Abstract
O cancro do cólon é a segunda causa mais comum de mortalidade por câncer no mundo ocidental com metástases comumente presente em o momento do diagnóstico. O rastreio para a propagação e comportamento metastático num modelo de cancro do cólon quimérico rato-novela, impulsionado pela p53 mutante e β-catenina, levou à identificação de um único adenocarcinoma, invasivo. Comparação do genoma deste tumor, CB42, com genomas de não-propagação de tumores por arrayCGH e sequenciação revelou um fragmento amplificado no cromossoma contendo cinco CDK6 e CDK14, e uma mutação KRAS, respectivamente. Um único agente de molécula pequena inibição quer CDK6 ou MEK, uma quinase a jusante de KRAS, conduziu à inibição do crescimento do tumor in vivo, enquanto que a terapia de combinação, não só conduziu a uma regressão dos tumores subcutâneos, mas também próximo a inibição completa de metástases do pulmão; Assim, a análise genómica deste tumor levou a um tratamento eficaz, individualizado
citação:. Y Zhou, Rideout WM III, Bressel A, Yalavarthi S, Zi t, Potz D, et al. (2014) espontâneas Genomic Alterações em um modelo quimérico de câncer colorretal Ativar Metástase e guia eficaz Combinatória Therapy. PLoS ONE 9 (8): e105886. doi: 10.1371 /journal.pone.0105886
editor: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 09 de abril de 2014; Aceito: 24 de julho de 2014; Publicação: 27 de agosto de 2014
Direitos de autor: © 2014 Zhou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi inteiramente financiado pela AVEO Pharmaceuticals. AVEO Pharmaceuticals é /era o empregador de todos os autores, exceto para Marcus Bösenberg. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Este trabalho foi inteiramente financiado pela AVEO Pharmaceuticals Inc. Marcus Bösenberg foi um consultor pago para AVEO. Todos os outros autores são ou funcionários atuais ou anteriores do AVEO Pharmaceuticals. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
O câncer colorretal (CRC) é um dos quatro tipos de tumores mais comuns e letais, causando aproximadamente 53.000 mortes por ano nos os EUA sozinhos. Felizmente, o progresso está sendo feito contra o CRC como a incidência e mortalidade por este tipo de tumor têm vindo a diminuir ao longo da última década em cerca de 2-3% ao ano. Apesar deste progresso geral, a taxa média de sobrevivência de cinco anos para o estágio 4 de câncer colorretal metastático ainda é um sombrio 12,5% [1]. Muitas alterações genéticas que contribuem para CRC foram identificadas incluindo mutações que inactivam genes supressores de tumores (por exemplo, p53 e APC mutado em 52% e 76% dos tumores, respectivamente) ou activar oncogenes (por exemplo, KRAS e BRAF mutado em 42% e 10% de tumores, respectivamente) [2], [3]. Pacientes com estágio 3 ou 4 CRC precisam de tratamentos mais eficazes e menos tóxicos para melhorar a sua sobrevivência e qualidade de vida. Como agentes terapêuticos mais orientados estiverem disponíveis, os ensaios clínicos revelaram que muitos deles são apenas moderadamente eficaz, quando usado como um agente único. Em contraste, alguns mostram resultados significativamente melhores quando combinados com agentes quimioterapêuticos existentes ou outros medicamentos específicos [4], [5]. De modo a pesquisar com mais precisão combinações de medicamentos para aqueles que irá fornecer o maior benefício, são necessários modelos precisos e preditivos. modelos de ratos geneticamente modificadas de CRC foram desenvolvidos ao longo das últimas duas décadas principalmente pela inativação de genes supressores de tumores (por exemplo APC1638N, [6] para revisão ver [7]). Existentes modelos pré-clínicos de CRC queda principalmente em quatro categorias: estabelecido xenoenxertos de linhas celulares, paciente derivado xenotransplantes (PDX) germinativas engenharia genética mouse modelos (GEMMs) e Cre-Lox GEMMs condicionais. Cada um dos sistemas de modelo tem o seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens com xenoenxertos da linha de células a ser a mais fácil de realizar, mas mais distantemente relacionado com o tumor primário no hospedeiro, enquanto que na outra extremidade do espectro Cre-Lox activado GEMMs surgir no tecido em um hospedeiro imunocompetente desejado.
A coleção recente e propagação de tumores diretamente dos pacientes tem produzido novos recursos PDX que mantêm uma maior heterogeneidade do tumor, tanto histologicamente e geneticamente [8]. No entanto, o estabelecimento de tumores humanos em ratinhos imunocomprometidos exerce pressão seletiva tanto na adaptação a um host do mouse e, geralmente, a um site ectópica (isto é, subcutânea). Este inerentemente constrange o conjunto de interacções que normalmente ocorrem entre o tumor, o estroma e o sistema hematopoiético. Em vários estudos a eficiência de propagação de material derivado de paciente em ratinhos imunocomprometidos foi misturado, com relatos de até 77% dos tumores do cólon humanos muito avançada que se propagam em ratinhos nus [9].
GEMMS superar muitos dos limitações de xenoenxertos. GEMMs atuais de câncer de cólon desenvolvem tumores em um curto período de tempo impulsionado por mutações características em oncogenes cruciais e genes supressores de tumores (para revisão ver [7]). Alguns modelos de ratos existentes de câncer de cólon, que empregam mutações RAS relevantes, forneceram uma visão sobre as respostas de drogas potenciais [10]. Nossa abordagem para GEMMs criando envolve um não-germinal, sistema de quimera de rato com base com as quais geraram modelos complexos de câncer, incluindo modelos de pulmão e de mama [11], [12]. A nossa abordagem de células estaminais embrionárias permite a rápida geração de novos modelos indutíveis doxiciclina com várias modificações genéticas sem ter que atravessar produzir os alelos modificados juntos. Os tumores dos estes sistemas modelo foram propagadas na forma de aloenxertos e usado para gerar arquivos de material tumoral, permitindo assim a análise da resposta à droga em perspectiva e a correlação de que a resposta ao tumor [12], [13]. Caracterização molecular por microarray e matriz hibridização genômica comparativa (aCGH) analisa dessas bibliotecas propagadas de tumores demonstraram que as mutações que promovem tumorais adicional havia ocorrido nas linhas de tumor que afeta suas taxas de crescimento, metástase, e a resposta à terapêutica [12], [13] , [14]. Enquanto uma série de telas de expressão gênica biomarcador estão se tornando cada vez mais útil no direcionamento da terapia em ensaios clínicos em curso (por exemplo, 21, 50, 70 candidatos, respectivamente, para Oncotype Dx, PAM50 e MammaPrint [15]) e ao lado sequenciamento geração de genes do câncer conhecido (n = 236) está começando a dirigir a seleção benéfico da terapia para uma ampla gama de tipos de tumor [16], o aumento da acessibilidade dos genoma ampla triagem de expressão, número do exemplar, e a sequência pode fornecer uma abordagem imparcial para determinar a terapia eficaz do cancro.
neste artigo descrevemos o processo de fazer um modelo baseado em células ES de cancro do cólon impulsionado por mutação p53 e inducible activado β-catenina (
CTNNB1
).
CTNNB1
mutações são encontrados em 5% do CRC humana com e sem mutações correspondente no
APC
[2] especialmente em câncer colorretal hereditário sem polipose (HNPCC) pacientes, onde a frequência de
CTNNB1
aumentos de mutação [17]. Os tumores que surgem a partir desses modelos baseados em células ES contêm antecedentes genéticos idênticos e mutações motorista iniciais; no entanto, eles tendem a adquirir mutações de novo e copiar variações no número durante tumorigênese que criam diversidade limitada que pode influenciar a resposta ao tratamento. A β-catenina (ΔN131) -driven modelo que apresentamos aqui gerado novos insights sobre alterações genéticas necessárias para a propagação do tumor do rato, metástase e resposta à droga.
Resultados
célula ES modelo de quimera cólon base
Nós relatado anteriormente uma nova abordagem para o desenvolvimento de câncer de modelagem em ratos usando quimeras de células ES. Em comparação com os modelos transgénicos de linha germinal convencionais, uma das principais vantagens da abordagem quimérica é que ela permite que as células que albergam mutações oncogénicas de coexistir com células que são geneticamente tipo selvagem vizinho, melhor que imita o processo oncogénico em cancros humanos. Supressão da APC, um supressor de tumor conhecido, é um evento chave na progressão do cancro do cólon. A inactivação dos resultados da APC em níveis β-catenina nuclear elevadas, o que impede a diferenciação terminal e promove a proliferação. Para gerar modelo de cólon linhas de células ES, começamos com uma +/- linha INK4a (H12C23) e sequencialmente modificado os dois alelos p53: o primeiro alelo p53 foi condicionada pela inserção de sítios loxP flanqueando exons 2 a 7 que muda de um alelo funcional para um alelo nulo mediante recombinação Cre mediada; o segundo alelo p53 tem uma cassete LOX-LOX-paragem inserido no intrão 1 combinada com a mutação R172H no exão 5, o que resulta na expressão de uma versão oncogénica de p53 após a remoção mediada por Cre da cassete de paragem. Em seguida, um GAPDH-LOX-parar-LOX-rtTA-IRES-luciferase cassete (o activador /cassete de marcador) foi construído, que, quando activados por Cre, expressa rtTA (tetraciclina reversa trans-activador) e luciferase simultaneamente. Finalmente, as células ES foram co-transfectadas com constructos de GAPDH-LOX-stop-LOX-rtTA-IRES-luciferase, Vilina-Cre e TetO-β-catenina (ΔN131), uma versão truncada de β-catenina que carece da região que se liga o complexo APC /axina e constitutivamente acumula-se no núcleo. Em células epiteliais gastrointestinais não de quimeras resultantes, o promotor Villin vai ficar em silêncio e, assim, Cre não vai ser expressa. Neste caso, um alelo de tipo selvagem p53 permanece e a cassete rtTA activador é inactiva (Fig. 1 de células ES). Em células alvo no epitélio intestinal, onde promotor Vilina dirige a expressão de Cre, apenas a p53 mutante vai ser expressa e a cassete do activador irá expressar rtTA e luciferase e, por conseguinte, β-catenina (ΔN131) expressão pode ser especificamente induzida nessas células de doxiciclina (Fig . 1 GI célula e GI + dox).
A). Em células ES: foram inseridos 3 cassetes de transgênicos: Villin-Cre, GAPDH-LOX-stop-LOX-rtTA-IRES-luciferase, e TetO- β-CateninΔN131; todos os três permanecer em silêncio em células ES. Além disso, um alelo p53 foi expressa e floxed tipo selvagem p53 em células ES e o outro alelo foi orientada com LOX-stop-LOX e mutação pontual R172H, o que é funcionalmente nulo em células ES. B). No epitélio gastrointestinal, expressão de Cre leva à supressão das duas cassetes LOX-paragem-LOX, bem como o alelo p53 floxed. expressão da p53 irá mudar de tipo selvagem para a forma mutante, e expressão de rtTA e luciferase liga. C). na presença de doxiciclina, rtTA vai ligar ao promotor TetO e activar a transcrição de β-CateninΔN131.
Vinte clones positivos com ES para todos os cinco elementos genéticos foram injectados em blastocistos para gerar quimeras, que foram dadas 2500 alimento ppm doxiciclina após o desmame. Após a indução por 2-4 semanas, para cada linha de ES, 2-3 quimeras com 80% quimerismo pela cor da pelagem foram sacrificados e os tecidos foram recolhidos a partir de 3 diferentes regiões do trato intestinal. Analisou-se a expressão de Cre, rtTA, e β-catenina por qRT-PCR e recombinação dos alelos p53 e a cassete de activador por PCR. Estas análises identificou 5 linhas ES geneticamente e funcionalmente validados (91A2, 91C5, 91D3, 91F5 e 91F7) para posterior estudo (dados não mostrados).
indução β-catenina no epitélio do cólon leva a adenocarcinomas invasivos
cento e vinte e nove ratos quiméricos foram gerados usando o modelo de 5 cólon validado linhas de células ES e alimentados com comida doxiciclina após o desmame. Após 3 meses de indução, nós analisamos de sangue oculto em uma base mensal e ratos positiva por 2 meses consecutivos foram monitorados diariamente e sacrificados quando foi observada perda de peso. O trato intestinal foi dissecado longitudinalmente, lavadas em PBS para remover as fezes, então achatada numa toalha de papel e digitalizados sob um estereoscópio para pólipos e tumores.
Quarenta e quatro por cento dos ratos quiméricos induzidas com doxiciclina desenvolveram lesões neoplásicas intestinais dentro de 3-17 meses com uma latência do tumor mediano de 11 meses (Fig. 2B, e a Tabela 1). imagiologia bioluminescente demonstrou aumento na actividade de luciferase a região abdominal inferior de ratinhos portadores de tumor (Fig. 2a). Nesses camundongos, foram identificados, em média, 2-3 lesões neoplásicas por rato; análise histológica confirmou 60% das lesões como pólipos, 25% como adenomas e 15% como adenocarcinomas (Fig. 2C). Curiosamente, as lesões precoces (pólipos) e adenomas foram encontrados igualmente, tanto no tracto intestinal superior e inferior ao passo que a grande maioria (85%) de lesões avançadas foram encontrados no cólon. Os adenocarcinomas variou 2-8 mm de diâmetro e assemelhava-se os tumores do cólon humanos histologicamente. Invasão na camada sub-mucosa foi observada em 70% dos adenocarcinomas (Fig. 2C). Estes resultados demonstraram que a energia nuclear β-catenina, em combinação com mutações em p53, foi suficiente para dirigir o desenvolvimento do tumor maligno no tracto GI.
A). a imagem de bioluminescência dos três ratos quiméricos após três meses de indução doxiciclina. sinais luminescentes foram detectados na região abdominal inferior em dois ratinhos. B). curva de Kaplan-Meyer, mostrando a latência do desenvolvimento do tumor do cólon em ratinhos quiméricos. C). Comparação histológica das vias normais gastrointestinal, pólipos benignos, e adenocarcinoma de ratos quiméricos. D). coloração colorimétrico químico para mucina e coloração imuno-histoquímica para β-catenina, Ki-67 e ciclina D1 em condições normais do epitélio GI, pólipos e adenocarcinoma.
tumores de cólon Caracterização molecular de β-catenina impulsionados
Análise por imuno-histoquímica de proteínas candidatas nos tumores primários β-catenina conduzidos indicaram a activação de vários mecanismos conhecidos para desempenhar um papel na tumorigénese do cólon. As formas normais de cólon epitélio bem organizada unidades de cripta-vilosidade (Fig. 2C), com células progenitoras de divisão, localizado nas células que não se dividem diferenciadas região cripta e na vilosidade como evidenciado pela restrição de Ki-67 e Ciclina D1 células positivas para a cripta. Enquanto membranosa β-catenina é detectado em todas as células epiteliais, nuclear β-catenina é encontrado apenas em 20-30% das células dentro da cripta (Fig. 2D). Em contraste, a estrutura normal de cripta-vilosidade foi perdido em ambos os pólipos e adenocarcinomas invasivos. coloração de p-catenina não foi restringida à membrana; em vez de 80-90% das células exibiram positividade nuclear e citoplasmática β-catenina. 60-80% das células de tumores mostraram forte coloração de Ki-67 e positividade de ciclina D1, demonstrando que as células tumorais foram proliferando activamente. Além disso, embora forte coloração positiva para mucina epitelial foi observada em 20-40% das células em todos os pólipos benignos estudadas, de acordo com a sua origem epitelial do cólon, mucina não foi detectado nos adenocarcinomas examinados (Fig. 2D). Uma fração dos adenocarcinomas também mostrou aumento da expressão de EGFR (dados não mostrados).
propagação série de tumores do cólon
O longa latência deste modelo, em conjunto com o desenvolvimento do tumor assíncrona, apresentou um obstáculo para efetivamente realizar estudos terapêuticos pré-clínicos de uma forma estatisticamente significativa. Para superar esse problema, exploramos maneiras de expandir o material tumor coletadas a partir deste modelo por meio de série na propagação vivo. Até agora, os relatórios de propagação do tumor do rato do cólon têm estado ausentes da literatura. Testamos a propagação in vivo em 3 diferentes cepas de ratos imunocomprometidos, (SCID, NOD-SCID e Nudez) em 3 locais diferentes (espaço subcutâneo, cápsula renal, e do espaço sub-mucosa cecal) (ver Tabela S1 para mais detalhes) de qualquer tumor fragmentos ou suspensões de células individuais incorporados em Matrigel. Propagação de material tumoral de 82 tumores foi testada num total de 107 locais. Dos tumores testados, apenas um estabelecida com sucesso uma linha de tumor propagadas, CB42, que surgiu no ceco de um rato quimérico a partir da linha ES 91C5 (Tabela 2 e Tabela S1).
CB42 cresceu robustamente tanto na cápsula do rim e o espaço subcutâneo; por exemplo, quando 10
5 células foram injectados por local, os tumores se tornaram visíveis em 5-7 dias e atingiu limites humano no mais 2 semanas. A análise histológica revelou que a arquitectura de tumores propagadas tanto na cápsula renal ou no espaço subcutâneo foi semelhante àquela do tumor primário (Fig. 3A, B e dados não mostrados). Os tumores propagados retida mais do que 80% de células que exibem expressão β-catenina citoplasmática e nuclear (Fig. 3C) e mantiveram as suas características epiteliais como evidenciado por coloração IHC homogénea para citoqueratina panela (Fig. 3D) e E-caderina (dados não mostrados ). coloração imuno-histoquímica para o HGF foi positiva em 70-80% destas células tumorais, e coloração para fosfo-MET MET revelou elevada expressão e activação, mas curiosamente não positividade EGFR (Fig. 3C-F e dados não mostrados), como comum em humanos CRC [18] e outros tumores primários do modelo B-catenina cólon ES-quimera
a) Histologia (H . e coloração) do tumor primário CB42. B). A histologia (H E) de CB42 após propagação subcutânea (CB42P1). C). coloração imuno-histoquímica para a β-catenina. D). coloração imuno-histoquímica para pan Cytokeratin. E). coloração imuno-histoquímica para HGF. F). coloração imuno-histoquímica de fosfo-Met.
linha de Tumor CB42 metástase para o fígado e pulmão
A metástase apresenta o desafio terapêutico real no CRC. Para validar o nosso modelo CB42 estudamos o seu potencial metastático. Primeiramente foi realizada ensaios de semeadura 2: sementeira de células tumorais no pulmão através de injecção intravenosa ou no fígado através de injecção interna do baço seguido de esplenectomia. As taxas de sucesso para ambos os ensaios de nucleação foram elevadas: no ensaio de pulmão, 10 dos 10 ratinhos desenvolveram tumores dentro de 4-6 semanas após a injecção, resultando em aumento dos pesos médios do pulmão por estes ratos a 1,5 g (em comparação com 0,2 g de pulmão normal) ; no ensaio de fígado, 7 de entre 10 ratinhos desenvolveu nódulos de tumor visíveis no fígado 5-8 semanas após a injecção. Uma segunda série de experiências de metástases recapitulado mais de perto o processo de metástase do cancro em pacientes humanos. As células tumorais foram primeiro injectados no espaço subcutâneo. Uma vez que os tumores inoculados atingiu 500-800 mm
3 em tamanho, nós extirpado cirurgicamente e monitorados os ratos de perto para a aparência geral saudável e perda de peso, uma indicação de metástase para órgãos internos. Oito dos 10 camundongos mostraram nenhum sinal de novo crescimento do tumor subcutâneo e 2 tiveram apenas um pequeno nódulo ( 200 mm
3) no local da cirurgia. No entanto, todos os 10 ratinhos ficaram doentes dentro de 3-5 semanas após a cirurgia. A necropsia revelou metástase para o pulmão em todos os 10 camundongos e distante metástase linfonodal em 6 dos 10 camundongos. exame histológico cuidadosa de outros órgãos internos incluindo o cérebro, fígado, baço, e rim não revelaram quaisquer nódulos tumorais (dados não apresentados). As metástases pulmonares e de nódulos linfáticos se assemelhava ao histologicamente tumor primário, e foram positivas para citoqueratina coloração pan (Fig. 4). Não era claro, no entanto, com base nesta experiência, se a cirurgia foi causalmente relacionados com a disseminação de células tumorais para órgãos distantes, ou apenas permitiu que os tumores disseminados mais tempo para crescer no órgão distante, prolongando a vida destes ratinhos. Para distinguir estas duas possibilidades, repetiu-se a experiência sem a remoção cirúrgica do tumor subcutâneo. Os ratinhos foram sacrificados quando os tumores subcutâneos atingiu limites humanas e cuidadosamente examinados para sinais de metástases. nódulos esbranquiçados pequenas foram encontradas nos pulmões de ratinhos 5/10, e dois destes ratinhos tinha inchado gânglios linfáticos auxiliares perto do pescoço. Esta experiência demonstrou que CB42 era competente para metástase espontânea
Lung metástase H E em 5X (A) e 20X (C) ampliação da objetiva; metástase ganglionar H E em 5X (B) e 20X (D) ampliação da objetiva; imunohistoquímica pan-citoqueratina de pulmão (E) e linfonodo (F) metástases.
alterações espontâneas no número de cópias do gene em CB42
Desde CB42 foi único entre os nossos dois pontos impulsionado β-catenina tumores em sua capacidade de propagar e metástase, foi realizada uma série de ensaios genômicos imparciais incluindo hibridação vestiu genômica comparativa (aCGH) e sequenciamento para identificar alterações genômicas espontâneas que se correlacionaram com propagação e metástase. O ADN genómico isolado a partir de CB42 primária e subcutânea, seriadamente propagados (passagem 3, rotulados como CB42P3) amostras de tumores juntamente com ADN a partir de 7 outros tumores primários que não se propagam foram escolhidos para comparação por aCGH. A análise dos dados revelou múltiplas aCGH amplicões que estavam presentes apenas no subcutaneamente propagadas tumores CB42 (CB42P3), mas não do tumor primário CB42, nem qualquer um dos outros tumores de cólon primários (Fig. 5A).
A ). perfil aCGH de CB42 tumor primário e passagem 3 propagada tumor. Um fragmento amplificado 3,5 Mb no cromossoma 5 foi detectada apenas no tumor propagadas. Sondas para Cdk6 foram coloridas em amarelo e sondas para Cdk14 foram coloridos em azul. B). A análise de RT-PCR para a expressão de genes de 7 no cromossoma 5 do amplicon. Os valores de expressão relativos de tumores CB42P4 (n = 4) foram normalizados para os de epitélio cecal normal (n = 4). C). A análise Western Blot para níveis de CDK4 e CDK6 em CB42 e 4 linhas de células de cancro do cólon humanos. D). Frequência de amplificação CDK6 e CDK14 em amostras cancerosas humanas de 13 tipos de tecidos. Os dados foram obtidos a partir do site CBio.
O amplicon mais proeminente era uma região 3,5 Mbp no cromossomo 5 entre Cdk6 e Steap1 contendo mais de 25 genes conhecidos. Foram examinados por qRT-PCR da expressão de genes candidatos 7 dentro do fragmento amplificado e descobriu que 3 dos 7 genes foram sobre-expressos de forma significativa em comparação com o epitélio do tracto GI normal: Cdk6, Cdk14 (Pftk1) e Fzd1 (Fig 5B.). A análise de Western blot de CB42 e várias linhas de xenoenxerto de tumor do cólon humano confirmou elevada expressão de CDK6 em CB42 e SW620 e CDK6 detectável em HCT116 e HCC2998 indicando que a activação de CDK6 pode ser vantajoso para xenoenxertos de tumores humanos (Fig. 5C). A análise da base de dados Cancer Genome Atlas (TCGA) encontrada evidência para a amplificação da região sintênica no genoma humano e revelou que, enquanto a amplificação da região era raro na CRC humano, variou-se a 11% dos tumores gástricos (Fig. 5D) .
As mutações identificadas por sequenciação do genoma
Além de copiar mudanças de números, que examinaram o DNA de tumores CB42P3 propagadas para mudanças de mutação por genoma inteiro, exome, e seqüenciamento RNA que consistentemente identificados 9 mutações no regiões de exões (Tabela 3). Uma das mutações causou uma mudança de glicina para cisteína na posição de codão 12 do gene KRAS. Subsequente piro-sequenciação de ADN de ambas CB42 primário e propagadas, bem como 10 outros tumores do cólon primário confirmou a mutação KRAS apenas em CB42 propagadas, mas não encontraram mutações KRAS em qualquer das outras amostras, sugerindo que a activação de KRAS não foi necessária para a iniciação do tumor de cólon primário no modelo CRC, mas foi necessária para o crescimento maligno do tumor durante a propagação e metástase.
crescimento e metástase de CB42 é TEM /HGF via independente
Uma vez que a expressão TEM e activação foram elevados em propagadas CB42 (Fig. 3F) e o papel de MET na invasão e metástase é bem suportado na literatura [19], [20], [21], testámos se a via de MET pode desempenhar um papel importante na proliferação de CB42 e metástase. Para testar essa hipótese, realizamos uma série de 3 experimentos. No primeiro experimento, nós tratamos camundongos implantados com tumores subcutâneos CB42 com crizotinib (50 mg /kg po qd), uma pequena molécula inibidora do TEM e ALK. Surpreendentemente, apesar do elevado nível de expressão de MET e a activação, o tratamento de CB42 com crizotinibe não teve efeito sobre o crescimento do tumor (TGI = 0%, A Fig. 6A). No segundo experimento, estudamos se crizotinib poderia inibir CB42 metástase. As células tumorais foram injectadas subcutaneamente CB42 e os tumores primários foram cirurgicamente removidos após 14 dias, quando o tamanho médio do tumor atingiu 500 mm
3. Estes ratos foram em cohorted um grupo de veículo (n = 10) e um grupo de tratamento (n = 10), e o tratamento começou no segundo dia após cirurgia. Ratos em ambos os grupos começaram a ficar doente 2-3 semanas após a cirurgia. Quando eles foram sacrificados, as metástases pulmonares foram encontrados em 9/9 ratinhos no grupo de veículo e 10/10 ratinhos no grupo tratado crizotinibe, enquanto metástases linfáticas foi observada em 2 murganhos de cada grupo. Não foi observada diferença significativa no número ou tamanho das metástases entre os grupos de tratamento, sugerindo que a inibição do MET não influenciou o crescimento metastático após o estabelecimento de tumores metastáticos distantes.
A). crizotinib inibidor TEM não inibiu o crescimento do tumor CB42. B). CDK4 /6 PD0332991 inibidor do crescimento do tumor significativamente inibida CB42 (*** P 0,001). C). 2 PD0325901 inibidor de crescimento MEK1 /completamente bloqueada tumor CB42 (*** P 0,001). D). Combinação de CDK4 /6 e /inibidor 2 induzida CB 42 regressão do tumor MEK1 (**** P 0,0001). E). Os volumes dos tumores subcutâneos dos três braços de tratamento no final do estudo. A combinação é significativamente mais potente do que a CDK4 /6 inibidor sozinho (**** P 0,0001), ou o inibidor de MEK sozinho (*** P 0,001). F). O exame macroscópico dos lobos pulmonares para nódulos metastáticos revelou que ambos CDK4 /6 inibidor e MEK inibidor da metástase inibiu significativamente CB42 pulmão (* P 0,05), mas a combinação foi significativamente mais eficaz do que qualquer agente isolado (**** P 0,0001) e metástase pulmonar quase completamente eliminado.
no terceiro experimento, testamos se a inibição MET poderia impedir a disseminação de células tumorais de locais pequenos tumores primários. Nesta experiência, o tratamento com veículo ou crizotinibe iniciada dois dias após a injecção subcutânea de células CB42 em ratinhos receptores. Os tumores subcutâneos foram removidos cirurgicamente duas semanas mais tarde e a dosagem continuou até os ratos ficaram doentes. metástases de pulmão foram observados em todos os ratinhos, independentemente de terem recebido crizotinibe ou veículo. Com base nestes experimentos, concluiu-se que o TEM não foi necessário para o crescimento do tumor CB42 e metástase.
inibição significativa do crescimento do tumor subcutâneo e metastático por /6 ou MEK inibição CDK4
Desde propagada CB42 teve uma amplificação genómica de CDK6 e forte expressão celular (ver acima), testou-se um composto, PD0332991, que inibe tanto a CDK4 e CDK6 [22]. Apesar da confirmação por transferência de Western que apresentaram forte CDK6 e expressão CDK4 mais fraca em CB42 (Fig. 5C), um dia 3 no ensaio de proliferação in vitro mostraram que PD0332991 não inibiu a proliferação de uma linha celular CB42-derivada, mesmo na dose mais elevada (10 uM) (dados não mostrados). Em contraste, o tratamento de ratinhos implantados com tumores subcutâneos CB42 com PD0332991 (125 mg /kg, po QD) crescimento inibiu fortemente a subcutânea do tumor (TGI-75%, p 0,00005, Figura 6B.) E a metástase pulmonar reduzida. No final da experiência, apenas cinco dos 15 ratos tratados com PD0332991 tinha nódulos visíveis no tecido pulmonar, enquanto todos os 15 ratinhos nos grupos de veículo tinham metástases pulmonares visíveis. Havia, em média, nódulos pulmonares 5 por rato no grupo PD0332991 versus 18,3 no grupo de veículo (p = 0,00002). Em geral estes resultados sugerem que a superexpressão CDK6 permite que os tumores do rato GI para crescer fora do ambiente de sub-mucosa do cólon e que a ativação de CDK6 pode contribuir para tumores gastrointestinais sobreviver e prosperar em um cenário metastático.
Desde CB42 tinha também adquiriu uma activação de mutação e literatura Kras sugeriu que os tumores KRAS mutante foram sensíveis a inibidores da MEK [23], a PD0325901 inibidor MEK foi testado quanto à sua capacidade para inibir o crescimento de CB42 in vitro e in vivo. blocos de inibição de MEK de sinalização a jusante de KRAS. In vitro, PD0325901 potentemente bloqueado ERK1 /2 em células de sinalização CB42 (dados não mostrados). In vivo, uma dose única de PD0325901, quer a 5 mg /kg, ou 15 mg /kg, resultou em inibição completa de ERK1 fosforilação 2/4 horas após a dosagem (dados não apresentados). O tratamento com PD0325901 de tumores subcutâneos em ratos CB42, a 5 mg /kg ou 15 mg /kg, levar a perto de uma inibição completa do crescimento do tumor (93% e 96% deltaTGI, respectivamente, a Fig. 6C). A digitalização dos pulmões no final do estudo também demonstrou uma redução significativa do número e tamanho dos nódulos metastáticos nos ratos tratados vs grupo veículo. Estes dados demonstraram que o crescimento e a metástase de CB42 como um aloenxerto subcutânea também era fortemente dependente da mutação KRAS.
Regressão de CB42 por inibição combinada de sinalização KRAS /MEK e CDK4 /6
as múltiplas lesões genéticas identificadas em CB42 sugerido que o efeito terapêutico máximo pode ser conseguida com uma combinação de agentes que inibem segmentados várias das vias desreguladas. Para testar esta hipótese, foram tratados com o CB42 PD0325901 inibidor MEK (5 mg /kg) em combinação com o inibidor PD0332991 CDK4 /6 (125 mg /kg). A combinação das duas drogas foi bem tolerada e não originou perda de peso significativa ( 10%) (dados não mostrados). O tratamento combinado com PD0332991 e PD325901 fez regredir tumores dramaticamente por uma média de 35% (Fig. 6D), enquanto que os braços de tratamento único agente mostraram novamente a inibição do crescimento tumoral significativa, em comparação com os controlos. A comparação dos tamanhos dos tumores traçados individualmente entre os três grupos de tratamento no final do estudo ilustrado como regressão significativa do tumor e foi uniforme no braço de combinação (Fig. 6E). Além disso, no final do estudo, os pulmões foram dissecados e examinados para nódulos metastáticos observáveis. metástases menos foram observados em ambos os braços de tratamento único agente (para 5 nódulos /ratinho em comparação com 15 nódulos /rato no braço controle do veículo), enquanto nomeadamente, o braço de combinação em média menos de um nódulo por rato (Fig. 6F). Assim, por CB42, ambas as lesões genéticas adquiridas contribuíram para o crescimento do tumor por via subcutânea, bem como o crescimento de tumores potencial e /ou metástase metastático.
expressão forçada de CDK6 e CDK14 resultou em tumores do cólon propagatable
Embora há alguma evidência de que tanto a literatura CDK6 [24], [25] e CDK14 [26], [27] estão envolvidas em vários aspectos da tumorigénese, os seus papéis potenciais na tumorigénese cólon não são actualmente bem compreendido. Tiramos proveito da flexibilidade da abordagem ES modelo de quimera e acrescentou cassetes de expressão doxiciclina-inducible de CDK14 sozinho ou em combinação com CDK6 e Fzd1 para a linha ES modelo de cólon originais 91C5 para estabelecer novas linhas de modelos.