Abstract

carcinoma pulmonar de células não pequenas (NSCLC) é uma das principais causas de morte no câncer relacionado morte humana . A sua intervenção terapêutica exige molécula eficiente superiores (s) como frequentemente se torna resistente a apresentar opções de quimioterapia. Aqui nós relatamos que o vapor de compostos voláteis do petróleo obtidos a partir de

Litsea Cubeba

sementes mortas células NSCLC humana, A549, através da indução de apoptose e ciclo celular prisão. O vapor gerado a partir de óleos combinados (VCO) desativados Akt, um jogador-chave na sobrevivência de células cancerosas e proliferação. Curiosamente VCO desfosforilado Akt, tanto Ser

473 e Thr

308; através da supressão da mTOR e pPDK1 respectivamente. Como consequência disso, a fosforilação de Bad diminui ocorreu juntamente com a expressão de Bcl-xL diminuiu. Este posteriormente reforçada níveis Bax que permitam a libertação de citocromo c para o citosol que concomitantemente activado caspase 9 e caspase 3, resultando a morte celular por apoptose. Imparidade de ativação da Akt por VCO também desactivada Mdm2 que efetuou superexpressão de p53 que por sua vez regulada a expressão da p21. Isto faz com que a ligação aumentada de ciclina D1 que interrompida G1 a progressão da fase S p21. Tomados em conjunto, VCO produz dois efeitos pinos em células de câncer de pulmão, que induz a apoptose e bloqueou a proliferação de células de câncer, tanto ocorreu devido à desativação da Akt. Além disso, ele tem outra vantagem crucial: VCO poderia ser entregues diretamente ao tecido câncer de pulmão através da inalação

Citation:. Selo S, Chatterjee P, Bhattacharya S, Pal D, Dasgupta S, Kundu R, et al. (2012) Vapor de óleos voláteis de

Litsea cubeba

Semente induz a apoptose e provoca a parada do ciclo celular em células de câncer de pulmão. PLoS ONE 7 (10): e47014. doi: 10.1371 /journal.pone.0047014

editor: Gobardhan Das, Centro Internacional de Engenharia Genética e Biotecnologia, Índia |

Recebido: 28 de junho de 2012; Aceito: 11 de setembro de 2012; Publicado: 16 Outubro 2012 |

Direitos de autor: © Seal et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa trabalho foi apoiado financeiramente pela concessão do CSIR-Neep Projeto (HCP-005). Os autores SS e PC são gratos ao Departamento de Ciência Tecnologia, Govt. da Índia, Nova Deli; Sushmita Bhattacharya, DP e RK gratos a Conselho de Investigação Científica e Industrial (CSIR), Nova Deli, para a atribuição de Bolsas de Investigação. SD é grato a UGC para Dr. D. S. Kothari PDF CSIR-Neist para QHF; e Samir Bhattacharya à Academia Nacional de Ciências da Índia para a sua posição INSA cientista sênior. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. O co-autor Prof. Samir Bhattacharya é um membro do Conselho Editorial PLOS. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de pulmão é um dos cânceres mais prevalentes e uma das principais causas de câncer em todo o mundo relacionados morte em aproximadamente 1,4 milhões de pacientes por ano [1]. Entre o cancro do pulmão, cancro do pulmão de não pequenas células (NSCLC) compreende ~ 80% e dentro do qual adrenocarcinoma é consideravelmente alta na taxa de [2] ocorrência e mortalidade. A quimioterapia e /ou irradiação normalmente falha devido células NSCLC são intrinsecamente resistentes a tais terapias, além disso prognóstico do NSCLC é notavelmente pobre [3], [4]. Todos estes afetou uma opção terapêutica muito limitada para câncer de pulmão. Portanto, há uma necessidade crucial para desenvolver um quimio-intervenção específica alvo para retardar a proliferação do câncer ou para induzir a apoptose, ou ambos para gerir o problema do NSCLC.

Para abordar a questão da situação alarmante do NSCLC, várias tentativas têm sido feito para procurar alvos moleculares adequados para intervir progressão células cancerosas e apoptose. Em células NSCLC, Akt /PKB é a quinase constitutivamente activa que promove a sobrevivência celular [5]. Activação da Akt ocorre quando ele é recrutado para a membrana celular através do seu domínio PH e fosforilada em Thr

308 e Ser

473 através da mediação de PDK1 (fosfatidilinositol quinase dependente 1) e mTOR (alvo da rapamicina em mamíferos), respectivamente [6], [7]. Curiosamente, a activação da Akt aberrante contribui grandemente para a carcinogênese de pulmão [8]. Akt fosforilada (pAkt) é um poderoso promotor da sobrevivência das células, uma vez que esta via mantém vivo, protegendo a Bcl-xL e antagonizar vários componentes das cascatas apoptóticas [9]. Embora a resposta apoptótica devida à inibição da Akt tem sido observado em vários graus em vários tipos de cancros [10], [11] pode ser crucial para o cancro do pulmão por causa reforçada forma fosforilada da Akt ocorre perpetuamente [12].

Akt regula p53, uma proteína supressora de tumor que controla a progressão do ciclo celular, através de Mdm2 (murino mutante duplo-2), uma ubiquitina ligase. Mdm2 é um substrato da Akt, a fosforilação das proteínas MDM2 por ubiquitinação e degradação efeitos Akt proteossómica de p53 [13]. portanto activado Akt elimina um grande obstáculo para a progressão de células cancerígenas. Outra dimensão importante da Akt é o seu efeito inibitório sobre a via apoptótica. Bad, um membro de Bcl

2 família verificou-se ser a primeira proteína que inicia a apoptose através do deslocamento de Bcl

2 ou Bcl-XL que permite Bax para oligomerizar e crie poros na membrana mitocondrial para a libertação de citocromo c em o citosol [14], [15]. Activado Akt fosforila Bad em Ser136 fazendo com que ele dissociar-se a Bcl-xL de membrana mitocondrial e associado com uma proteína adaptadora resultante 14-3-3 Bad sequestração para o citosol [16], [17]. Alvo melhoria com base de progressão de células NSCLC ou destruição é ainda indisponível e desde Akt é constitutivamente ativa aqui e a quinase bem caracterizado conhecido para apoiar a sobrevivência da célula cancerosa e progressão, a sua desativação seria a melhor escolha para tratar NSCLC.

neste relatório nós demonstramos que os compostos voláteis do petróleo extraído e purificado a partir das sementes de

cubeba cubeba

(Lour.) Pers. (Lauraceae), uma planta amplamente disponível na região do Nordeste da Índia, destrói as células de câncer de pulmão através da desactivação da Akt. Curiosamente, é o de vapor dos óleos que induz a apoptose e impede a proliferação das células do NSCLC, produzindo defeitos na fosforilação de Akt. O vapor dos óleos demonstrou efeitos dois pinos, isto é, a indução da morte apoptótica e retardamento da progressão do ciclo celular, tanto a desactivação ocorre através de Akt. Este relatório esperado, portanto, ter uma atração especial na forma de vapor induzida destruição das células de câncer de pulmão teria dimensão significativa em relação à sua entrega ao tecido alvo.

Materiais e Métodos

Reagentes

Todos os materiais de cultura de células foram obtidos da Gibco-BRL, Life Technologies Inc., Gaithersburg, EUA. Os anticorpos primários de pAkt (Thr308; SC-135650), pAkt1 /2/3 (Ser473; SC-7985-R), Akt 1/2/3 (sc-8312), pPDK1 (Ser241; SC-101775), Bcl -XL (sc-7195), pBAD (Ser136; sc-7999), Bad (sc-7869), pMdm2 (Ser166; sc-293105), p53 (sc-6243), p21 (SC-756), ciclina D1 ( SC-753), poli [ADP-ribosil] -polimerase (PARP) (sc-7150), citocromo C (SC- 7159) e β-actina (SC-130657) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology Inc., Califórnia, EUA e mTOR (# 2983) foi obtido a partir de Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, EUA. A fosfatase alcalina e anticorpos secundários conjugados com FITC, kit de detecção de apoptose Anexina V-Cy3, proteína A agarose e CHAPS foram adquiridos de Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA. kit de ensaio MTT foi obtido a partir de Milipore, Temecula, CA, EUA. Caspase-Glo ™ kit de ensaio de 07/03 foi adquirido de Promega Corporation, Madison, WI, EUA. Mitotracker foi adquirido a partir de Molecular Probes, MD, EUA, JC-1 de membrana mitocondrial kit de ensaio de potencial foi adquirido a partir de Cayman Chemical Company (Ann Harbor, MI, EUA). kit kit escada e rotulagem BrdU DNA apoptótica foram adquiridos a partir de Roche Diagnostics (GmbH, Alemanha).

Extracção e purificação de óleos essenciais a partir de

Litsea cubeba

sementes

Cerca de 250 gm sementes maduras frescas de

Litsea cubeba

, coletadas durante os meses de agosto a outubro de 2009-2011 de fazenda experimental CSIR-Neist, Jorhat, Assam foram embebidas em água destilada e extraído usando um aparelho Clavenger durante 6 horas. O óleo essencial depositada por cima da camada de água foi separada utilizando um funil de separação e seca sobre sulfato de sódio anidro (neutro) e filtrou-se para dar um óleo (6,25 g, 2,5% de rendimento). A cromatografia de camada fina do óleo em bruto indicou a presença de quatro pontos distintos. O óleo em bruto (1 g) foi sujeito a purificação cromatográfica em gel de sílica (20 g, 100-200 mesh, Rankem) coluna (diâmetro de 1 polegada

1H NMR (CDCl

3, 300 MHz): δ 0,96 (d,

J

= 6,6 Hz, 3H, CH

Me

), 1,30-138 (m , 2H, -CHMeC

H

2

CH

2), 1,68 (s, 3H, = C

Me

), 1,98 (s, 3H, = C

Me

), 1,98-2,06 9m, 3H, = C

CH

2 viajantes – -C

H

Me-), 2,24 (dd,

J

= 7,9, 2,6 Hz, 1H, -C

H

HCHO), 2,37 (dd,

J

= 5,4, 1,6 Hz, 1H, CH

H

CHO), 5,06 (t,

J

= 7,0 Hz, 1H, -C

H

= CMe

2), 9,75 (s, 1H, -C

H

O). MS (ESI): 155 (M

++ 1); bp 206 ° C (lit. 207 ° C)

Composto 2 (C2):.

IV (CHCl

3): υ 2925, 1722, 1643, 1455, 1445, 1375, 1219, 1024, 889, 772 cm

-1;

1H NMR (CDCl

3, 300 MHz): δ 0,87 (d,

J

= 6,6 Hz, 3H, CH

Me

), 0,92-0,95 (m , 1H), 1,08-1,12 (t,

J

= 6,6 Hz, 1H), 1,47-1,54 (m, 1H), 1,68-1,75 (m, 3H), 1,79 (s, 3H,

Me C = CH

2), 1,95-1,99 (m, 2H), 3,98 (m, 1H, C

H

OH), 4,78 (s, 1H, = C

H

2), 4,95 (s, 1H, = C

H

2); MS (ESI):. 154 (M

+)

Composto 3 (C3):

IV (CHCl

3): υ 2923, 1645, 1455, 1448, 1375, 1219, 1095, 1051, 1027, 886, 772 cm

-1;

1 H-NMR (CDCl

3, 300 MHz): δ 0,90-1,03 (m, 2H), 0,95 (d,

J

= 6,6 Hz, 3H, -CH

Me

), 1,30-1,35 (m, 1H), 1,47-1,54 (m, 1H), 1,63-1,65 (m, 1H), 1,69 (d,

J

= 1,5 Hz, 3H,

Me C = CH

2), 1,87-1,89 (m, 1H), 2,03-2,06 (m, 2H), 3,50 (dt, 1H,

J

= 10,4, 4,2 Hz , C

H

OH), 4,85 (s, 1H, = C

H

2), 4,89 (s, 1H, = C

H

2); MS (ESI): 154 (M

+); bp 213 ° C (lit. 212 ° C)

Composto 4 (C4):.

IV (CHCl

3): υ 3338, 2925, 1452, 1377, 1219, 1058, 1010, 738 cm

-1;

1H NMR (CDCl

3, 300 MHz): δ 0,91 (d,

J

= 6,6 Hz, 3H, CH

Me

), 1,15-129 (m , 2H, -CHMeC

H

2

CH

2), 1,33-1,45 (m, 2H, -C

H

2

CH

2OH ), 1,51-1,53 (m, 1H, -C

H

Me-), 1,60 (s, 3H, = C

Me

), 1,68 (s, 3H, = C

Me

), 1,96-2,01 (m, 3H, = C

CH

2 viajantes – O

H

), 3,61-3,74 (m, 2H, – C

H

2 OH), 5,07 (t,

J

= 7,0 Hz, 1H, -C

H

= CMe

2); MS (ESI): 157 (M

++ 1); bp 223 ° C (lit. 222 ° C).

cultura celular e tratamentos

O A549 linha de células de cancro do pulmão, foi um presente amável do Dr. Partha P. Banerjee (Georgetown University Medical Centre, Washington DC, EUA), que ele obteve de American Type Culture Collection (ATCC), EUA. As células foram cultivadas em DMEM contendo sais de Earle e aminoácidos não essenciais suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 ug /ml) numa atmosfera humidificada de 95% de O

2/5% CO

2 atmosfera a 37 ° C. As células confluentes foram subcultivadas por tratamento com tripsina e subsequentemente semeadas em placas de cultura de 6 poços contendo DMEM com suplementos essenciais.

As células foram semeadas numa placa de seis bem mantendo uma bem desprovida de células. Quando atingido confluência, o petróleo bruto ou de cada composto individual ou VCO foram diluídos em DMEM e aplicado no poço vazio da placa preparada para tratamento. meios contendo VCO foi reabastecido a cada 24 h durante a duração da experiência. As células foram incubadas em diferentes períodos de tempo com várias diluições de VCO como mencionados sob as figuras. As células de controlo foram mantidas numa incubadora separado para evitar qualquer exposição do VCO. No final da incubação, as células foram lisadas, centrifugadas durante 10 min a 10000 g a 4 ° C e o sobrenadante foi recolhido. O teor de proteína de sobrenadante foi determinada pelo seguinte método de Lowry et ai. [19]. Mexidos ou p53 ou siRNA Sp1 siRNA foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante.

viabilidade celular MTT ensaio

A viabilidade celular foi determinada usando o kit de ensaio de MTT (Milipore, Temecula, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços e foram expostas a diluições variadas de óleos de petróleo bruto ou de vapor durante 72 h ou VCO para diferentes períodos de tempo. 10 ul de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) de brometo de tetrazólio -2-5-difenil (MTT) foi adicionado a cada poço durante 4 h a 37 ° C. Após solubilização em 100 ul de 1 (N) de isopropanol /0,04 (N) de HCl, a absorvância foi lida a 595 nm num leitor de microplacas (Thermo Electron Corporation, MA, EUA).

AnnexinV-Cy3 ensaio de detecção

AnnexinV-Cy3 kit de detecção de apoptose, adquirido a partir de Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA foi utilizado para diferenciar entre vivo (fluorescência verde), necrótica (fluorescência vermelha) e células apoptóticas (verde e fluorescência vermelha). As células A549 incubadas sem ou com VCO de diluição (2 x 10

3) durante 36 h foram lavadas exaustivamente com PBS, colhidas e 50 ul de suspensão de células foi manchada sobre lâmina de vidro revestido de poli L-lisina. As células foram então lavadas três vezes com tampão de ligação e coradas com solução de coloração de dupla marcação (anexina V-Cy3 e 6 carboxi fluoresceína Di-Acetato (CFDA) durante 10 min. Agente de marcação em excesso foi removido por lavagem das células três vezes com tampão de ligação e o As células foram observadas em microscópio de fluorescência (Zeiss Axio Scope A1, Carl Zeiss, Gottingen, Alemanha).

JC-1 membrana mitocondrial Potencial Ensaio

JC-1 coloração foi realizada utilizando JC- 1 membrana mitocondrial kit de ensaio de potencial, Cayman Chemical Company, (Ann Arbor, MI, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, o controlo e VCO (2 × 10

3 diluição) as células tratadas foram submetidas a JC-1 mancha (10 ug /ml) durante 20 min a 37 ° C. a mudança de fluorescência devido ao tratamento VCO foi observada sob microscópio de fluorescência (Zeiss axio Âmbito A1, Carl Zeiss, Gottingen, Alemanha).

ensaio de fragmentação do ADN

ADN de baixo peso molecular foi extraído de 1 × 10

6 de controlo ou VCO (2 × 10

3dilution) células tratadas usando kit de escada de ADN apoptótico de Roche Diagnostics, (GmbH, Alemanha) seguindo o instruções do fabricante. Amostras de DNA eluído foram então carregados em brometo de etídio manchada 1,5% gel de agarose e imagem foi capturada pela Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, EUA usando o software Image Lab.

Eletroforese e immunoblotting

60 ug de proteína de controlo ou de lisados ​​de células tratadas foram resolvidos em 10% ou 12,5% de SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF (Millipore, Bedford, MA) com a ajuda da semi-seco Aparelho blot trans (TE77 unidade de transferência semi-seco, a GE Cuidados de Saúde, CA, EUA). As membranas foram inicialmente incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários em diferentes diluições 1:500 seguido de anticorpos secundários respectivo conjugado com fosfatase alcalina em 1:2000 diluições à temperatura ambiente durante 2 h. As bandas de proteína foram detectadas usando 5-cloro-4 bromro fosfato de 3-indolilo /tetrazólio de nitroazul (BCIP /NBT). A intensidade das bandas foi avaliada pelo software Image Lab (Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, EUA).

estudo Imunofluorescência de citocromo c

células A549 foram cultivadas em estéreis não revestidos lamelas de vidro. Ambos os controlo e VCO (2 × 10

3) diluição de células tratadas foram coradas com Mitotracker (Molecular Probes, MD, EUA) em 1:10,000 (diluições em DMEM) durante 15 min. As células foram adicionalmente lavadas com DMEM e processados ​​para fixação. Após a fixação, as células foram incubadas com anticorpo anti-c citocromo (1:100) durante 2 h, seguida por incubação com anticorpo secundário conjugado com FITC (1:50) durante mais 1 h à temperatura ambiente. As células foram contra-coradas e montadas com meio de montagem DAPI e observadas ao microscópio de fluorescência (Zeiss Axio Scope A1, Carl Zeiss, Gottingen, Alemanha).

Caspase-Glo 3/7 ensaio

células A549 foram semeadas em placas de cultura de 96 poços e incubadas com ou sem VCO de diluição (2 x 10

3) para diferentes períodos de tempo. A cessação de incubações, a actividade de caspase foi medida usando a caspase-Glo ™ 07/03, Promega Corporation, Madison, WI, EUA de acordo com o protocolo do fabricante. A luminescência foi medida num detector de multimodo DTX-800 (Beckman Coulter, CA, EUA).

incorporação de BrdU ensaio

a síntese de ADN foi monitorizada por medição da incorporação de timidina análogo 5-bromo-2 ‘ desoxiuridina (BrdU) no crescimento de células cancerosas, utilizando marcação com BrdU e kit de detecção. (2 × 10

3) diluição de células A549 tratadas e de controlo de VCO foram funciona com meio completo contendo reagente de marcação BrdU e incubou-se durante 1 h. As células foram então cuidadosamente lavadas com tampão de lavagem e fixadas com fixador de etanol durante 20 min a -20 ° C. As células fixadas foram lavadas e incubadas com uma solução de anticorpo anti-BrdU seguido por solução de fluoresceína de Ig anti-ratinho. As células foram então montadas em lâminas de vidro e observados em microscópio de fluorescência (Zeiss Axio Scope A1, Carl Zeiss, Gottingen, Alemanha).

cromatina imunoprecipitação (CHIP) Ensaio

ensaio ChIP foi realizada utilizando um kit de ensaio de chip (Upstate, Temecula, CA, EUA), seguindo o protocolo do fabricante utilizando o anticorpo anti-p53. Iniciadores foram utilizados para amplificar conhecido elemento de resposta p53 no promotor p21 e estes são – RE1: frente: 5′-CAGGCTGTGGCTCTGATTGG-3’and reversa: 5′-TTCAGAGTAACAGGCTAAGG -3 ‘; RE2: para a frente: 5’-GGTCTGCTACTGTGTCCTCC-3 ‘e inverso: 5′-CATCTGAACAGAAATCCCAC-3’ [20] e os produtos de PCR foram resolvidos em gel corado com brometo de etídio de agarose a 2% e a imagem foi capturada pela Bio-Rad Gel Doc ™ XR +, EUA usando software Image Lab.

Co-imunoprecipitação (Co-PI) ensaio

200 mg de proteína de controlo ou células VCO tratadas foram incubadas durante a noite com 2 ug de anti-p21 e anti β-actina de anticorpo, a 4 ° C com agitação contínua. A proteína A agarose foi então adicionada e incubada durante 4 horas a 4 ° C. complexos antigénio-anticorpo foram recolhidos por centrifugação a 10.000 rpm durante 2 minutos à temperatura ambiente. O sedimento foi lavado 3 vezes para remover qualquer proteína não ligada e fervido com 4 x tampão de amostra durante 5 minutos num banho de água a ferver. A amostra foi centrifugada e o sobrenadante foi carregado em 10% de SDS-PAGE seguido de imunotransf erência com anticorpos anti-ciclina D1 ou anti-β-actina.

Fluxo-citometria Análise

Para ciclo celular análise, o controlo e VCO (2 × 10

3dilution) células A549 tratadas foram tratadas com tripsina, lavadas duas vezes com PBS, e depois fixadas em etanol a 70% durante 24 horas antes da análise do DNA. Após a remoção do etanol por centrifugação, as células foram lavadas duas vezes com PBS. As células foram então incubadas com a RNase (100 ug /ml) durante 30 min e em seguida coradas com iodeto de propídio (PI-5 ug /ml) durante 15 min. Fluorescência de PI das células tratadas foi medida com o citómetro de fluxo (BD FACSAria ™ II). As percentagens de G1, S e G2-M de células foram determinadas usando o software diva FACS.

cultura primária de células pulmonares normais

células pulmonares normais foram isolados a partir de ratos Sprague Dawley do sexo masculino seguintes Phan et ai. [21], Resumidamente, ratos saudáveis ​​normais foram anestesiados e os pulmões foram, em seguida, perfundidos com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) através do ventrículo direito até que eles estavam pálidos. Em seguida, os pulmões foram removidos, picadas e digerido em PBS contendo 0,5% de tripsina durante 45 minutos a 37 ° C. células digeridos foram separados a partir de tecido não digerido e detritos por filtração através de malha de nylon. As células foram então lavadas com PBS, em seguida, com DMEM contendo 10% de soro bovino fetal e antibióticos, e, finalmente, ressuspensas no meio. As células foram então plaqueadas numa placa de seis mantendo uma bem desprovida de células e incubou-se em um 95% de O humidificada

2/5% de CO

2 atmosfera a 37 ° C. Após 1 hora, as células foram incubadas com 2 × 10

3 diluição de C2 ou C3 ou C4 ou VCO, durante 12 horas. As células de controlo foram mantidas numa incubadora separado para evitar a presença de vapor. No final da incubação, as células foram lisadas, centrifugadas durante 10 min a 10000 g a 4 ° C e o sobrenadante foi recolhido. O teor de proteína de sobrenadante foi determinada pelo seguinte método de Lowry et ai. [19].

A análise estatística

Os dados foram obtidos a partir de pelo menos três experiências independentes e analisados ​​por análise de uma via de variância (ANOVA), quando o valor F indicaram significância, as médias foram comparadas pelo um teste de gama múltipla post hoc. Todos os valores foram de médias ± SEM.

Resultados

bioatividade guiada isolamento e purificação de óleos da semente de

Litsea cubeba

O vapor de óleo bruto extraído de

cubeba cubeba

sementes foi examinado para actividade anti-cancro em células de câncer de pulmão A549. Várias diluições de petróleo bruto foram preparadas e cada diluição foi adicionada em um dos 6 poços de placas de cultura, enquanto outras 5 poços continham células NSCLC A549. O vapor gerado a partir de cada diluição era esperado para estar se espalhando por toda a placa e atingir as células cancerosas. Dose de exposição dependentes de vapor diminuiu a viabilidade das células A549 significativamente a 72 h com [10

3] e [10

2] diluições que, até [10

4] diluições a vapor teve nenhum efeito notável sobre a capacidade de sobrevivência de células (Fig. 1A). A purificação cromatograf ica de

Litsea cubeba

semente óleos essenciais deu origem a quatro tipos de compostos, identificados por meio de massa e

espectro 1H RMN com compostos autênticos e a sua natureza química foi detectado como se segue – C1: citronelal; C2: neo-isopulegol; C3: isopulegol e C4: citronelol (Fig. 1B), cada um foi adicionado separadamente a uma diluição de células A549 [2 × 10

3], em uma placa de cultura de 6 poços, os poços continham outros 5. Os vapores gerados após a adição do óleo para o poço foram expostas às células durante 72 h. Pode ser visto a partir da Fig. 1C que tinha fraca actividade de C1, C2 e C3 exibiram actividade 3 vezes maior em comparação com C1, C4, enquanto teve actividade mais elevada, a mortalidade celular até agora está em causa.

(A) a viabilidade celular das células de cancro do pulmão A549 foram medidos quando expostas a vapores de diferentes diluições (10

6-10

2) de óleo em bruto durante 72 h utilizando um ensaio MTT e os dados foram expressos como% de capacidade de sobrevivência celular em relação ao controlo. (B) Estruturas químicas de quatro compostos mais disponíveis (C1-citronelal; C2 neo-isopulegol; C3 isopulegol; C4- citronelol) isoladas de

óleo essencial Litsea cubeba

sementes. Observou-se (C) Percentagem de morte celular quando células A549 foram expostas individualmente com estes compostos durante 72 h. (D) Efeito do VCO (C2:C3:C4 como 01:01:01) e C4 na morte celular em 72 h foi observada pelo ensaio de MTT, que foi visualizado por meio de imagens microscópicas. (E) a capacidade de sobrevivência celular foi medida em intervalos de tempo diferentes (24, 48, 72 h) com a exposição VCO em células A549. (F) Western blot da Akt fosforilação em Thr

308, Ser

473 e Akt total, em células A549 tratadas sem (Con) com C1, C2, C3, C4 e VCO, durante 36 horas. β-actina serviram como controlo de carga interna. Os valores são médias ± SEM de 3 experiências isoladas. * P 0,05, ** p 0,01 versus controle e # p . 0,05 contra C4

Nós combinamos C2, C3 e C4 em 1:01:01 rácio de observar se o vapor para fora do estas combinações poderia produzir efeito adicional ou sinérgico na morte celular ao longo do C4. O vapor a partir dos óleos combinados (VCO) exibiram significativamente (p 0,05) maior actividade na morte de células A549 em comparação com o vapor de C4 por si só (Figura 1D.), Indicando que C2 e C3 produzir efeitos adicionais a C4. Por conseguinte, utilizado o vapor a partir destes óleos combinados i.e. VCO. Quando VCO foi exposto em diferentes períodos de tempo, a morte de células ocorreu de forma linear em função do tempo (Fig. 1E), indicando possibilidade de indução de apoptose por VCO. Nós realizaram experiências para examinar o potencial do composto C1, C2, C3, C4 por determinação da inibição da activação de Akt. Uma vez que em células de cancro do pulmão A549 pAkt é constitutivamente expresso, Akt fosforilação foi feita como marcador para avaliar o efeito anti-cancro. C4 apresentou maior efeito inibitório em comparação com outros compostos (C1, C2, C3), mas VCO que é uma combinação de C2, C3, e C4 produziu efeito inibidor significativamente maior quando comparado com C4 (Fig. 1F). Neste ponto se VCO produz efeito citotóxico em células pulmonares normais seria uma questão relevante. Para observar este, de vapor de C2, C3, C4 e individualmente VCO foi exposto a cultura primária de células pulmonares preparados a partir de rato. O vapor do VCO e os óleos não produzir qualquer efeito adverso na morfologia celular quando comparadas com as células não tratadas. Além disso, também se determinou a inibição de pAkt devido ao VCO nas células pulmonares normais e descobriu que não havia alteração na pAkt (Fig. S1A e B). Todos estes sugerem que a esta dose de VCO, pulmões normais células não são afetados enquanto mesma dose efetuada considerável mortalidade de células de câncer de pulmão.

VCO induz a apoptose em células de câncer de pulmão

Para examinar o VCO efeito sobre a morte das células do cancro do pulmão A549, foi utilizada a coloração dupla de fluorescência com 6-CFDA e anexina V-Cy3 para diferenciar as células vivas, apoptóticos e necróticos. translocação induzida por fosfatidilserina VCO a partir do interior para o folheto exterior da membrana plasmática foi reconhecida pela proteína de ligação a fosfatidilserina Anexina V conjugada com Cy3. Às 36 h, as células A549 de controlo apresentaram coloração apenas com 6-CFDA (verde) enquanto que o tratamento com VCO aumentou o número de Anexina V-Cy3 (vermelho) e 6-CFDA (verde) células duplamente coradas (Fig. 2A) e esta aumentaram com o tempo indicando aumento de células apoptóticas (Fig. 2B). Para estender nossa observação ainda mais, usamos JC-1 corante fluorescente para examinar o potencial de membrana mitocondrial. Em células vivas, devido ao potencial de membrana fisiológica, JC-1 associado com a membrana e forma J-agregados mitocondriais que emitem fluorescência vermelha, enquanto membrana mitocondrial despolarizada em células apoptóticas continha monomérica JC-1 que apresentam fluorescência verde. Pode ser visto a partir da Fig. 2C que as células A549 foram emitindo fluorescência vermelha enquanto VCO incubadas células foram marcadas com fluorescência verde indicando apoptose celular. VCO induzida morte celular por apoptose em células de câncer de pulmão também foi evidente a partir de escada de DNA devido à fragmentação oligonucleosomal da cromatina (Fig. 2D). Estes resultados indicam que o VCO induz a apoptose apenas em células de cancro do pulmão.

(A) Anexina-Cy3 (vermelho) e 6-CFDA (verde) de dupla marcação de células apoptóticas foi examinada por microscopia de fluorescência em células A549 tratadas VCO mostrou manchas tanto verdes e vermelhos e células de controlo (não tratados) manchado verde somente. (B) Percentagem de células apoptóticas A549 foi medida a diferentes pontos de tempo (0 h, 12 h, 24 h, 36 h), com os tratamentos do VCO. (C) o potencial de membrana mitocondrial foi observado no controlo do VCO e expuseram as células cancerosas (36 h) A549 do pulmão por ensaio de coloração com JC-1. fragmentação (D) de ADN apoptótico foi observado por VCO tratados com 549 A de células em electroforese em gel de agarose a 1,5%. Os dados são apresentados como médias ± SEM de três experiências independentes. * P 0,05, ** p 0,01 versus controlo (0 h). Barra representa 20 um.

A inibição da Akt fosforilação por VCO afeta negativamente a jusante de sinalização para a sobrevivência da célula

Na maioria das células cancerosas, Akt é uma escolha principal para a intervenção terapêutica desde ela desempenha um papel-chave na promoção da imortalidade e proliferação de células cancerosas. Fosforilação de Akt em Thr

308 e Ser

473 são críticos em manter essas duas características vitais. tratamento VCO diminuiu drasticamente a fosforilação de Akt em Thr

308 e Ser

473 sem qualquer alteração notável do nível de proteína Akt total, em células cancerosas A549 (Fig. 3A, painel superior B). 36 h de tratamento VCO reduzida pAkt Thr

308 nível de 70% e pAkt Ser

473 nível de 95% em relação a 0 h ou seja, as células cancerosas de controlo (Fig. 3A, B painel inferior). Isso indica que VCO desativa fortemente Akt que permite via apoptótica para o progresso. Activação da Akt é regulada por dois mTOR kinases- discreto e PDK1, primeiro é responsável pela fosforilação da Akt em Ser

473 enquanto este último fosforila nas THR

308. Estudámos, portanto, fosforilação PDK1 e expressão mTOR em resposta a VCO. Não havia diminuição significativa da fosforilação PDK1 e mTOR expressão em células A549, devido à exposição ao VCO (Fig. 3C e D). Desde Akt medeia o seu efeito sobre a inibição da apoptose através de Bad, desactivação de Akt devido ao VCO pudesse compromete seriamente com a activação de Bad. Houve uma diminuição significativa de Bad fosforilação por VCO a 36 h, que é um resultado esperado de diminuição da fosforilação de Akt (Fig. 4A superior e painel inferior).