Abstract

Fundo

O câncer colorretal (CRC) é um dos mais neoplasias comuns, mas as abordagens terapêuticas atuais para CRC avançada são menos eficientes. Assim, novas abordagens terapêuticas são extremamente necessárias. O objetivo deste estudo é investigar o envolvimento de nuclear CK2 proteína quinase α subunidade (CK2α) na progressão tumoral e no prognóstico da CRC humana.

Metodologia /principais conclusões

Os níveis de expressão de CK2α nuclear foram analisados ​​em 245 tecidos colo-rectais a partir de pacientes com CCR por imuno-histoquímica, quantitativa PCR em tempo real e Western blot. Nós correlacionados os níveis de expressão com parâmetros clínico-patológicas e prognóstico em pacientes com CCR humanos. Superexpressão de CK2α nuclear foi significativamente correlacionada com profundidade de invasão, estado nodal, o Comité Misto Americana do Câncer (AJCC) estadiamento, grau de diferenciação e invasão perineural. Pacientes com níveis de expressão elevados de CK2α nuclear teve uma taxa de sobrevida global significativamente mais pobres em comparação com os pacientes com baixos níveis de expressão de CK2α nuclear. Em multivariada análise de regressão Cox, superexpressão de CK2α nuclear foi provado ser um marcador prognóstico independente para CRC. Além disso, DLD-1, células de cancro do cólon humano foram utilizadas como um modelo celular para estudar o papel de CK2α no crescimento celular, e a expressão de CK2α em células DLD-1 foi inibida usando tecnologia de siRNA. Os dados indicaram que o tratamento com siRNA específico do CK2α resultou na inibição do crescimento.

Conclusões /Significado

Em conjunto, superexpressão de CK2α nuclear pode ser um marcador útil para prever o resultado de pacientes com CCR.

Citation: Lin KY, Tai C, Hsu JC, Li CF, fang CL, Lai HC, et al. (2011) sobre-expressão de proteína nuclear quinase CK2 α Catalytic Subunidade (CK2α) como um prognosticador pobre no cancro colorectal humano. PLoS ONE 6 (2): e17193. doi: 10.1371 /journal.pone.0017193

editor: Terence Lee, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 11 Agosto, 2010; Aceito: 25 de janeiro de 2011; Publicação: 17 de fevereiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa (DOH98-TD-I-111-TM006) do Departamento de Saúde, Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) foram responsáveis ​​por cerca de 1 milhão de novos casos em 2002 (9,4% do total mundial), e ao contrário a maioria dos sites, os números não eram tão diferentes em homens e mulheres (razão, 1.2:1) [1]. Em termos de incidência, CRC ocupa a quarta posição na frequência em homens ea terceira em mulheres. Há pelo menos uma variação de 25 vezes na ocorrência de CRC em todo o mundo. As taxas de incidência mais elevadas estão na América do Norte, Europa Ocidental, e, nos homens, especialmente, no Japão. Incidência tende a ser baixa na África e intermediário em partes do sul da América do Sul. Em Taiwan, CRC classifica como a segunda neoplasia mais frequentemente diagnosticado e causa mais de 10.000 mortes por ano (https://www.doh.gov.tw/statistic/index.htm; acessada em dezembro de 2008). Apesar das técnicas cirúrgicas atuais e quimioterapia que fizeram melhorias significativas, a taxa de cura para CRC avançada permanece baixa e a morbidade permanece elevada [2]. Assim, os avanços no tratamento desta doença são susceptíveis de vir a partir de uma compreensão mais completa da sua patogênese e características biológicas.

Prognosis CRC recém-diagnosticados depende predominantemente na American Joint Committee on Cancer (AJCC) estágio determinado pelo profundidade de invasão, o envolvimento dos gânglios linfáticos e metástases à distância [3], [4]. No entanto, de facto, é bem conhecido que os doentes com o mesmo AJCC fase CRC heterogeneidade sobrevivência de exibição, com alguns pacientes exibindo tempos de sobrevivência relativamente curtos. Assim, a identificação de fatores prognósticos mais promissores que são de fato altamente preditiva de pacientes com CCR submetidos ao tratamento cirúrgico é obrigatória. Muitos estudos têm sugerido que a função de alterações genéticas podem ter no desenvolvimento e progressão de CRC [5], [6]. patologia molecular pode ser útil não só para compreender a patogênese da doença, mas também para se obter os marcadores moleculares de prognóstico úteis. Alguns factores de prognóstico biológicos sugeridas incluem a sobre-expressão do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), intensificador de homólogo de zeste 2 e transglutaminase 2 [7] – [9].

CK2 proteína quinase (anteriormente conhecida como a caseína cinase 2) é uma serina /treonina-quinase altamente conservado. Ele é distribuído ubíqua em organismos eucarióticos, onde na maioria das vezes parece existir em complexos tetram�icos constituídos por duas subunidades catalíticas (αα, α ‘α’ ou αα ‘) e duas subunidades p regulamentares [10], [11]. CK2 é uma cinase de proteína multifuncional notavelmente com uma vasta gama de substratos de mais de 300, muitos dos quais estão envolvidos de forma crítica no processo de crescimento celular, proliferação, diferenciação e [12], [13]. Perturbação de

de Saccharomyces cerevisiae

genes que codificam as duas subunidades catalíticas CK2 conduz a uma falha no desenvolvimento, e a demonstração de que nocaute do gene que codifica o regulador CK2 β subunidade em ratos, também é letal reforça a importância de CK2 na manutenção de viabilidade de células na vida normal das células durante a embriogénese e [14], [15]. Na subunidade β, certos resíduos de cisteína podem desempenhar um papel no processo de consolidação da cinase de estruturas nucleares. actividade CK2 pode ter um papel no crescimento celular através da sua sinalização aos locais-chave na matriz nuclear e estruturas de cromatina [16]. Vários estímulos de crescimento pode melhorar vaivém nuclear CK2, de modo que a maior localização nuclear é observada em células tumorais em comparação com as células normais [17], [18].

Além disso, CK2 desregulação em células tumorais podem influenciar a actividade apoptótica e para aumentar a sobrevivência de células [19]. CK2 pode exercer efeitos anti-apoptóticas através de vários mecanismos. Por exemplo, CK2 neutralizar a apoptose através da protecção de lance de necrose tumoral ligando indutor de apoptose relacionado com o factor (TRAIL) induzida pela degradação da caspase-8 mediada por [20]. CK2 também está envolvida na fosforilação de várias proteínas relacionadas com apoptose, incluindo p53and factor nuclear-kB [21], [22]. Além disso, a morte celular mediada por receptor de Fas é regulado pela expressão CK2 [23].

O nível de CK2 parece ser fortemente regulada em células normais, resistindo a uma alteração do respectivo nível intrínseco de CK2 [24]. A evidência crescente que indica CK2 enzima é um componente de redes proteína quinase reguladoras que estão envolvidos em vários aspectos de transformação celular e cancro [25]. Aumentos no nível e atividade CK2 têm sido consistentemente observada em uma variedade de cânceres humanos, incluindo a glândula mamária, cabeça e pescoço e câncer renal [26] – [28]. A sobre-expressão e significado prognóstico da subunidade α CK2 foram observados apenas no cancro do pulmão, cancro da próstata e leucemia [29] – [31]. Para o nosso conhecimento, a expressão e significado prognóstico da CK2α nuclear no CRC humano ainda é desconhecida. Os objetivos deste estudo foram investigar a relação entre a expressão CK2α nuclear e os parâmetros clínico-patológicas e prognóstico em pacientes com CCR humanos. Também foram avaliados os efeitos da expressão CK2α siRNA inibido sobre a proliferação de células cancerígenas do cólon.

Resultados

Dados básicos

Duas centenas e quarenta e cinco pacientes com CCR, 139 machos e 106 fêmeas, foram incluídos neste estudo. A idade variou de 21 a 88 anos idade no primeiro diagnóstico (média de 64 anos). Com base na classificação AJCC, havia 36 pacientes estágio I, 98 estágio clínico II, 110 estádio III pacientes, e um estágio IV paciente. Follow-up para aqueles pacientes variou de 2,93 a 123.97 meses (média de 68,3 meses). Durante o acompanhamento, 69 pacientes morreram de CRC. complicações pós-operatórias não ocorreu nesses pacientes.

expressão CK2α Nuclear foi regulada e associado a vários parâmetros clínico-patológicas em CRC

Nós investigamos a expressão de CK2α nuclear em 245 pacientes com CCR por imuno-histoquímica, e em quatro pacientes por Western blot. Os resultados indicaram que a expressão CK2α nuclear era mais elevada em tecidos tumorais do que em tecidos não tumorais (Figura 1). Além disso, a análise quantitativa PCR em tempo real demonstrou que a expressão de CK2α foi substancialmente aumentada em tecidos de tumor quando comparados com tecidos que não de tumor (Tabela 1). Como mostrado na Tabela 2, a expressão CK2α nuclear teve uma correlação estatisticamente significativa com a profundidade da invasão (

P

= 0,008), estado nodal (

P Art 0,001), AJCC estadiamento (

P Art 0,001), grau de diferenciação (

P

= 0,011) e invasão perineural (

P

= 0,041). As fotomicrografias representativas de expressões CK2α nucleares para diferentes parâmetros foram apresentados na Figura 2. Não houve associação significativa entre a expressão nuclear CK2α e idade, sexo e invasão vascular.

expressão CK2α Nuclear em tecidos não-tumorais e tumores , analisados ​​por imuno-histoquímica, foi mostrado no painel a e B, respectivamente. Ampliação: 400 ×. expressão Painel C. Nuclear CK2α em cada quatro não tumorais de pares /tumor foi analisada por Western blot

Ampliação:.. 400 ×

A superexpressão de CK2α nuclear como um marcador de prognóstico independente para CRC

As correlações de resultados clínicos com expressão CK2α nuclear são apresentados na Figura 3. sobrevida global inferior foi significativamente associada com superexpressão de CK2α nuclear (índice de marcação 40%,

P Art 0,0001). Pacientes com níveis de CK2α nuclear alta expressão tinha uma taxa de sobrevida global de dez anos de 22,2% em comparação com 72,5% para os pacientes com baixos níveis de expressão de CK2α nuclear.

Todos os testes estatísticos foram bilaterais. O nível de significância:.

P Art 0,05

A análise uni-variada de marcadores prognósticos de CRC está resumida na Tabela 3. estatuto Nodal (

P

= 0,025) e superexpressão de CK2α nuclear (

P Art 0,0001) foi correlacionada significativamente com a sobrevida global

Esta associação entre a superexpressão de CK2α nuclear e sobrevivência se manteve mesmo após o controle de outros. bem conhecido marcadores de prognóstico em análise multi-variada (Tabela 4). Na análise multivariada, a superexpressão de CK2α nuclear era prognóstico independente (taxa de risco = 4,53, 95% intervalo de confiança = 2,46-8,32,

P Art 0,0001).

Effect de derrubar de CK2α sobre o câncer de cólon proliferação celular

Para determinar o efeito da expressão CK2α on-1 DLD proliferação de células cancerígenas do cólon humano,

CK2

α gene foi derrubado por transfecção de CK2α- siRNA específico. siRNAs mexidos foram utilizados como controle. Após o tratamento específico de siRNA-CK2α, o nível de expressão de CK2α nuclear em células DLD-1 foi significativamente inibida (Figura 4A). No entanto, mexidos siRNA não resultou em nenhuma inibição significativa (Figura 4A). Contamos o número de colónias de células DLD-1 siRNA-tratados e não-tratados. As colónias de células específicas-CK2α tratadas com siRNA eram significativamente menos do que as de não-tratados e mexidos células tratadas com siRNA (diminuiu para 33% (dia 8) e 57% (dia 14) de aqueles de células tratadas com un, respectivamente ) (Figura 4B). As fotomicrografias representativas foram mostrados na Figura 4C. Os resultados indicaram um papel desempenhado por CK2α na promoção da proliferação celular e é consistente com os dados clínicos descritos acima

.

expressão Painel A. Nuclear CK2α em siRNA tratadas e as células cancerosas un-tratados DLD-1 do cólon foi examinado por A análise de western blot. Painel B. Os histogramas representam os resultados do ensaio de proliferação de células com base na média de três experiências independentes. * Indica

P Art 0,001 em comparação com células DLD-1 tratadas com un. Painel C. As fotomicrografias representativas.

Discussão

nível elevado CK2α mRNA tem sido relatada em vários cancros humanos, incluindo melanoma e câncer de pulmão [32], [33]. No entanto, apesar destes estudos, os dados clínicos relacionados com a expressão específica de CK2α ao nível da proteína são escassos. Um estudo recente mostrou que a expressão da proteína CK2α elevada no cancro da próstata [30]. Para nosso conhecimento, este é o único estudo utilizando imunohistoquímica para avaliação da expressão CK2α em cancros humanos. A expressão de CK2α nuclear no CRC humano ainda é desconhecido. No presente estudo, os níveis de CK2α nuclear em tecidos colorretais de 245 pacientes com CCR expressão foram avaliados, e os resultados mostraram que a expressão CK2α nuclear foi maior em tumores colorretais tecidos do que em não-tumorais tecidos colorretais.

além disso, nossos dados mostraram acumulação nuclear CK2α no CRC, de acordo com estudo anterior realizado no câncer de próstata. A base mecanística de acumulação nuclear CK2α é actualmente incerto, mas, como uma subunidade catalítica CK2, a sua presença contínua no núcleo pode não só estar relacionado com o aumento da capacidade proliferativa das células tumorais indiferenciadas mas também à sua resistência marcada a sinais apoptóticos. O que poderia ser a conseqüência funcional da acumulação nuclear da CK2 em células cancerosas? Um estudo realizado por Scaglioni et ai. demonstraram que a proteína fosforilada CK2 leucemia promielocítica (PML, um supressor de tumor) e segmentado para degradação pelo proteassoma [34]. A perda do local de fosforilação CK2 crítica em PML resultou na estabilização da proteína, aumento da apoptose induzida pela PML. Além disso, em cancros do pulmão de células não-pequenas humano, que há uma relação inversa entre a expressão da PML e actividade CK2. Desde PML é uma proteína nuclear-associado à matriz, uma acumulação nuclear de CK2 pode ser funcionalmente relevante para inactivar as funções de tumor-supressor de PML. Em outro estudo, CK2 foi recentemente descrito como um regulador chave da NKX3.1 supressor de tumor em células de cancro da próstata LNCaP. Como PML, verificou-se que o bloqueio atividade CK2 em células LNCaP com apigenina inibidor levou a uma diminuição rápida na acumulação NKX3.1 que foi resgatado por inibição do proteosoma [35].

No presente estudo, demonstramos para a primeira vez que a superexpressão de CK2α nuclear em tecidos CRC foi estreitamente relacionado com vários parâmetros clínico-patológicas, incluindo a profundidade de invasão tumoral, metástase linfonodal e invasão perineural. Embora os mecanismos subjacentes a essas associações ainda não estão claros, várias linhas de evidência para estas correlações será discutido em baixo. Em primeiro lugar, as evidências para a associação entre a sobreexpressão de CK2 nuclear e a profundidade da invasão vem de metaloproteinases de matriz (MMPs), que têm sido associadas com a invasão de células do cancro e metástase [36]. Um estudo recente mostrou que as células de cancro da próstata humano PC-3 que sobre-expressam de membrana do tipo 1-metaloproteinase de matriz (MMP-MT1) cresceram mais rapidamente do que as células de controlo transfectadas por simulação [37]. Este resultado sugeriu que a invasão de promoção de MT1-MMP está directamente ligada à agressividade do tumor. perfil de expressão de todo o genoma de MT1-MMP-overexpressing contra células cancerosas MT1-MMP-silenciadas e uma análise posterior extracção de dados da base de dados de expressão de pré-existente de 190 tumores humanos de 14 tipos de cancro levou à identificação de 11 genes, incluindo CK2, a expressão de o que se correlacionou com firmeza e universalmente com a de MT1-MMP [38]. Em segundo lugar, usando imuno-histoquímica, a associação entre o VEGF-C e o desenvolvimento de metástase ganglionar tenha sido descrito por Y Yonemura et al [39]. Em resposta à hipóxia, aconteceu na maioria dos tumores cultivados maior do que 1 mm

3, a expressão de VEGF-C pode ser estimulado por hipoxia-inducible factor-1 (HIF-1) [40]. Foi demonstrado que os inibidores da CK2 bloqueou a activação de HIF-1, e, em seguida, a expressão de VEGF-C [41]. Finalmente, o aumento da formação de neurite demonstrado nos

in vitro

estudos anteriores sugere que a migração axonal pode ser um elemento-chave da invasão perineural. crescimento axonal é um processo complexo que requer factores de crescimento neurotróficos e moléculas de orientação axonais [42], [43]. Um estudo realizado por Arevalo et ai. mostrou que o factor de crescimento de nervo, um dos factores de crescimento neurotróficos, podem estimular o crescimento axonal através da activação de CK2 [44].

O nosso estudo demonstrou que a sobre-expressão de CK2α nuclear pode ser um marcador de prognóstico independente para CRC. Os dados clínicos que lidam com o valor prognóstico da CK2α são limitadas. Usando o perfil de expressão do gene global, o gene CK2α foi identificado como um marcador de prognóstico em pacientes com carcinoma de células escamosas do pulmão [29]. Laramas et ai. desde que a evidência de uma forte associação entre a localização nuclear de CK2α e fatores de mau prognóstico no câncer de próstata humana [30]. Além disso, estudos de Kim et al. mostraram que a sobre-expressão da proteína CK2α na leucemia foi associada com o resultado do paciente pobre [31]. Para o nosso conhecimento, não há nenhum relatório mencionar o significado prognóstico da CK2α nuclear no CRC humano. É digno de nota observar que, pela primeira vez, a sobre-expressão de CK2α nuclear pode ser um marcador de prognóstico independente para CRC. Superexpressão de CK2α nuclear é, portanto, um marcador útil para prever o resultado de pacientes com CRC que tinham uma ressecção cirúrgica do tumor. Os pacientes com CRC mostrando superexpressão de CK2α nuclear devem ser acompanhados cuidadosamente.

Materiais e Métodos

Os sujeitos do estudo

O grupo de pacientes constituídos 245 casos CRC consecutivos de 1998 a 2002 documentar fatores patológicos e clínicos e evolução clínica. Nenhum destes doentes tinham recebido quimioterapia e /ou radioterapia pré-operatória. A parte não-tumor foi feita a partir da mucosa colorrectal normal, grosseiramente longe do tumor a partir de amostras colorrectais ressecados. parâmetros clínico-patológicas de CRCs foram determinados de acordo com a classificação AJCC. A duração de follow-up foi definido como o período compreendido entre a data da operação e dia da última visita, de acordo com a ficha do paciente. O conselho de revisão institucional a Chi Mei-Medical Center aprovou o protocolo de aquisição de tecidos para a realização desse estudo. consentimento informado por escrito foi obtido de cada participante antes da aquisição de tecidos. pares de tumor /não-tumorais de tecidos colorretais foram analisadas para a expressão CK2α nuclear.

imuno análise

CK2α Nuclear expressão foi analisada por imuno-histoquímica. blocos de tecido embebidos em parafina foram seccionados a 5 ^ M e transferidas para lâminas de microscópio (Muto Pure Chemicals, Tóquio, Japão). Hepatoma foi utilizado um controlo positivo para CK2α. O controlo negativo consistiu na omissão do anticorpo primário e incubação com solução salina de tampão fosfato. Após recuperação e rehyfration antigénio, antigénio de bloqueio foi realizado utilizando Dako REAIS peroxidase Solução de Bloqueio (Dako, Carpinteria, CA) durante 5 minutos. As lâminas foram subsequentemente incubados com um anticorpo primário: policlonal anti-CK2α (StressGen Bioreagents, Victoria, Canadá) durante 30 minutos à temperatura ambiente, a uma diluição de 1:50. Detecção da coloração imuno-reactivo foi realizada pelo método do complexo biotina-avidina-peroxidase de acordo com as instruções do fabricante. Um sistema sensível Dako REAIS Detecção EnVision (Dako) foi usado como o sistema de detecção. Após incubação com diaminobenzidina durante 5-8 minutos, as secções foram contrastadas e montado para interpretação microscópica. A imunorreatividade foi independentemente marcado por dois patologistas (C-F Li e C-L fang). A percentagem de células tumorais com imunorreactividade nuclear moderado ou forte foi gravado, e pontuações do mesmo paciente foram a média para obter um índice de marcação média CK2α nuclear. O ponto de corte do índice de marcação média para definir a superexpressão CK2α nuclear foi reatividade nuclear em células 40% (valor médio). coleta de dados clínicos e análise imuno-histoquímica foram realizados de forma independente um do outro, em um estudo cego-investigador.

extração de RNA e síntese de cDNA

De acordo com as instruções do fabricante, o RNA total de 10 tumor e não -tumor pares de tecidos colorrectais foi isolado usando um kit de extracção de ARN (Sigma, St. Louis, MO). qualidade RNA foi analisado usando Agilant 2100 Bioanalyzer. Os valores RIN de todas as 20 amostras estavam acima de 7. Síntese de ADNc foi realizada como descrito no nosso estudo anterior [45]. ADNc sintetizado foi armazenado a -20 ° C até à sua utilização.

iniciadores e sondas

Gene Taqman Os ensaios de expressão, incluindo os iniciadores e as sondas de CK2α e β-actina, um controlo interno, foram adquiridos de Applied Biosystems. Os números de ensaio da CK2α e β-actina foram Hs00751002_s1, e Hs99999903_m1, respectivamente.

Quantitative real-time PCR

Os níveis de expressão de genes alvo foram medidos usando-quantitativa por PCR em tempo real o sistema ABI Prism 7300 Sequence Detection (Applied Biosystems), como descrito no nosso estudo anterior [45]. ciclo limiar (

C

t

) é o número do ciclo fraccionai a que a fluorescência gerada pela clivagem da sonda exceder um nível fixo acima da linha de base. Para um limiar escolhido, um menor número inicial de cópia resulta em uma maior

C

t

valor. A quantidade de mRNA CK2α em tecidos tumorais ou não-tumorais, padronizado contra a quantidade de mRNA β-actina, foi expressa como Δ

C

tumor

ou Δ

não-tumor

C

=

t

(CK2α)

C -.

t

(β-actina)

cultura celular

C e siRNA tratamento

linha de células de cancro do cólon humano (DLD-1) foi obtido a partir do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Indústria de Alimentos (Hsinchu, Taiwan). As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com soro a 10% inactivado pelo calor fetal bovino (Moregate Biotech, Bulimba Queensland, Austrália), 100 unidades /ml de penicilina G, 100 ug /ml de sulfato de estreptomicina, e 250 ng ml de anfotericina B /(todo da Sigma). As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2. Para o tratamento de siARN, as células foram transfectadas com 30 nM de ARNsi específicos de CK2α ou mexidos (Applied Biosystems), utilizando siPORT NeoFX Transfecção agente. 48 horas após a transfecção, as proteínas nucleares foram extraídas, e, em seguida, por Western blot foi realizada para avaliar o efeito do tratamento com siARN.

preparação de proteína nuclear

proteínas nucleares celulares e teciduais totais foram extraídos com NE -per nuclear e citoplasmática Extracção Reagentes (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram armazenadas a -80 ° C até serem usadas. A concentração de proteína foi determinada utilizando um Kit BCA Protein Assay (Pierce Biotechnology) com albumina de soro bovino como padrão.

imunotransferência

amostras de proteína desnaturada foram sujeitos a 10% de SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose. manchas bloqueadas foram incubadas à temperatura ambiente durante a noite com anticorpo policlonal anti-CK2α (1:161 diluição). β-actina (Sigma, diluição 1:8000) foi usada como um controlo interno para a carga de proteína igual. As membranas foram incubadas adicionalmente com anticorpos secundários conjugados com peroxidase (Sigma) durante 1 hora à temperatura ambiente. reagentes de quimioluminescência aumentada (Pierce Biotechnology) foram usadas para visualizar as proteínas-alvo, que foram, em seguida, semi-quantitativamente medidos por densitometria. Todas as experiências foram realizadas três vezes, independentemente.

proliferação celular ensaio

Após o tratamento de siARN, as células transfectadas foram cultivadas num banho a 37 ° C, 5% de CO

2 incubadora durante 4 , 8 e 14 dias. colónias individuais ( 50 células /colónia) foram fixados, corados usando uma solução de 1% de violeta de cristal em metanol durante 30 minutos, e contadas. O ensaio foi realizado três vezes, independentemente. Para cada experiência, foram utilizados dois poços por condição. As barras de erro são SD

A análise estatística

As diferenças na expressão CK2α nuclear entre tecidos tumorais e não tumorais no mesmo paciente e na proliferação celular foram analisados ​​usando um emparelhado

t

teste. Alguns parâmetros clinicopatológicas foram examinados neste estudo. Eles foram idade, sexo, profundidade de invasão, estado nodal, estadiamento, grau de diferenciação, invasão vascular e perineural. A correlação entre a expressão CK2α nuclear e os parâmetros clínico-patológicas foi examinado com χ

2 de teste. Todos os endpoints tempo de colocação no evento de acordo com vários parâmetros clínico-patológicas foram plotados pelo método de Kaplan-Meier eo significado foi então determinada por um teste de log-rank uni-variada. Em princípio, esses parâmetros significativos na análise uni-variada (

P

≤0.05) foram inseridos em multi-variada modelo de regressão Cox para determinar a taxa de risco ea independência do impacto prognóstico de uma forma para trás passo a passo. Todos os dados foram analisados ​​utilizando o software SPSS versão 14 (SPSS, Chicago, IL). A

valor P

de 0,05 foi considerado significativo

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer Kuo-Shan Wen por sua ajuda com imuno-histoquímica.. Os autores também gostaria de agradecer Wen-Chun Chen por sua assistência com coleta de dados clínicos.