Abstract

Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de moléculas de RNA não-codificantes de pequeno porte que desempenham um papel importante na carcinogénese e na progressão tumoral. Neste estudo, nós investigamos as funções e mecanismos de miR-140 no cancro do pulmão de células humanas não-pequenas (NSCLC). Descobrimos que o miR-140 é significativamente regulada negativamente em tecidos e linhas celulares de NSCLC. Tanto o ganho-de-função e estudos de perda de função demonstrado que o miR-140 suprime a proliferação de células NSCLC, migração e invasão in vitro. Mais importante, a sobre-expressão de miR-140 eficaz reprimido crescimento de tumores e metástases em modelos de ratinho nu. análise integrada identificados IGF1R como um alvo direto e funcional do miR-140. Knockdown da proliferação celular inibida IGF1R e invasão semelhante a de miR-140 sobre-expressão, enquanto que a sobre-expressão de IGF1R atenuou a função de miR-140 em células NSCLC. Juntos, nossos resultados destacam a importância de miR-140 e IGF1R no desenvolvimento e progressão de NSCLC

Citation:. Yuan Y, Shen Y, Xue L, Fan H (2013) miR-140 suprime o crescimento do tumor e metástase de Non-Small Cell Lung Cancer alvejando Insulin-like growth factor 1 Receptor. PLoS ONE 8 (9): e73604. doi: 10.1371 /journal.pone.0073604

editor: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, Estados Unidos da América

Recebido: 26 de maio de 2013; Aceito: 24 de julho de 2013; Publicação: 10 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yuan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm financiamento ou apoio ao relatório

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a causa número um de câncer. relacionada morte no mundo, e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por pelo menos 80% de todos os casos de câncer de pulmão [1,2]. Apesar dos recentes avanços no diagnóstico e tratamento desse tipo de câncer, a taxa de mortalidade global das NSCLC continua a ser elevada, ea taxa de sobrevida global em 5 anos associado com NSCLC é um lúgubre 11% [3]. Diante disso, é urgentemente necessária uma boa compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento NSCLC e progressão.

Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de moléculas de RNA não-codificantes pequenas que regulam negativamente a expressão de genes alvo por qualquer degradação do mRNA ou inibição da translação [4]. miARN pode regular a expressão de uma vasta variedade de genes-alvo; portanto, eles estão envolvidos em uma ampla gama de processos biológicos, incluindo a proliferação celular, apoptose, diferenciação e migração [5-7]. Recentemente, evidências crescentes indicam que a expressão anormal de miARNs correlaciona-se com uma variedade de cancros, e que miARN pode funcionar como oncogenes e supressores de tumor [8,9]. No cancro do pulmão, várias, tais como miARNs let-7 família, o miR-200, o miR-486 e miR-146a, têm sido identificados como supressores de tumor [10-14]; Por outro lado, o miR-31, o miR-212 e miR-196a foram encontrados para promover NSCLC carcinogénese [15-17].

miR-140 tem atraído muita atenção porque ele está envolvido no desenvolvimento e progressão de vários tipos de câncer, incluindo câncer de mama, osteosarcoma, câncer de cólon e carcinoma hepatocelular [18-20]. Estes resultados sugerem que as funções de miR-140 como um papel supressor de tumor nestes cancros; no entanto, para o nosso conhecimento, as suas funções e os mecanismos potenciais em NSCLC permanece obscuro. Neste estudo, que fornece a primeira evidência para um papel de miR-140 em NSCLC tumorigénese e progressão, e elucida parcialmente o mecanismo molecular subjacente a este efeito. Descobrimos que o miR-140 é regulada negativamente em tecidos e linhas celulares de NSCLC. A sobre-expressão de miR-140 inibiu o crescimento tumoral, invasão e metástase de células NSCLC. Além disso, identificou-IGF1R como um gene alvo de miR-140 e miR-confirmou que 140 exerce o seu efeito sobre a inibição do crescimento de tumores e metástases por regulação negativa do IGF1R. Nossos resultados demonstram um novo papel de miR-140 como um supressor tumoral em NSCLC.

Materiais e Métodos

As amostras dos pacientes e linhas celulares

NSCLCs humanos e seus tecidos normais pareados (pelo menos 5 cm de distância do tumor primário) foram obtidos de 30 pacientes em Zhongshan Hospital, Universidade de Fudan (Xangai, China). Os tecidos foram rapidamente congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à extracção do ARN. consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente e este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica e Comissão julgamento humano Clínica Zhongshan Hospital. Cinco linhas celulares de NSCLC (A549, SK-MES-1, H157, H520 e H460) e uma linha de células epiteliais dos brônquios do pulmão normal de BEAS-2B foram adquiridos da American Type Culture Collection e cultivadas em DMEM (Thermo HyClone Scientific, Pequim, China) suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 100 U /mL de penicilina, e 100 mg /mL de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Todas as células foram incubadas em 5% de CO

2 atmosfera húmida a 37 ° C.

Isolamento de ARN e quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR)

O ARN foi extraído a partir de tecidos e linhas de células, utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. A expressão de miARNs maduros foi testada utilizando TaqMan Ensaios MicroRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Uma de duas etapas qRT-PCR foi empregue com os iniciadores específicos para o miR-140 personalizados por Applied Biosystems. U6 snRNA foi amplificada como um controlo interno. analisa qRT-PCR para

IGF1R

e

beta-actina

foram realizadas utilizando SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio, Dalian, China). Os iniciadores utilizados foram os seguintes: iniciador de sentido directo do IGF1R, 5′-GAGAAGGAGGAGGCTGAATACCG-3 ‘; IGF1R iniciador inverso, 5’-GTGATGTTGTAGGTGTCTGCGGC-3 ‘; β-actina para a frente iniciador, 5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3 ‘; e iniciador inverso β-actina, 5’- ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3 ‘. PCR em tempo real foi realizado utilizando o tempo real ABI 7900 máquina de PCR. A expressão relativa de cada gene foi calculada e normalizada utilizando a 2

-ΔΔCt método relativo para U6 snRNA ou β-actina.

infecção por lentivírus e transfecção oligonucleótido

O precursor de miR-140 e IGF1R ARNsi foram adquiridos a Origene (Rockville, Maryland, EUA). A sequência pré-miR-140 e a sequência do IGF1R siRNA foram clonados em pCDH-CMV-MCS-EF1-coGFP construções (Sistema Biosciences, Califórnia, EUA). A produção e purificação de lentivírus foram realizadas anteriormente descrito [21]. As células alvo (1 × 10

6) foram infectadas com unidades transdutoras 1 × 10

7 lentivírus, na presença de 10 ug /ml de polibreno (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA). Lentiviral vector vazio foi utilizado como um controlo. O inibidor de miR-140 e controle negativo foram obtidos a partir Genepharma (Xangai, China). Oligonucleótido transfecção foi efectuada utilizando Lipofectamina 2000 reagente (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram colhidas 48 h após a transfecção.

construção de plasmídeo e ensaios de repórter de luciferase

A sequência de codificação de IGF1R foi adquirido a Origene e clonados em pcDNA3.1 (+) para gerar os vectores de expressão IGF1R. A de tipo selvagem do IGF1R UTR 3 ‘(WT) foi amplificado com os seguintes iniciadores: 5′-ATACTCGAGTTTCCATGCAACCTCCTTCTGC-3′ (directo) e 5’-AGCAAGCTTTCCATCTTCCAAGGAGGAGGCT-3 ‘(inverso). locais de restrição de endonuclease (

Xho I /

Hin

HindIII) foram incorporadas em iniciadores para facilitar a ligação no vector pGL3 básico (Promega, Madison, WI, EUA). Mutagénese dirigida da sequência de semente de miR-140 na IGF1R 3′-UTR (Mut) foi realizada utilizando o QuikChange ™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA, EUA). Para os ensaios de luciferase, o plasmídeo repórter foi cotransfectado com um vector de luciferase de Renilla controlo em células A549 e H157 na presença de qualquer um de miR-140 ou miR-controlo. Após 48 h, as células foram colhidas e a actividade de luciferase foi medida utilizando o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, EUA).

A proliferação celular, ciclo celular e apoptose celular analisa

As células (2 x 10

3) foram semeadas em placas de 96 poços em meio de cultura 100 ul e cultivadas. A proliferação das células foi testada nos pontos de tempo indicados utilizando um kit de CCK-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Para a análise do ciclo celular, as células infectadas ou transfectadas foram fixadas em etanol a 75% e coradas com /mL de iodeto de propídio 50 ug (PI). A distribuição do ciclo celular foi analisada num citómetro de fluxo FACScan (BD Biosciences, Bedford, MD, EUA). Os ensaios de apoptose celular foram realizadas utilizando um Anexina V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences). 1 × 10

4 células foram coradas de acordo com o protocolo do fabricante e, em seguida, analisados ​​com uma citometria de fluxo (BD Biosciences) equipado com um software CellQuest (BD Biosciences).

Ensaios

cicatrização de feridas e invasão

A migração celular foi avaliada por ensaios de cicatrização de feridas. As células foram semeadas em placas de seis poços e cultivadas a 100% de confluência. As feridas foram gerados na monocamada celular utilizando uma ponta de pipeta de plástico. As células foram então lavadas com PBS e cultivadas durante mais 48 horas. A propagação do fechamento da ferida foi observadas e fotografadas sob um microscópio. Para os ensaios de invasão, 1 × 10

5 células em meio isento de soro foram adicionadas para dentro da câmara superior de uma inserção pré-revestidas com Matrigel (BD Bioscience). A câmara inferior foi preenchida com o meio DMEM com soro bovino fetal a 10%. Após 48 horas de incubação, as células que permanecem na superfície superior da membrana foi removida, enquanto que as células que tinham invadido através da membrana foram coradas com 20% de metanol e 0,2% de violeta cristal, fotografadas e contadas sob um microscópio (Olympus, Tóquio, Japão).

Western blotting

análise de transferência de Western foram realizados como previamente descrito [22]. Resumidamente, as proteínas foram extraídas com tampão RIPA suplementado com inibidores de protease e quantificada pelo método BCA (Beyotime, Jiangsu, China). Os lisados ​​(25? G) foram separadas em SDS-PAGE e então electrotransferidas para membranas de nitrocelulose (Whatman, Maidstone, Reino Unido). As membranas foram bloqueadas durante 2 h a temperatura ambiente com uma solução de leite em pó magro a 5% e, em seguida, imunotransferidas noite a 4 ° C com anticorpos primários contra IGF1R e β-actina (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EUA). Após a lavagem, as membranas foram sondadas com anticorpos secundários conjugados com HRP. Os sinais foram visualizados com Enhanced Kit Quimioluminescência Plus (GE Healthcare).

Experiências com animais

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade do Comitê Animal Care Fudan, Xangai, China. Para ensaios de crescimento do tumor, as células A549 infectadas quer com o lentivírus de miR-140 que sobre-expressam ou o lentivírus de controlo foram injectados por via subcutânea nas escápulas direito de ratinhos nus (5 semanas de idade BALB /c-nu /nu, 5 por grupo, 1.5 × 10

6 células para cada ratinho). Os ratinhos foram observados durante 5 semanas para a formação de tumores. O volume do tumor (V) foi monitorizada semanalmente e calculada utilizando a fórmula: V = 0,5 × comprimento x largura

2. Para os ensaios in vivo metástase, 1,5 × 10

6 A549-miR-140 ou A549-miR-células de controlo foram injectados na veia caudal de ratinhos nus (5 por grupo). Após 6 semanas, os ratinhos foram mortos, e colonização do pulmão metastático foi monitorizada e quantificada.

A análise estatística

Os dados foram expressos como a média ± DP a partir de pelo menos três experiências independentes. A diferença entre os grupos foi analisada utilizando Student

t

-test quando se comparam apenas dois grupos ou one-way análise de variância na comparação entre mais de dois grupos. A correlação entre o miR-140 e expressão IGF1R foi avaliada utilizando análise de correlação de Spearman.

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

A expressão de miR-140 está diminuída em tecidos e linhas celulares de NSCLC

Para estudar a expressão e significado do miR-140 em NSCLC carcinogénese, foi medida a expressão de miR-140 em 30 pares de tecidos NSCLC e seus tecidos pulmonares normais comparadas com o uso de PCR de transcriptase reversa quantitativo (qRT-PCR). Os resultados mostraram que o miR-140 de expressão foi significativamente reduzido nos tecidos NSCLC em comparação com os tecidos normais correspondentes (Figura 1A). Além disso, foi determinada a expressão de miR-140 em cinco linhas celulares de NSCLC. Como mostrado na Figura 1B, os níveis de expressão relativos de miR-140 nestas células NSCLC foram significativamente diminuída comparada com a da linha de células normais BEAS-2B. Além disso, foi analisada a correlação entre os níveis de expressão de miR-140 e os parâmetros clínico-patológicas. A análise estatística revelou que a regulação baixa de miR-140 foi significativamente correlacionada com o estágio do tumor e metástases, enquanto nenhuma correlação significativa foi observada em outros parâmetros (Tabela 1). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a regulação negativa de miR-140 podem desempenhar papéis importantes na carcinogénese NSCLC e progressão.

(A), os níveis de expressão de miR-140 em 30 pares de tecidos NSCLC e a sua pulmão normal combinado tecidos foram medidos por qRT-PCR. U6 snRNA foi usada como um controlo interno. (B) os níveis de expressão de miR-140 em linha de pulmão normal das células epiteliais (BEAS-2B) e 5 linhagens de células NSCLC (A549: linha de células de adenocarcinoma; H157, SK-MES1, H520: linhas celulares de cancro escamosas; H460: grandes células linha de células de cancro). *

P Art 0,05, **

P

. 0,01

número

expressão Median

Characteristicof casesof miR- 140

P

Idade (years)≥60180.4214±0.04680.4336 60120.3751±0.0291SexMale210.3972±0.04810.5377Female90.4226±0.0352Smoking statusNo80.4219±0.03930.1834Yes220.3723±0.0436HistologyAC160.3854±0.05020.3670SCC140.3578±0.0440StageI70.5539±0.03570.0059II130.3737±0.0406III100.3005±0.0251MetastasisNo130.4932±0.04560.0008Yes170.3104±0.0413Table 1. A relação entre o miR-140 de expressão e clínico-patológicas parâmetros em NSCLC.

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miR-140 inibe a proliferação celular NSCLC in vitro

Para entender melhor o papel de miR-140 na desenvolvimento de NSCLC, primeiro construído um vector lentiviral expressando as linhas celulares estáveis ​​estabelecidas miR-140 e, como indicado A549-miR-140 e miR-H157-140 depois de infecção por lentivírus. a sobre-expressão bem sucedida de miR-140 maduro nestas células foi confirmada por qRT-PCR (Figura 2A). Tal como mostrado na Figura 2B, a sobre-expressão de miR-140 a proliferação celular significativamente suprimido de células A549 e H157 em comparação com os seus controlos correspondentes. miR-140 sobre-expressão também foi encontrada para induzir apoptose celular em células A549 e H157 (Figura 2C). Em consistente com estes resultados, o miR-140 sobre-expressão desencadeada uma acumulação de células em fase G1, e diminuição do número de células na fase S em ambas as linhas celulares (Figura 2D). Em contraste, knockdown de miR-140 utilizando anti-miR-140 em células H520 promovido o crescimento celular, enquanto que não foi detectada nenhuma alteração significativa no ciclo celular e apoptose das células (Figura S1). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que o miR-140 é capaz de regular o crescimento das células NSCLC.

A549 e células H157 (A) foram infectadas com miR-140 ou miR-controlo lentivírus, e a expressão de miR-140 foi analisado por qRT-PCR. (B) ensaio de viabilidade celular (CCK-8). (c) Ensaios de apoptose celular. Análise (D) do ciclo celular. *

P Art 0,05, **

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. 0,01

miR-140 suprime a migração de células NSCLC e invasão in vitro

Nós investigou também se miR-140 também pode inibir a migração celular e invasão em NSCLC. Usando o ensaio de cicatrização da ferida, verificou-se que a sobre-expressão de miR-140 suprimiu significativamente a mobilidade de células tumorais em células A549 e H157, quando comparada com os seus controlos correspondentes (Figura 3A). Do mesmo modo, ensaios de Transwell com Matrigel demonstrado que o miR-140 diminuiu marcadamente a capacidade invasiva de células A549 e H157 (Figura 3B). Em contraste, a cicatrização de feridas e a invasão de células H520 foi aumentada quando o miR-140 endógeno foi silenciada com anti-miR-140 (Figura S1). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o miR-140 pode suprimir a migração de células NSCLC e invasão in vitro.

A ferida ensaios (A) e ensaios de invasão (B) de células A549 e H157 infectadas com miR-140 ou cura lentivírus miR-controle. Os ensaios de invasão foram determinadas usando ensaios de Transwell com Matrigel. Ampliação: 100 ×. **

P

. 0,01

miR-140 inibe o crescimento de tumores e metástases em células NSCLC em ratinhos nus

Para determinar o efeito do miR- 140 no crescimento de tumores NSCLC e metástases in vivo, A549-miR-140 e células-miR-A549 de controlo foram inoculados subcutaneamente no flanco de ratinhos nus, e os animais foram cuidadosamente monitorizados para o crescimento do tumor durante 5 semanas. Os resultados ilustraram que tumores de miR-140 que sobre-expressam eram significativamente menores em tamanho e o volume do tumor em comparação com os tumores de controlo (Figura 4A e B). Além disso, examinou-se o efeito de sobre-expressão de miR-140 em NSCLC metástases in vivo. A549-miR-140 e células de controlo-miR-A549 foram injectadas em ratinhos nus por injecções na veia caudal. Os ratinhos foram sacrificados 6 semanas após a injecção, e os seus pulmões foram extirpados para observar nidi metastático na superfície deles. Tal como mostrado na Figura 4C, o número de nódulos de metástase pulmonar foi significativamente diminuída no grupo A549-miR-140 quando comparados com o grupo de controlo-miR-A549. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o miR-140 sobre-expressão pode suprimir a tumorigénese e metástase de células NSCLC in vivo.

(A) Fotografia de tumores formados. curva (B) desenhada crescimento medindo os volumes dos tumores nos dias indicados. (C) representante H secções dos tecidos de pulmão isoladas a partir de ratinhos (100 ×) E-coradas. O número total de lesões metastáticas nos pulmões foram contados. **

P

. 0,01

miR-140 regula negativamente IGF1R, visando directamente o seu 3 ‘UTR

Para elucidar os mecanismos moleculares pelos quais miR-140 executa a sua função, nós procurado para potenciais alvos de miR-140 utilizando diferentes métodos computacionais, como TargetScan e miranda. Em particular, nós nos concentramos em oncogenes. IGF1R foi identificado como um alvo candidato de miR-140, porque a sequência complementar de miR-140 foi identificado na sua extremidade 3 ‘UTR por análise TargetScan (Figura 5A). Verificou-se que o nível de expressão média de IGF1R, foi significativamente mais elevada em tecidos NSCLC do que nos tecidos normais correspondentes (Figura S2). Além disso, uma correlação inversa estatisticamente significativa foi observada por análise de correlação de Spearman entre os níveis de miR-140 e ARNm do IGF1R (Figura 5B) de expressão. Além disso, de qRT-PCR e análise de transferência de Western demonstrou que a sobre-expressão de miR-140 diminuiu substancialmente a expressão de IGF1R em células A549 e H157, e que knockdown de miR-140 aumentou a expressão do IGF1R em células H520 (Figura 5C e D). Para validar se IGF1R é o alvo a jusante directa de miR-140, um fragmento de IGF1R UTR 3 ‘contendo o sítio de ligação putativo do miR-140 foi clonado num vector repórter de luciferase. Os ensaios de repórter de luciferase mostraram que a sobre-regulação de miR-140 diminuiu de forma significativa a actividade de luciferase relativa do IGF1R-3’UTR em células A549 e H157, mas não teve efeito sobre o mutante de IGF1R-3’UTR (Figura 5E). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o miR-140 regula negativamente a expressão do IGF1R por direccionamento directamente sua extremidade 3 ‘UTR.

(A), sequências de ligação putativos de miR-140 na IGF1R UTR 3′. A mutação foi gerado na IGF1R UTR 3 ‘por mutação de 3 nt que é reconhecido pelo miR-140. Quer de tipo selvagem (WT) ou mutante (Mut) IGF1R UTR 3 ‘foi subclonado no vector repórter da luciferase dupla. (B) uma correlação estatisticamente inversa entre os níveis de miR-140 e mRNA IGF1R em tecidos NSCLC pela análise de correlação de Spearman. (C, D) da expressão de IGF1R em A549, H157 e H520 células após a infecção ou transfecção foi medida por qRT-PCR e transferência de Western. (E) de ensaio de luciferase em células A549 e H157 co-transfectadas com o miR-140 e um repórter da luciferase contendo o IGF1R 3’-UTR (WT) ou um mutante (Mut). actividades de luciferase foram medidas 48 horas após a transfecção. **

P

. 0,01

IGF1R está envolvida na supressão induzida por miR-140 do crescimento de células NSCLC e invasão

Para examinar melhor se miR- 140 exerce a sua função supressora de tumores através da regulação negativa de IGF1R, foi realizada ganho-de-função e perda de função de análises. Em primeiro lugar, as células A549 foram infectadas com as construções de lentivírus que contêm o IGF1R siRNA ou o controlo negativo. A análise Western blot confirmou que a expressão de IGF1R foi suprimida (Figura 6A). Como esperado, o IGF1R knockdown crescimento celular inibido significativamente, induzido a paragem em G1, e aumento da apoptose em células A549 (Figura 6B, C e D). Além disso, os ensaios indicaram que Transwell IGF1R regulação baixa suprimiu a invasão de células de células A549 (Figura 6E). Estes resultados foram semelhantes para os efeitos da sobre-expressão de miR-140. Subsequentemente, as células A549-miR-140 foram transfectadas com plasmídeos falta IGF1R UTR 3 ‘. Como mostrado na Figura 6B, C e D, a superexpressão de IGF1R, salvado significativamente o miR-140 induzida por inibição do crescimento celular, paragem do ciclo celular e apoptose. O efeito inibidor de miR-140 na invasão celular também foi antagonizado pela sobre-expressão do IGF1R (Figura 6E). Tomados em conjunto, estes dados demonstram que o IGF1R é um alvo funcional de miR-140.

células A549 foram infectadas com IGF1R Si específica, ou transfectada com o plasmídeo de IGF1R falta UTR 3 ‘juntamente com o miR-140. (A) análise de transferência de Western. (B) ensaio de viabilidade celular (CCK-8). Análise (C) do ciclo celular. (D) Os ensaios de apoptose celular. ensaios de invasão (E) Transwell. *

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. 0,01

Discussão

miRNAs têm sido relatadas para desempenhar papéis importantes na carcinogênese e progressão tumoral [23,24]. Alterações da expressão miARNs estão implicados em quase todos os aspectos da biologia do cancro, incluindo o crescimento celular, a apoptose, a migração e /ou a invasão, e que pode funcionar como supressores de tumores ou oncogenes [25]. No presente estudo, nós nos concentramos em miR-140, que foi indicado para ser um supressor de tumor possível em malignidade humanos. Song et al. mostraram que a superexpressão da proliferação celular inibida miR-140 em ambos os osteossarcoma e cancro do cólon linhas de células [19]. Mais recentemente, Yang e colegas relataram que o miR-140-5p é significativamente diminuída em tecidos e linhas celulares de carcinoma hepatocelular, e a sua sobre-expressão suprime o crescimento de tumores e metástases por segmentação factor de crescimento transformante β receptor de um factor de crescimento de fibroblastos e 9 [20]. Até à data, no entanto, o papel de miR-140 em NSCLC carcinogénese e os mecanismos moleculares pelos quais o miR-140 exerce as suas funções permanecem obscuros.

Neste estudo, mostrou que o miR-140 de expressão foi significativamente diminuída em NSCLC tecidos e linhas celulares. A sobre-expressão de miR-140 pode efectivamente inibir a proliferação de células NSCLC, induzem a paragem do ciclo celular, aumentar a apoptose, e suprimir o crescimento do tumor em ratinhos nus. Além disso, o miR-140 sobre-expressão reprimida significativamente a motilidade celular e invasão in vitro e metástase do tumor in vivo. Por conseguinte, knockdown de miR-140 promoveu a proliferação celular e a invasão. Estes resultados sugerem que miR-140 pode ser um romance miRNA supressor de tumor em NSCLC.

Para elucidar os mecanismos subjacentes envolvidos na inibição induzida por miR-140 no crescimento NSCLC e metástase, usamos diferentes algoritmos de previsão para prever genes alvos para miR-140. O oncogene do receptor de factor de crescimento 1 semelhante à insulina (IGF1R), que é frequentemente sobre-expressa em muitas malignidades e as funções como um importante regulador da proliferação celular, sobrevivência, e metástase [26-29], foi identificada como um alvo a jusante crítica de miR -140, e esta conclusão é suportada pelos seguintes elementos: (a) sequência complementar de miR-140 é identificada na 3 ‘UTR do mRNA do IGF1R; (B) a sobre-expressão de miR-140 reduziu significativamente os níveis de IGF1R em células NSCLC, enquanto knockdown de expressão de miR-140 enhancedIGF1R; (C) o miR-140 sobre-expressão reduziu a actividade de um repórter da luciferase contendo o tipo selvagem 3 ‘UTR do mRNA do IGF1R; (D) os efeitos inibidores de miR-140 na proliferação NSCLC celular, apoptose e invasão foram revertidos pela superexpressão de IGF1R; (F) IGF1R, foi regulado positivamente em tecidos NSCLC e inversamente correlacionado com os níveis de expressão de miR-140. Em conjunto, estes dados sugerem fortemente que o miR-140 inibe o crescimento NSCLC e metástases através downregulating IGF1R.

Em conclusão, o presente estudo mostrou que o miR-140 é significativamente regulada negativamente em tecidos NSCLC e linhas celulares. A sobre-expressão de miR-140 inibe o crescimento de tumores e metástases de NSCLC através de direccionamento directamente do IGF1R. Nossos dados sugerem que a frequência subregulado miR-140 leva ao aumento da expressão de IGF1R e por sua vez contribui para o desenvolvimento e progressão do NSCLC.

Informações de Apoio

Figura S1.

Konckdown de miR-140 promove a proliferação celular, migração e invasão de células H520. As células H520 (A) foram transfectadas com anti-miR-140 ou anti-controlo, e a expressão de miR-140 foi analisada por qRT-PCR. (B) ensaio de viabilidade celular (CCK-8). (c) Ensaios de apoptose celular. Análise (D) do ciclo celular. (E) a cicatrização de feridas ensaios. ensaios de invasão (F) Transwell. *

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doi:. 10.1371 /journal.pone.0073604.s001

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Figura S2 .

IGF1R é regulada positivamente em tecidos NSCLC. A expressão de IGF1R em tecidos NSCLC e tecidos pulmonares normais emparelhadas foi medida por qRT-PCR. **

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doi:. 10.1371 /journal.pone.0073604.s002

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