidos por moléculas de adesão; ii) CD133

+ e CD133

– populações estão em CSCs contínuas e troca mútua e só verdadeiros expressar CD133 constantemente na membrana

Em conclusão, nossos resultados sugerem que CD133 marcador pode ser útil. indicar o estado diferenciado /indiferenciado de tumores de osteossarcoma e isso pode levar a novas abordagens, a fim de projetar uma terapia mais específica e melhorar o prognóstico.

Materiais e Métodos

cultura celular

SAOS2, MG63 e U2OS foram adquiridos da ATCC CELL BANK; As células foram colocadas em meio de cultura α-MEM, suplementado com 15% de FCS, 100 uM de ácido 2P-ascórbico, 2 mM de L-glutamina, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina (todos adquiridos a partir de Invitrogen, San Giuliano Milanese, Milão, Itália) e colocados em frascos de 75 ml com válvulas filtrados. Os frascos foram incubados a 37 ° C em 5% de CO

2 e o meio mudado duas vezes por semana. Após confluência, as células foram subdivididas em novos frascos até ao final da experiência.

citometria de fluxo e classificação celular

As células foram descoladas utilizando 0,02% de EDTA em solução salina tamponada com fosfato (PBS), contadas e lavou-se em 0,1% de BSA em PBS. Pelo menos 500.000 células (em 100 ul de PBS /0,5% de BSA) foram incubadas com anticorpos monoclonais fluorescentes marcadas ou respectivos controlos de isotipo (1/10 diluída 4 ° C durante 30 min no escuro). Após os passos de lavagem, as células marcadas foram analisadas por citometria de fluxo usando um classificador de células FACS Vantage (Becton Dickinson, Mountain View, CA, EUA). Os anticorpos utilizados foram de rato anti-humano CD133 /2 PE conjugado (Miltenyi Biotec Srl Calderara di Reno, Bolonha, Itália), rato anti-humano CD133 PE conjugado (eBioscience), rato anti-humano CD29 CY conjugado (BD Pharmingen, Buccinasco, Milão, Itália), de ratinho anti-humano CD34 conjugado com PE (Miltenyi Biotec), de ratinho anti-humano CD44 conjugado com FITC (Miltenyi Biotec), de ratinho anti-humano CD90 conjugado com FITC (BD Pharmingen), de ratinho anti-humano OCT3 /4 não conjugado (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, Califórnia, EUA), de ratinho anti-humano conjugado com FITC Ki67 (Miltenyi Biotec) e ABCG2 rato anti-humano não conjugado (Santa Cruz). CD133

+ células foram classificadas para experimentos. CD133

– as células foram colhidas como controle. A pureza das populações classificadas foi rotineiramente de 90%. Isotipos foram utilizados como controle

Sete dias após a triagem, CD133

-. Células foram separadas e testado duas vezes para a expressão CD133. OCT3 expressão /4 foi analisado em 6

th passagem de células (a “passagem” indica que as células são separadas quando na confluência) enquanto que a expressão CD133 foi analisada a 4

th e 6

th passagem celular em sarcopheres derivados de CD133

+ células nas três linhas celulares

Para a coloração intracelular de Ki67, CD133 e OCT3 /4, as células foram processados ​​usando o Fix Kit Perm (Invitrogen, Milão, Itália) seguindo as orientações do fabricante. Todos os dados foram analisados ​​usando um software CellQuest.

Hoechst 33342 Exclusão Ensaio

SAOS2, as células MG63 e U2OS foram novamente suspensas em 2,0 × 10

6 células /ml em pré-aquecido α- e meio de cultura MEM dividida em duas porções. Uma parte foi tratada com 50 uM de verapamil e a outra foi deixada sem tratamento. Ambas as porções foram incubadas em meio de cultura α-MEM com 5 ^ g /ml de Hoechst 33342 (Sigma, Milão, Itália) durante 90 minutos a 37 ° C. Após a incubação, as células foram lavadas em PBS e mantidas em gelo durante 5 minutos e analisaram-se para a Hoechst 33342 efluxo por FACS de vista (Becton Dickinson, Milão, Itália) [31]. A Hoechst 33342 dye estava animado em 350 nm ultravioleta e fluorescência resultante foi medida em dois comprimentos de onda usando um 424/44 BP e 675 filtros LP para a detecção de azul e vermelho, respectivamente.

Análises

ciclo celular e proliferação Hoechst

ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo. As células foram recolhidas em PBS contendo EDTA 2 mM, lavadas uma vez com PBS, fixadas em etanol gelado 70 ° e incubadas com 50 ug /mL de PI (Sigma) mais Rnasi 1 mg /mL durante 60 min a 4 ° C no escuro. núcleos corados foram analisados ​​com um classificador de células FACS Vantage (Becton Dickinson, Mountain View, CA, EUA)., e os dados analisados ​​utilizando um programa de análise de ciclo de Mod-Fit célula 2,0 (Becton-Dickinson)

análise de crescimento

Após a separação por CD133, SAOS2, MG-63 e as células U2OS foram plaqueadas a uma densidade de 8,0 x 10

4 células /poço em placas de 6 poços. A cada doze horas as células foram colhidas e re-suspensas em PBS. Uma alíquota da suspensão de células foi diluída com 0,4% de azul de tripano (Sigma-Aldrich), pipetou-se para um hemocitómetro e contados ao microscópio a uma ampliação de 200 x. células vivas excluídos do corante, enquanto que as células mortas admitiu o corante e, consequentemente, manchado intensamente com azul de tripano. O número de células viáveis ​​para cada condição experimental foi contado e representada num gráfico linear. O tempo de duplicação (TD) foi determinada a partir das curvas de crescimento, ou por meio da seguinte fórmula: em que T e T

0 eram os tempos em que as células foram contadas, e N e N

0 eram os números de células em momentos t e t

0, respectivamente [32].

macio Agar Ensaio

a fim de testar os diferentes potenciais de tumorigénico em duas frações celulares, CD133

+ e CD133

– células foram plaqueadas em agar mole, com uma densidade de 100, 500 ou 1000 células /poço em placas de 24 poços em triplicado. Linha celular Colo 38 de melanoma foi utilizado como controlo positivo.

Para a camada de base, a solução de estoque de 2,4% de agar foi fundido num forno de micro-ondas, arrefeceu-se para 40 C em um banho de água e, em seguida, misturado com meio de cultura para se obter uma solução de 0,8% de agar em α-MEM. 0,5 mL /poço desta solução foi adicionada a placas de 24 poços. Para a camada superior, a solução estoque de agar foi diluída com meio de cultura para se obter uma solução de 0,3% de agar em α-MEM. 0,5 ml /alvéolo da solução foi suavemente misturada e divididas em alíquotas em placas de 24 poços. CD133

+, CD133

– e tipo Wilde Saos-2, células MG63 e U2OS foram sucessivamente plaqueadas e incubadas durante 21 dias a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% CO2 em ar e 50 ul α-MEM . No final do período de incubação, as colónias foram coradas com 150 ul /poço de NBT (nitrobluetetraziolium) na concentração de 1 mg /2 ml em PBS, e contadas utilizando um microscópio invertido (Nikon TS 100, Nikon, Milão, Itália) .

a coloração de imunofluorescência

CD133

+ e CD133

– células cultivadas em placas de 24 poços foram fixadas com uma solução de paraformaldeído a 4% /0,2% de Triton em PBS durante 30 min a 4 ° C, lavadas em PBS, tratadas com PBS leite /5% durante 60 min à temperatura ambiente e depois coradas com anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite. Os anticorpos primários utilizados foram de ratinho anti-humano CD133 /2 conjugado com PE (Miltenyi Biotec), de ratinho anti-humano conjugado com FITC faloidina (AlexaFluor-Invitrogen) foram incubadas durante 60 min a 4 ° C. Os núcleos foram corados com DAPI. As células foram então lavadas duas vezes como descrito acima e observadas ao microscópio de fluorescência (Nikon TE 2000-S, Milão, Itália). Isotipos e células não-sondados foram usadas como controlos.

Sphere Assays

As células foram plaqueadas a uma densidade de 60.000 células /poço em placas de 6 poços ultra-baixas de fixação (Corning Inc., Corning , Nova Iorque, EUA) em meio /célula F12 de DMEM, suplementado com 1% de metilcelulose, progesterona (10 nM), putrescina (50? M), selenito de sódio (15 nM), transferrina (13 ug /ml), insulina (10 ug /ml; Sigma) e EGF humano (10 ng /ml) e bFGF humano (10 ng /ml; Sigma) [13]. alíquotas frescas de EGF e bFGF foram adicionados a cada dois dias. Após cultura durante 48-72 horas, as esferas eram visíveis no invertida microscópio de contraste de fase (Nikon TS 100, Nikon).

microscopia confocal de varredura a laser

Células cultivadas em placas de 24 poços foram fixados com 4% de paraformaldeído durante 30 min a 4 ° C, lavadas em PBS, tratadas com PBS leite /5% durante 60 min à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas com os anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite. O anticorpo primário era um rato anti-humano CD133 /1 Pure (Miltenyi Biotec); o anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com FITC ou PE Abcam) foi incubada durante 60 min a 4 ° C, e o DAPI, usado para corar o núcleo, foi incubou-se durante 7 minutos à temperatura ambiente. O mesmo procedimento foi realizado em sarcospheres. Todas as células marcadas foram armazenadas a 4 ° C antes da aquisição de imagens, utilizando um Zeiss laser de varredura confocal microscópio LSM 510 Meta (Zeiss- Oberkocken-Alemanha). As imagens foram capturadas com uma resolução de 512 × 512 pixels. A fluorescência laser de argônio apropriado para a visualização do CD133 foi utilizado com um comprimento de onda de excitação de 488 nm e filtro de emissão BP 505-530.

Imuno-histoquímica

células

Immunoistochemistry para CD133 em SAOS2, MG63 e U2OS foi realizada. As células foram colocadas em placas a uma densidade de 50.000 células /poço em placas de 24 cavidades, fixadas com 3,5% de paraformaldeído durante 10 min a 4 ° C, e lavadas em PBS. O anticorpo primário utilizado foi de ratinho anti-humano CD133 /1 puro (Miltenyi Biotec). Para o anticorpo secundário e a coloração, o kit DAKO Cytomation En Visão + System-HRP (AEC) foi usada de acordo com as instruções do fabricante. Os núcleos foram coradas com hematoxilina e as células foram observadas ao microscópio de luz invertida. Este procedimento também foi realizado em sarcospheres.

RT-PCR em tempo real

As sequências de mRNAs do banco de dados de nucleotídeos (National Center for Biotechnology Information, EUA) foram utilizados para conceber pares de primers para RT reações-PCR (Primer Express, Applied Biosystems, CA, EUA). As sequências dos iniciadores estão disponíveis mediante pedido. regiões apropriadas de HPRT (Hipoxantina-fosforribosiltransferase guanina) de ADNc foram utilizados como controlos.