Abstract

A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença de inflamação crônica com aumento da susceptibilidade à colorectal Câncer. A etiologia de IBD não é clara, mas pensado para resultar de uma resposta imune adaptativa e inata desregulada à produtos microbianas num hospedeiro geneticamente susceptível. receptor Toll-like (TLR) de sinalização induzida por bactérias comensais intestinais desempenha um papel crucial na manutenção da homeostase intestinal, imunidade inata e o reforço da integridade das células epiteliais do intestino (IEC). No entanto, o papel de TLR2 no desenvolvimento de cancro colorectal não foi estudado. Nós utilizamos o modelo AOM-DSS para o cancro associado a colite colorectal (CAC) no tipo selvagem (WT) e TLR2

– /- ratos. Colons colhidas a partir de WT e TLR2

– /- ratos foram usados ​​para histopatologia, imuno-histoquímica, imunofluorescência e análise de citocinas. Camundongos deficientes em TLR2 desenvolveu-se significativamente mais e maiores tumores colorretais do que seus controles WT. Nós fornecemos evidências de que epitélio do cólon de TLR2

– /- ratos alteraram as respostas imunes e proliferação desregulada em condições de estado estacionário e durante a colite, que levam a sinais de crescimento inflamatórias e predisposição ao crescimento neoplásico acelerado. Com a maior brevidade pontos avaliados, TLR2

– /- dois pontos apresentaram um aumento significativo de focos de criptas aberrantes (ACF), resultando em tumores que se desenvolveram mais cedo e se tornou maior. Além disso, o microambiente intestinal revelaram níveis significativamente mais elevados de IL-6 e IL-17A com concomitante aumento de fosfo-STAT3 dentro ACF. Estas observações indicam que na colite, TLR2 desempenha um papel protetor contra o desenvolvimento da CAC

Citation:. Lowe EL, Crother TR, Rabizadeh S, Hu B, Wang H, Chen S, et al. (2010) Receptor Toll-Like 2 Sinalização protege camundongos de desenvolvimento do tumor em um modelo do rato do cancro da colite induzida. PLoS ONE 5 (9): e13027. doi: 10.1371 /journal.pone.0013027

editor: Kathleen A. Kelly, da Universidade da Califórnia em Los Angeles, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de junho de 2010; Aceito: 30 de agosto de 2010; Publicação: 27 de setembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Lowe et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (AI-058128 suplemento para MA) e Donna e Jesse Garber Endowment (a KSM e MA). Além disso, K.S.M. é actualmente suportada pelos Crohn e Colite Fundação da América. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a inflamação crónica e cancro estão interligados, especialmente no intestino, como pode ser visto na doença inflamatória do intestino (DII). DII é pensado resultar de um colapso na barreira epitelial, seguido de respostas inadequadas para produtos microbianos, resultando em inflamação crónica num hospedeiro geneticamente susceptível [1]. IBD está associado com um aumento do risco para o cancro colo-rectal e é agora geralmente acreditava-se que a inflamação crónica nesses doentes leva à transformação neoplásica de epitélio intestinal [2]. imunidade intestinal adequada depende de um equilíbrio entre a imunossupressão e respostas pró-inflamatórias adequadamente cronometrados com respostas inflamatórias de proteção. citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias que são produzidos durante a inflamação intestinal crónica em resposta a bactérias comensais criar um microambiente que aumenta a proliferação celular, sobrevivência celular, e angiogénese, promovendo assim a tumorigénese [3].

células epiteliais intestinais (IEC) ato como a primeira linha de defesa através da criação de uma barreira contra micróbios. Os receptores da imunidade inata que pertencem à família dos receptores Toll-like (TLR) ainda ajudar a IEC para distinguir o amigo do inimigo entre o meio complicado de micróbios. Existe um crescente corpo de evidência que apoiam um papel significativo para a sinalização dos TLR na manutenção da homeostase intestinal [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Ratos extirpadas de TLR2, TLR4, TLR9, ou a sua molécula adaptadora comum MyD88, foram mais agudamente suscetíveis a colite induzida pela química colitogen sulfato de sódio dextrano (DSS), em parte devido a respostas protectoras prejudicada e produção de prostaglandina reduzida [7], [ ,,,0],8], [9], [10], [11]. O tratamento com antibióticos piorou colite induzida por DSS em MyD88

– /- ratos e impediu o reparo epitelial, indicando sinalização geral TLR é necessária para a renovação IEC adequada. Na verdade, o tratamento com [8] TLR2 e TLR9 [12] ligantes durante a administração DSS melhorados danos cripta e acelerou a cicatrização. sinalização TLR2-comensais preserva a resistência transepitelial, promove células caliciformes secreção, e mantém a homeostase dentro IEC [8], [13], [14], [15]. Finalmente, por causa da sua tendência para inclinação para respostas TH2 [16], [17], [18], [19] e aumentar a sobrevivência de células T reguladoras [20], [21], [22], a sinalização de TLR2 pode desempenhar um importante papel na manutenção de um ambiente supressor no cólon.

Vários estudos têm implicado a sinalização dos TLR na tumorigénese intestinal. Em vários neoplasia intestinal ratinhos (min), a perda de MyD88 sinalização reduzida números e tamanhos de tumor, sugerindo que a sinalização de MyD88 contribui para o crescimento tumoral e progressão [23]. Em um modelo diferente, a incidência de tumores, multiplicidade e tamanho foram reduzidos após azoximetano (OMA) e tratamento DSS quando TLR4 foi ablated em ratos através da redução de expressão de TLR4 e sinalização no IEC [24], [25]. Além disso, a colite e tumores colo-rectais associadas com colite (CAC) espontaneamente gerada em IL10

– /- ratos podem ser melhoradas se os ratos são mantidos em condições livres de germes [26] ou simultaneamente submetidas à ablação de RST4 [27]. Tomados em conjunto, estes estudos suportam que o desenvolvimento CAC depende do reconhecimento TLR intestinal de bactérias comensais. Apesar das funções evidentes de TLR2 em IEC homeostase e melhoramento da tolerância no microambiente da lâmina própria [28], [29], nenhum estudo elucidou o papel que o TLR2 pode desempenhar na transformação de células epiteliais intestinais que levam a tumores intestinais.

Aqui demonstramos que camundongos TLR2 com deficiência de desenvolver mais e maiores tumores do cólon do que os ratos de controle WT após o tratamento AOM-DSS. o desenvolvimento do tumor do cólon melhorada é evidenciado numa primeira fase pela significativamente o aumento do número de aberrante focos de criptas (ACF) e aumento de IL-6, IL-17A, TNFa e phosphoSTAT3 expressão no microambiente intestinal de TLR2

– /- ratos, em comparação com WT ratos. Nossos resultados demonstram que TLR2 é um fator protetor importante na homeostase do epitélio intestinal e fornecer importantes insights sobre um papel previamente não reconhecido de TLR2 sinalização na CAC.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e aprovados protocolos (IACUC # 2838) do Comité animal Care e Use o Cedars-Sinai Medical Center, institucional e foram alojados em condições específicas livres de patógenos.

Animais

Helicobacter-negativa de tipo selvagem C57BL /6J e TLR2

– /-. (oN /6J ratinhos C57BL) foram obtidos a partir do Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)

a indução de tumores (Figura 1A)

cancro colorectal

colite associada (CAC) foi induzida como previamente descrito [30]. Resumidamente, 6-8 semanas de idade foram injectados por via intraperitoneal (IP) com 12,5 mg /kg de azoximetano (AOM; Sigma-Aldrich Chemical Co, St. Louis, MO). Após 5 dias, os ratinhos receberam 2,5% de dextrano sulfato de sódio (DSS; MP Biomedicals, Solon, OH, peso molecular 35,000-50,000 kDa) de água durante 5 dias seguidos por 16 dias de água de beber. Os ratinhos foram sujeitos a dois ciclos de DSS, seguindo-se um terceiro ciclo com 2% de água DSS administrado durante 4 dias, seguido por água normal durante 10 dias. No dia 61 após a injecção os ratinhos foram injectados OMA IP com 100 mg /kg de 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU; Sigma-Aldrich Chemical Co, St. Louis, MO) e sacrificaram-se 2,5 h mais tarde. Para observar as primeiras etapas de transformação em CAC, os ratinhos foram sacrificados 4 dias após a conclusão do primeiro ciclo de DSS (14 dias após a OMA). O curso clínico da doença foi monitorizado pela medição de peso corporal, a observação de sangramento retal, diarréia e fezes com sangue durante o tratamento DSS.

(A) Visão esquemática do modelo CAC. Após a injecção inicial OMA (12,5 mg /kg), DSS foi dado na água de beber (áreas em caixa), seguido de água de beber. Os ratos foram sacrificados nos dias 14 ou injecção AOM 61 post (Dia 61: n = 19 WT, n = 21 TLR2

– /- ratos). (B) a mudança de peso por cento durante o tratamento AOM-DSS. mortalidade (C) rato durante os tratamentos AOM-DSS. (D) Número de tumores colorretais por rato induzida pelo tratamento AOM-DSS no dia 61. (E) Número de tumores por rato localizado em proximal ou distal dois pontos em WT ou TLR2

– /- ratos. (F) distribuição de tamanho dos tumores colorretais formados no WT ou TLR2

– /- ratos. (G) Carga tumoral em AOM-DSS tratada WT ou TLR2

– /- ratos. Todos os testes foram realizados com intervalos de confiança de 95%. Os dados estão expressos como médias ± SEM. * = P 0,05, ** = p 0,01, *** = p . 0.001

Análise Histológica para a colite e displasia

dois pontos inteiros foram lavada com PBS e flash -frozen na orientação rolo suíço. secções de 7 mícrons foram recolhidas ao longo da profundidade do cólon usando um criostato e coradas por hematoxilina e eosina (H E: Sigma-Aldrich). alterações histopatológicas em colite e inflamação foram marcados por um patologista (HW) cegos para os genótipos utilizando os seguintes sistemas de pontuação. Os dados são apresentados na secção de resultados como “pontuação inflamação em geral”, que representa a soma das pontuações atribuídas a “inflamação”, “extensão e gravidade da infiltração de leucócitos” e “envolvimento cento do cólon”. A definição e de pontuação para estes subcriterias são as seguintes:

A inflamação foi definido e marcado como

: (0) Nenhum para agregados linfóides normais; (1) Aumento da agregados linfóides; (2) (criptite neutrófilos dentro enterócitos das criptas); (3) Crypt abcesso (neutrófilos acumulando dentro do lúmen da cripta, às vezes com ruptura crypt); (4) Ulceração (perda de componentes da mucosa e da presença de tecido de granulação).

Extensão da infiltração de leucócitos foi pontuado como

: (0) None; (1) infiltração confinada à mucosa; (2) estendendo-se a infiltração para a submucosa; (3) a extensão transmural de A infiltração.

A gravidade da infiltração de leucócitos foi marcado com base no número de células infiltrando como

: (1) leve; (2) Moderada; (3) grave.

Percent Envolvimento de cólon foi pontuado como

: (0.25) se 1-25% do cólon estava envolvido; (0,50), se 26-50% do cólon estava envolvido; (0,75) se 51-75% do cólon estava envolvido; (1.00) se 76-100% do cólon estava envolvido. Separadamente, nós também ter marcado o “

extensão da necrose

” no cólon como se segue: (1) = 25%, (2) = 50%, (3) = 75%, (4) = 100% . Neoplasias foram identificados e também marcou para a gravidade (adenoma ou carcinoma

in situ

). carga tumoral em ratinhos foi determinada pela soma das áreas de todos os tumores por rato

BrdU e TUNEL coloração

Todas as neoplasias observadas por H . E foram confirmados após BrdU coloração com BrdU

In-Situ

Kit de Detecção (BD Pharmingen, San Diego, CA) de acordo com protocolo sugerido pelo fabricante. A apoptose foi detectada usando o

In Situ

Cell Death Detection Fluoresceína Kit (Roche, Indianapolis, IN), contrastadas com DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) e quantificados por intensidade de fluorescência por campo foco usando ImagePro Plus (Cibernética mídia , Silver Spring, MD). Regiões proximal e distal do cólon foram examinadas usando superior a três campos de foco por região em pelo menos quatro slides por animal.

Imunofluorescência

As secções congeladas foram fixados em formol a 10%. Lâminas coradas para antígenos nucleares foram ainda fixados em 100% de metanol. Anti-fosfo-Stat3 e anti-SS-catenina (ambos a partir de Cell Signaling Technology, Danvers, MA), os anticorpos foram incubados durante 48 h a 4 ° C, seguido por incubação com anticorpos de cabra anti-coelho-568 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Biotinilado anti-nitrotirosina (Cayman, Ann Arbor, MI) foi incubada durante a noite a 4 ° C, seguida por incubação com estreptavidina-594 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Todas as lâminas foram contrastadas com DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA). As células positivas foram contadas em mais do que cinco campos de focagem em, pelo menos, quatro lâminas por animal e intensidade de fosfo-STAT3 nuclear foi medida usando ImagePro Plus.

Isolamento e tratamento de células mononucleares Lâmina Própria (LPMC) e dos gânglios linfáticos mesentéricos As células (MLN)

Para obter células LP, dois pontos inteiros foram completamente lavada com PBS gelado. Uma mm partes de cólon foram incubadas em HBSS suplementada com DTT 1 mM, EDTA 3 mM, HEPES 20 mM, com agitação a 37 ° C durante 20 min. peças cólon foram lavadas com HBSS seguido por incubação em tampão de dissociação (0,075 U /ml de Blendzyme 3, 1,5 U /ml Dispase II, 0,5 mg /ml de DNase I [todos Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha], 20 mM de HEPES, cálcio 1,3 mM cloreto) com agitação a 37 ° C durante 50 min. Os dois pontos digeridos foram agitadas brevemente e mais dissociadas com agulhas de calibre crescentes, passados ​​através de uma peneira de 40 um de células e lavadas com PBS. Após centrifugação, o sedimento de células foi ressuspenso numa solução de Percoll a 45% e colocada sobre uma solução de Percoll a 72%. As células localizadas na interfase foram recolhidos num tubo limpo e lavado várias vezes. MLN foram esmagados entre lâminas de vidro e lavou-se com PBS. A suspensão de células foi passada através de um filtro de células de 40 ^ M e lavou-se com RPMI. Isolado linfócitos foram ressuspensas em RPMI 10% FBS-alto teor de glucose suplementado com L-glutamina (Cellgro; Mediatech Inc., Herndon, VA) e 1% de antibiótico /antimicótico (Sigma-Aldrich Chemical Co, St. Louis, MO), e estimuladas com 1 ug /mL de anti-CD3 (eBioscience, San Diego, CA) e 1 ug /mL de anti-CD28 (eBioscience) durante 72 h ou com /ml de LPS (1 ug Invivogen, San Diego, CA) durante 6 h. Os sobrenadantes foram recolhidos e armazenados a -80 ° C.

Preparação de homogeneizados de Colon

Dois pontos foram cuidadosamente lavadas com PBS gelado. Dois pontos foram então congelados rapidamente em azoto líquido. esferas de óxido de zircónio lavados e esterilizados (0,5 mm de diâmetro, próximo avanço, Cambridge, MA) foram adicionadas num volume igual ao do tecido. Colon tecidos foram então brevemente homogeneizada mecanicamente utilizando o misturador da bala (próximo avanço, Cambridge, MA) a 4 ° C. Um tampão de lise isotónico (1 mM de EDTA, 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,9, NaCl 250 mM, ortovanadato de 20 mM de beta-glicerofosfato, 1 mM activado, 1% de NP-40, DTT 1 mM) foi então adicionada ao tecido e grânulos em um volume igual ao do tecido. Este foi ainda homogeneizado seguido por rotação a 4 ° C durante 20 min. tecidos homogeneizados foram centrifugados durante 20 min a 4 ° C e 16100

g

e os sobrenadantes foram armazenados a -80 ° C.

ELISAs

sobrenadantes, os homogeneizados de soro ou do cólon eram analisada para a presença de TNFa, IL-4, IFNg, IL-17A, IL-23p19 (todos eBioscience, San Diego, CA), IL-10, IL-6, TGFß, MIP-2 (todos os R D Systems, Minneapolis, MN), ou KC, MCP-1 e RANTES (todo o BD Biosciences, San Jose, CA), de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante.

a análise estatística

as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 4. a análise estatística das curvas de sobrevida foi realizada pelo teste log-rank. A análise estatística dos tamanhos dos tumores foram realizadas utilizando o teste de Mann-Whitney para as populações não seguir distribuições gaussianas. Comparações de uma variável de dados seguintes distribuições gaussianas foram realizadas utilizando um teste t de Student não pareado bicaudal. Quando um F-teste indicou variações diferiram significativamente, foi empregada a correção de Welch para T-teste de Student. Comparações de dois dados variáveis ​​foram realizadas utilizando ANOVA de duas vias com Bonferroni pós-teste. Comparações de dados da curva de sobrevida foram realizadas utilizando o teste log-rank (Mantel-Cox). Todos os testes foram realizados com intervalos de confiança de 95%. Os dados estão expressos como médias ± SEM. * = P 0,05, ** = p 0,01, *** = p . 0.001

Resultados

TLR2-deficiência leva a um maior desenvolvimento do cancro do cólon associada a colite

estudos anteriores demonstraram que TLR sinalização e o adaptador comum molécula MyD88 está criticamente envolvida na homeostase de células epiteliais intestinais e o desenvolvimento de tumores intestinais [9], [10], [23], [24], no entanto, o papel de TLR2 não tem sido extensivamente estudada. Para examinar o papel de TLR2 durante a tumorigénese associada a colite foi utilizado um modelo bem estabelecido de CAC [4], [24], [30], [31], [32]. WT e TLR2

– /- ratos receberam uma única injecção de AOM, seguida pela administração de três ciclos de DSS (Figura 1A). TLR2

– /- ratos tinham um aumento da morbidade como evidenciado por um aumento da perda de peso durante o curso do tratamento (Figura 1B) e sangramento rectal mais durante o tratamento com DSS, em comparação com ratinhos WT (dados não mostrados). Encontramos também um aumento da mortalidade na TLR2 – /- ratos em comparação com ratinhos de tipo selvagem (4,6% para o WT e 25% para TLR2

– /- ratos, respectivamente, p 0,05), com a maioria das mortes ocorrendo logo após a primeira curso de DSS (Figura 1C). Em seguida, examinou-se o impacto de TLR2-deficiência no desenvolvimento do tumor associado a colite. TLR2

– /- ratos tiveram uma carga tumoral maior do que ratinhos WT. Histolopathological exame revelou um aumento significativo no número de tumores em TLR2

– /- comparado com ratinhos WT (Figura 1D). O número médio de tumores por ratinho foi quase duplicou em TLR2 deficiente em ratos em comparação com ratinhos WT (6,1 versus 3,5, p 0,05). Porque TLR2 intestinal é mais fortemente expresso no cólon proximal [33], a hipótese de que camundongos sem TLR2 iria desenvolver mais CAC proximal. Com efeito, a diferença no desenvolvimento do tumor em TLR2

– /- comparado com ratinhos WT era mais proeminente no cólon proximal (Figura 1E). Para além do aumento na multiplicidade de tumores, TLR2-deficiência também levou ao número significativamente maior de tumores grandes ( 1 mm

2) (p 0,05) (Figura 1F) e a carga de tumor mais elevada (quase o dobro) em TLR2

– /- em comparação com ratinhos WT murganhos (P 0,05) (Figura 1G). Estes resultados indicam que o TLR2-deficiência não só aumenta a promoção de tumores, mas também aumenta a progressão do tumor.

cólons TLR2-deficiente tem displasia mais avançada e expressão de beta-catenina em comparação com dois pontos WT

b-catenina sinalização desempenha um papel essencial na carcinogénese humana intestinal [34] e as mutações têm sido relatados em tumores do cólon de murino induzida por AOM [30], [31], [35]. Com efeito, a coloração fortemente SS-catenina citoplasmática ou nuclear positiva foi observada em tecido transformado em WT e TLR2

– /- ratos (Figura 2B). adenomas colorretais WT (Figura 2A, B, à esquerda 2 painéis) exibido estruturas tubulares clássicos com glândulas distorcidas e organização moderada. No entanto, TLR2

– /- neoplasias colorretais (Figura 2A, B, correcto 2 painéis) exibido glândulas mais distorcidas com regiões de aumento de desorganização e cribriforme estruturas indicativas de uma displasia grau superior (ou seja, carcinoma

in situ)

. Na verdade, a análise histológica revelou quase o dobro da incidência de carcinoma avançado

em

situ (0,3 vs 0,6 significa carcinoma in situ por ratinho) em TLR2

– /- ratos, em comparação com WT, que tendeu à significância (p 0,055) (Figura S1)

O exame histopatológico de dois pontos no dia 61 do tratamento AOM-DSS.. (A) de hematoxilina e eosina (H E) (esquerda) ou BrdU manchado (à direita) cortes seriados de WT ou TLR2

– /- ratos são mostrados. 20x Original ampliação (painéis superiores) e 100x (painéis inferiores) são mostrados. (B) coloração de imunofluorescência para ß-catenina. 100x Original ampliação (painel esquerdo) ou 400x (painel direito).

TLR2-deficiência leva ao aumento da formação precoce de focos de criptas aberrantes e tumorigênese intestinal início

Porque TLR2

– /- ratos desenvolveram tumores do cólon significativamente maiores, ao lado examinado WT e TLR2 dois pontos deficientes de 14 dias para o regime de AOM-DSS para os primeiros eventos de transformação durante tumorigênese. Neste ponto de tempo, o TLR2

– /- ratos mostraram um aumento significativamente inflamação em comparação com ratinhos WT (pontuação de inflamação em geral, de 4 x 6, p 0,001) (Figura 3A). Dois pontos de TLR2

– /- ratos contido moderada a grave inflamação que se estendeu transmuralmente enquanto a inflamação em dois pontos WT estendido para profundidades semelhantes, mas apresentado apenas ligeira a moderada infiltração de leucócitos (Figura 3D). O aumento da inflamação encontrado neste ponto de tempo (dia 14) em TLR2 – /- ratos também se correlacionou com a perda de peso corporal mais grave e aumento da mortalidade durante o primeiro curso de DSS no nosso estudo a longo prazo (Fig 1B-C). ratinhos WT sofreu ainda mais ulceração extensiva e necrose do que o TLR2

– /- (ratinhos extensão da necrose no cólon 2,5 vs 1,3, p 0,01) (Figura 3B, D). Em vez disso, o TLR2

– /- ratos mostraram sinais de regeneração com depleção de mucina, alargada e núcleos hipercromáticas, e aumentou nuclear para rácio citoplasmática, indicativos de focos de criptas aberrantes (ACF), que são conhecidos por ser pré-neoplásica [36 ] (Figura 3D, painéis direitos). Além disso, observou-se proliferação semelhante, mas reduziu a apoptose em TLR2

– /- em comparação com WT ACF ACF (Figura 3E, F), o que pode contribuir para a sobrevivência de células transformadas. Com efeito, a análise quantitativa da ACF revelou um aumento significativo em ACF no TLR2

– /- ratos, em comparação com ratinhos WT em proximal (P 0,001)., Bem como dois pontos distais (p 0,01) (Figura 3C)

pontuação de inflamação, necrose e ACF no dia 14 do tratamento AOM-DSS (n = 5 e n ​​= WT 5 TLR2

– /-). (A) contagens inflamatórios de dois pontos. (B) Extensão da necrose do cólon. (C) Número de ACF por rato localizado em dois pontos proximal ou distal. (D) H E as manchas de cortes seriados de dois pontos. 40x Original ampliação (painel superior) ou 100x (painel inferior). manchas (E) imunoistoquímica para BrdU. 100x original. coloração (F) imunofluorescência TUNEL. 100x original. Todos os testes foram realizados com intervalos de confiança de 95%. Os dados estão expressos como médias ± SEM. * = P 0,05, ** = p 0,01, *** = p . 0.001

TLR2 por deficiência aumentaram a proliferação celular e reduziu a apoptose durante o desenvolvimento precoce CAC

estudos anteriores têm demonstrado que o reconhecimento de bactérias comensais através TLRs é necessária para a homeostase do epitélio intestinal, que é controlada pelo equilíbrio da proliferação e apoptose nas criptas [10]. A fim de comparar a homeostase intestinal entre o TLR2

– /- ratos e ratinhos WT, examinámos a proliferação de células epiteliais por incorporação de BrdU e de apoptose por coloração TUNEL para a fragmentação do ADN em criptas do cólon. Curiosamente, antes da AOM-DSS observamos reduziu significativamente os números de BrdU

+ células (Figura 4A) com significativamente o aumento do número de TUNEL

+ células (Figura 4B) por cripta em proximal e dois pontos distais de TLR2

– /- ratos, em comparação com ratinhos WT. Em contraste, após um ciclo de tratamento de DSS (dia 14), o TLR2

– /- criptas do cólon mostraram aumento da BrdU

+ células (p 0,001) (Figura 4A, C) e diminuiu TUNEL

+ células (p 0,001) (Figura 4B, D) em comparação com ratinhos WT, indicando desregulado homeostase epitelial em TLR2

– /- dois pontos durante as condições inflamatórias. Além disso, embora a BrdU

+ células foram localizadas principalmente para a zona de células-tronco de criptas WT, células em proliferação foram encontrados estendido para as regiões médias do TLR2

– /- criptas, em que as células epiteliais são normalmente diferenciado e não proliferativas (Figura 4C). Portanto, como a integridade da mucosa foi comprometida em dois pontos deficientes de TLR2, a capacidade do IEC para aderir a sinais de sobrevivência e morte apropriadas foi comprometida, resultando em vez na sobrevivência celular desregulado. Para confirmar que a tumorigénese intestinal precoce em TLR2

– /- ratos é dependente de inflamação induzida por DSS examinámos WT e TLR2

– /- ratos 14 dias após uma única injecção de AOM (sem tratamento DSS) como controlos. Nós não observamos qualquer ACF discernível ou aumento da inflamação em dois pontos WT ou TLR2-deficiente nestes experimentos de controle (Figura S2), sugerindo a importância da inflamação para o desenvolvimento de tumores no contexto de TLR2-deficiência.

Avaliação da proliferação por coloração BrdU e apoptose por coloração TUNEL em proximal e dois pontos distais a partir de murganhos, quer tratados durante 14 dias com o regime de AOM-DSS (Dia 14) ou ratinhos sem tratamento (dia 0) (n = 5), BrdU

+ (a) e TUNEL

+ (B) As células foram contadas em criptas intactos e bem orientada. BrdU

+ células foram quantificados a partir de pelo menos 20 criptas por região a partir de 4 lâminas diferentes por animal. (C) Dia 14 imunohistoquímica representativos para BrdU em seções do cólon. 100x original. (D) Dia 14 manchas de imunofluorescência representativas para manchas tunel em seções do cólon. 100x original. Todos os testes foram realizados com intervalos de confiança de 95%. Os dados estão expressos como médias ± SEM. . * = P 0,05, ** = p 0,01, *** = p 0,001

TLR2

– /- ratos aumentaram IL-6 e ativação STAT3 durante tumorigênese intestinal início

Além do aumento da proliferação celular e inflamação, foram detectados aumentou significativamente os níveis séricos de IL-6 em TLR2

– /- ratos em estágios iniciais de tumorigênese após o tratamento inicial AOM-DSS (dia 14), em comparação para ratinhos WT (p 0,05) (Figura 5A). Mais importante, a IL-6 promove a progressão do tumor em modelos de tumor associadas a inflamação através da activação da STAT3 [37], [38]. Não foram observadas diferenças significativas nas concentrações séricas de outras citocinas pró-inflamatórias ou quimiocinas (IL-12p40, IL-1 beta, MCP-1, KC e MIP-2) entre WT e TLR2

– /- ratos em dia 14 do tratamento AOM-DSS (dados não mostrados). Nós também detectado um aumento de produção de IL-6 em homogenatos do cólon inteiros de TLR2

– /- murganhos no dia 14 do tratamento AOM-DSS, em comparação com ratinhos WT (p 0,01) (Figura 5B). células mononucleares da lâmina própria (LPMC) isoladas a partir de TLR2

– /- ratinhos tratados com LPS também produziram mais IL-6 do que a WT LPMC (p 0,05) (Figura 5C). Consistente com o aumento da produção de IL-6 em TLR2

– /- ratos em estágios iniciais de tumorigênese, observamos um aumento significativo acumulação nuclear de fosforilada (activada) STAT3 (pSTAT3) em TLR2

– /- epitélio comparação com dois pontos WT (Figura 5E). A quantificação da intensidade de pSTAT3 nuclear em ACF revelou um aumento de 8 vezes na expressão de TLR2 em pSTAT3

– /- em comparação com WT ACF ACF no dia 14 (p 0,05) (Figura 5F). Além disso, enquanto expressão pSTAT3 nuclear dentro de TLR2

– /- ACF estava confinada a células intactas criptas epiteliais (Figura 5E, painel da direita), pSTAT3 nuclear no WT ACF apareceu principalmente em lâmina ou criptas abscedados (Figura 5E, painel esquerdo) . análise quantitativa de pSTAT3 no início do estudo não revelou quaisquer diferenças de TLR2

– /- vs. ratinhos WT (Figura 5F)

Os painéis A-C:. IL-6 produção no WT e TLR2

– /- murganhos no dia 14 do tratamento AOM-DSS foi medida por ELISA. (A) Os níveis séricos de IL-6 (n = 8 WT, n = 9 TLR2

– /-). (B) a concentração de IL-6 em homogenatos do cólon foi normalizada para a concentração de proteína nos tecidos (n = 3 WT, n = 5 TLR2

– /-). (C) IL-6, a secreção a partir de células da lâmina própria do cólon isolados tratados com LPS (1 ug /ml) durante 6 horas (n = 3-5). (D) as manchas de imunofluorescência de fosfo-Stat3 em tecidos do cólon de WT e TLR2

– /- ratos no início do estudo. 100x original. (E) coloração de imunofluorescência de fosfo-STAT3 nos tecidos do cólon de WT e TLR2

– /- ratos tratados durante 14 dias com o regime de AOM-DSS. Painel superior 40x magnificação original, painel inferior magnificação original 400x. (F) A quantificação da intensidade de fosfo-STAT3 medido em ACF desde mais de cinco campos de focagem em, pelo menos, quatro lâminas por animal (n = 5 e n ​​= WT 5 TLR2

– /-). Todos os testes foram realizados com intervalos de confiança de 95%. Os dados estão expressos como médias ± SEM. . * = P 0,05, ** = p 0,01, *** = p 0,001

TLR2

– /- ratos têm uma resposta imune T

H17 aumentou durante CAC desenvolvimento

estudos recentes têm destacado

células T H17 na patogênese da IBD [39] e cólon tumorigênese [40]. Foi examinada a expressão de T

H1, T

H2 e t

H17 citocinas em dois pontos de WT e TLR2

– /- ratos durante o desenvolvimento precoce do CAC. Enquanto que observamos diminuição na produção de IFNg de homogeneizados de cólon derivados de TLR2

– /- ratos em comparação com ratinhos WT no dia 14 (Figura 6A), observou-se significativamente maior produção de TNFa em dois pontos TLR2 deficientes em comparação com dois pontos WT (p 0,05) (Figura 6H), uma citocina Th1 conhecida por desempenhar um papel crucial no desenvolvimento CAC [32]. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas nos níveis de IL-4 (Figura 6C) IL-10 (Figura 6B) ou nos homogeneizados do cólon nestes animais. Em contraste, observou-se um aumento de mais de duas vezes nos níveis de IL-17A em TLR2

– /- homogenatos de cólon em comparação com WT (p 0,05) (Figura 6D). Isolado LPMCs de TLR2

– /- ratos também produzidos maior que sete vezes mais IL-17A em comparação com células WT quando re-estimuladas com anti-CD3e e anti-CD28 (p 0,001) (Figura 6E). Observou-se também significativamente o aumento da produção de TGF-b em TLR2 deficiente em dois pontos em relação a dois pontos de TP (p 0,05) (Figura 6F). Aumento da produção de TGF-b ‥ IL-6, e pStat3 em TLR2

– /- ratos em comparação com WT suporta ainda o envolvimento de T

H17 células. IL-23p19 é uma citocina que tem sido implicado na manutenção da t

H17 células [41]. Observamos que TLR2

– /- cólon homogeneizados têm significativamente mais baixos níveis de IL-23p19 no início do estudo em comparação com dois pontos WT (p 0,001) (Figura 6 g). No entanto, após o dia 14 do tratamento AOM-DSS, IL-23p19 produção aumentou significativamente em TLR2

– /- dois pontos, enquanto diminui em dois pontos WT (p 0,001) (Figura 6G), apoiando ainda mais a interação de TLR2 e T

H17 células neste modelo. Além disso, em comparação com dois pontos WT no dia 14 do tratamento AOM-DSS, RST2

– /- dois pontos exibida produção significativamente mais do cólon TNFa (Figura 6H), conhecida por desempenhar um papel crucial no desenvolvimento CAC [32]. Tomados em conjunto, os nossos dados suportam que TLR2

– /- ratos após o tratamento AOM-DSS pendem para T

H17 respostas durante o desenvolvimento CAC início

(A-D, F-H) citocinas. Os dados estão expressos como médias ± SEM.