: PLOS ONE

Abstract

Purpose

Ensaios clínicos recentes mostraram que a combinação sequencial de inibidores de crescimento epidérmico receptor tirosina quinase fator (EGFR-TKI) e quimioterapia pode prolongar a PFS e /ou OS de avançados não-pequenas pacientes com câncer de pulmão de células (NSCLC) com mutação EGFR. O objetivo do presente estudo foi avaliar a sequência de combinação óptima e explorar o seu possível mecanismo.

Métodos

PC-9 e células A549, as células de adenocarcinoma de pulmão com o tipo de largura mutante e EGFR, respectivamente, foram tratados com isoladamente ou em horários diferentes combinações docetaxel /gefitinib. O status de EGFR e do gene K-ras foi determinado pela técnica de qPCR-RH. A proliferação celular foi detectada por ensaio MTT. A expressão e a fosforilação do EGFR, ERK, Akt e IGF-1R foram detectadas por Western Blot. distribuição do ciclo celular foi observada por citometria de fluxo

Resultados

Apenas administração sequencial de docetaxel seguidos de gefitinib (D → G) induzida efeito sinérgico significativo em ambas as linhas celulares. (Índice de Combinação 0,9). A sequência reversa (L → D) resultou numa interacção antagónica em ambas as linhas celulares (IC 1,1), ao passo que a administração concorrente (D + L) mostrou aditivo (0,9 CI 1,1) efeito -synergistic em células PC-9 e efeito antagonista-aditivo em células A549. Mecanismo de estudos mostrou que a fosforilação induzida por docetaxel de EGFR e de ERK foi reprimido por gefitinib subsequentemente utilizado, mas não pela exposição simultânea de gefitinib. A fosforilação reprimido-gefitinib de EGFR e ERK foi revertida nem pelo concorrente nem pela administração subsequente de docetaxel. D + G reforçou sua inibição da fosforilação de IGF-1R em células PC-9.

Conclusões

Os medicamentos citotóxicos seguido de EGFR-TKI pode ser a combinação ideal para efeitos antiproliferativos em EGFR células NSCLC -mutant, e a fosforilação de EGFR e ERK pode contribuir para este efeito

Citation:. Chen B, Zheng J, Zeng Y, Li B, Xie B, Zheng J, et al. (2014) Sequence-Dependent efeitos antiproliferativos de gefitinib e Docetaxel on Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) Células e do Mecanismo possível. PLoS ONE 9 (12): e114074. doi: 10.1371 /journal.pone.0114074

editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Estados Unidos da América

Recebido: 25 de junho, 2014; Aceito: 03 de novembro de 2014; Publicação: 04 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (https://www.nsfc.gov (nºs 81172225, 81101821 e 81000819.). cn /). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é a principal causa de morte por câncer em todo o mundo. É bem sabido que para o tratamento de NSCLC avançado, de crescimento epidérmico receptor do factor inibidor de tirosina-quinase (EGFR-TKI) e quimioterapia é recomendada como terapia de primeira linha para os pacientes com a mutação do EGFR de tipo selvagem e activa o EGFR, respectivamente. Esta recomendação baseia-se nos resultados de um estudo de fase III randomizado IPASS em que pacientes com mutações EGFR que receberam gefitinib tinha aumentado a sobrevida livre de progressão (PFS 24,9% vs 6,7%), taxa de resposta (RR 71,2% vs. 47,3%) e qualidade de vida quando comparado com aqueles que receberam quimioterapia [1]. No entanto, a aplicação de quimioterapia com platina e EGFR-TKI atingiu um patamar terapêutico. Embora nenhuma nova revisão aparece na última diretriz, alguns fase III de ensaios clínicos, incluindo FASTACT-2 [2] e informar [3] deram mais um passo e mostrou que a quimioterapia combinada com EGFR-TKI em horários específicos poderiam melhorar o prognóstico, especialmente em pacientes com mutações EGFR. Assim, presume-se que outras melhorias podem vir das conclusões do novo alvo, a superação de tolerância EGFR-TKI ea combinação de EGFR-TKI com quimioterapia uma vez que os mecanismos da sua actividade anti-tumoral são diferentes.

para o tratamento de combinação, basicamente três horários foram discutidos em ensaios clínicos recentes: 1. administração concomitante; 2. quimioterapia seguida de EGFR-TKI; 3. EGFR-TKI seguido pela quimioterapia. PERFEITO-2, tributo e talento estudos mostraram que a taxa de resposta e sobrevida global (OS) favoreceu combinação simultânea somente em pacientes EGFR-mutante, mas não no tipo selvagem ou pacientes não selecionados [4] – [6]. WJTOG0203 e informar ensaios demonstraram que a administração sequencial de quimioterapia seguido de EGFR-TKI parecia benéfico para população não seleccionada (com melhorou significativamente OS e PFS) [7], [3]. Outro estudo de fase III FASTACT-2 relatou recentemente que a quimioterapia intercalada e erlotinib foi outra opção de primeira linha viável para pacientes com estado EGFR desconhecido. Mostrou-se que PFS e OS foram significativamente prolongada com quimioterapia mais erlotinib vs quimioterapia mais placebo (PFS: 7,6 m vs. 6,0 m, P 0,0001; OS: 18,3 m vs. 15,2 m, P = 0,042). O benefício foi ainda maior para os pacientes EGFR-mutante [2]. Por outro lado, Kanda et al mostraram em um estudo de fase II que o gefitinib seguida por quimioterapia ganharam uma melhor PFS em pacientes EGFR-mutante em comparação com relatórios anteriores usando gefitinib sozinho como o tratamento de primeira linha [8]. No entanto, até agora nenhum estudo clínico comparou os três horários uns com os outros e disse qual era o ideal. A este respeito, o primeiro objetivo do presente estudo é descobrir a programação ótima de três diferentes estratégias de combinação de docetaxel e gefitinib.

Por outro lado, o mecanismo celular de efeito dependente da sequência de gefitinib em combinação com agentes quimioterapêuticos permanece uma questão em aberto. Alguns estudos anteriores indicaram que o efeito sinérgico induzido pela sequencialmente administrada EGFR-TKI seguintes agentes citotóxicos pode ser correlacionada com a fosforilação do EGFR, enquanto que um efeito antagonista de EGFR-TKI seguido pela quimioterapia foi relacionado com a regulação da distribuição do ciclo celular [9], [ ,,,0],10]. Além disso, investigações recentes relataram que o fator de crescimento semelhante à insulina receptor-1 (IGF-1R) afetou a sensibilidade das células à quimioterapia, bem como EGFR-TKI através da regulação da via de sinalização tais como PI3K /AKT e MARK /ERK [11], [12]. Baseando-se nestes resultados, o nosso segundo objectivo é a sondar o mecanismo celular de efeitos dependentes da sequência de docetaxel e gefitinib em células de câncer de pulmão através de uma avaliação das possíveis alterações nas vias de sinalização acima e na distribuição do ciclo celular.

Materiais e Métodos

Materiais

Gefitinib (Astra Zeneca, Reino Unido) e docetaxel (Sanofi Aventis, França) foram preparadas em sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Sigma Aldrich, EUA) e armazenou-se – 20 ° C. As drogas foram diluídas em meio fresco antes do experimento, e a concentração final DMSO nunca excedeu 0,1%.

Cultura de Células

pulmão humano A549 de células de adenocarcinoma e PC-9 [13] foram gentilmente cedido pelo Instituto de Bioquímica e Biologia celular (Xangai, China) e Hospital Cancer Center Nacional do Japão (Tóquio, Japão), respectivamente. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética e revisão bordo do nosso hospital. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com soro de bovino a 10% (Gibco, Grand Island, NY, EUA), numa atmosfera humidificada (Forma Scientific, Marietta, OH, EUA) contendo 5% de CO

2 a 37 ° C .

Identificação do EGFR e do gene K-ras estado

o DNA foi extraído a partir de A549 e células PC-9 utilizando o kit de tecido QIAmp (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Exons 18, 19, 20 e 21 do gene EGFR, bem como exons 2 e 3 de gene K-ras foram detectadas utilizando quantitativa de alta resolução PCR técnica de fusão (qPCR-HRM).

MTT

A549 e células PC-9 foram semeadas em placas de 96 poços (10

4 células por poço) e foram divididos em 6 grupos e tratado como se segue: 192 O grupo de controlo (C): As células foram incubadas com PBS durante 72 h; grupo 193 de Docetaxel (D): As células foram tratadas com docetaxel durante 72 h; 194 Gefitinib grupo (G): as células foram tratadas com gefitinib durante 72 h; grupo Docetaxel → Gefitinib (D → G): as células foram incubadas com docetaxel durante 24 h seguida por gefitinib durante 48 h; grupo Gefitinib Docetaxel → (L → D): As células foram incubadas com gefitinib durante 48 h, seguida de docetaxel por 24 h; grupo concomitante (D + L): as células foram incubadas simultaneamente com gefitinib e docetaxel durante 72 h. A proliferação celular foi determinada pelo ensaio de MTT. A densidade óptica (OD) a 490 nm foi determinada utilizando um 96 poços Multiscanner Auto-leitor (Dynatech MR 5000). Cada teste foi realizado em triplicado. taxa de inibição% = 100% – (OD

test-OD

branco) /(OD

Controle-OD

branco) × 100%. Cada experiência foi repetida em triplicado.

cálculo do índice de combinação (IC)

Os efeitos antiproliferativos do tratamento combinado foi avaliado pelo índice de combinação (IC). As células foram tratadas com três sequências diferentes, como mencionado acima: D → L; G → D; D + G. As doses de droga foram combinados usando proporções constantes de valores de IC50, calculado a partir do ensaio de MTT. Assim, utilizou-se 0,125, 0,25, 0,5, 1, 2 e 4 vezes de doses de IC50 de docetaxel e gefitinib. Os resultados de tratamentos sequenciais foram analisados ​​de acordo com o método de Chou [14]. O valor CI foi calculada utilizando software CompuSyn (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ, EUA), com CI 1,1, IC = 0,9-1,1 e CI 0,9 indicando antagônica, efeitos aditivos e sinérgicos, respectivamente. Cada experiência foi repetida em triplicado.

Western blot

A549 e células PC-9 foram lisadas em inibidores de proteases tampão contendo. A proteína total de células foi obtido usando o kit de extracto nuclear (Activo Motivo Corp, EUA). A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL, EUA). As amostras contendo 100 ug de proteína total foram submetidos a electroforese em 10% SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose por electrotransferência. Os blots foram sondados utilizando os seguintes anticorpos: anti-EGFR (1:1000; Santa Cruz, CA), anti-EGFR fosforilado-(1:1000), anti-ERK1 /2 (1:600), anti-fosforilado-ERK1 /2 (1:600), anti-AKT (1:1000), anti-AKT fosforilado-(1:1000), anti-IGF-1R (1:600), anti-fosforilado-IGF-1R (1:600 ) e anticorpo anti-actina β (1:800) (todos os anticorpos anteriores foram de Cell Signaling Technology, EUA), seguida de incubação com peroxidase de rábano (HRP) conjugado de cabra-anti-rato de anticorpo secundário (Santa Cruz, CA, EUA). As manchas foram visualizadas através de um kit de quimioluminescência aumentada (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Cada experimento foi realizado em triplicado.

análise do ciclo celular

células recentemente preparados foram transferidas para tubos de criopreservação. Cada grupo consistiu de 3 tubos. Após os tratamentos, as células foram lavadas duas vezes com PBS e em seguida fixadas com álcool a 70% a 4 ° C durante a noite. Após centrifugação a 1000 rpm durante 5 min, as células foram incubadas com iodeto de propídio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) a 4 ° C durante 30 min no escuro, antes de ser submetido a um citómetro de fluxo (FACScan, Becton Dickinson , mountain View, CA). ciclo celular foi analisada utilizando o software Multicycle Analisado-ADN ciclo celular. Cada experimento foi realizado em triplicado.

A análise estatística

As diferenças entre as médias foram analisados ​​com ANOVA e os dados foram expressos como média ±

SD

. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS 13.0 (Chicago, IL). foram consideradas estatisticamente significativas diferenças quando

P

. 0,05

Resultados

EGFR e estado do gene K-ras no A549 e PC-9 linhas celulares

técnica qPCR-HRM mostrou que as células A549 nutria uma mutação em exões K-ras 2 e nenhuma mutação no gene de EGFR. As células PC-9 abrigava uma mutação em exons EGFR 19 e nenhuma mutação K-ras, que estava de acordo com estudos anteriores [13].

Efeitos de diferentes horários de exposição de gefitinib e docetaxel na proliferação celular

MTT mostraram que o docetaxel (10

-4 M~10

-10 M) ou gefitinib (10

-4 M~10

-8 M para células A549; 10

-4 M~10

-10 M para PC-9 células) sozinho inibiu significativamente a proliferação de A549 e PC-9 em células de um modo dependente da dose (

P

0,05). O IC

50 de docetaxel e gefitinib foram 2,05 × 10

-7 mol /L e 1,22 × 10

-5 mol /L respe ctively para células A549 (Fig. 1A), e foram 2,41 × 10

-8 mol /L e 5,65 × 10

-8 mol /L, respectivamente, para células PC-9 (Fig. 1B). Em particular, o efeito inibitório de gefitinib em células PC-9 foi quase 10

3-dobras mais forte do que em células A549 (

P

0,05).

As células foram tratadas com concentrações gradiente (10

-4 M~10

-10 M) de gefitinib ou docetaxel por 72 h. A proliferação celular foi determinada pelo ensaio de MTT. As células A549 (a); (B) As células PC-9. *

P Art 0,05 comparado com o grupo controle.

Barras

: ± SD, n = 3.

Em seguida, avaliamos os efeitos antiproliferativos de diferentes horários de exposição de gefitinib e docetaxel em ambos EGFR-TKI-resistente (A549) e EGFR linhas celulares -tki-sensível (PC-9). Como mostrado na figura 2, apenas a administração sequencial de docetaxel seguido por gefitinib (D → L) induziu um claro efeito sinérgico (CI 0,9) em ambas as linhas celulares (efeitos inibidores do IC

50 foram 60,00 ± 4,90% para A549 e 62,15 ± 3,84% para células PC-9). Pelo contrário, a sequência de L → D resultou numa interacção antagónica (IC 1,1) em ambas as linhas celulares. A administração concomitante de docetaxel e gefitinib (D + L) mostrou antagonista e aditivo (0,9 CI 1,1) de efeitos em células A549 como a concentração do fármaco aumentou; . Considerando que, em células PC-9, D + G mostrou efeitos aditivos em combinação de dose baixa e efeitos sinérgicos em combinação dose elevada

As células foram tratadas com três diferentes seqüências de gefitinib e docetaxel (D → G; G → D ; D + G). As doses de droga foram combinados usando proporções constantes de valores de IC50 (0,125, 0,25, 0,5, 1, 2 e 4 vezes de IC50). (A, B) A taxa de inibição foi determinada por ensaio MTT. *

P Art 0,05, D → G contra o G → D; #

P Art 0,05 D → G contra o D + G. A sequência D → L produziu o efeito inibidor mais potente. (C, D) O índice de combinação (Cl) foi calculada utilizando o software CompuSyn. Apenas a sequência D → G mostraram efeito sinérgico. (D-G) de docetaxel seguido por gefitinib; (G-D) gefitinib seguido de docetaxel; (D + L) e docetaxel gefitinib administrado concorrentemente.

Barras

: ± SD, n = 3.

Efeitos de diferentes horários de exposição de gefitinib e docetaxel em vias de sinalização celular

Nós ainda mais sondados para o possível mecanismo do efeito dependente da sequência de tratamento com gefitinib e docetaxel. Figura 3 mostraram que, para ambas as linhas celulares, docetaxel aumentou a fosforilação de ERK e de EGFR, enquanto que o gefitinib isoladamente reprimiu a fosforilação destas duas proteínas. Para programação D → L, fosforilação-docetaxel aumentada de EGFR e de ERK foi significativamente reprimido por gefitinib subsequentemente utilizado, e este efeito inverso era muito mais forte em células PC-9-EGFR mutante. Pelo contrário, no que diz respeito aos horários G + D e G → D, fosforilação reprimido-gefitinib de EGFR e ERK foi revertido pela administração concomitante nem nem subsequente de docetaxel.

A expressão e fosforilação de algumas moléculas de representação em vias de sinalização celular está relacionada, incluindo o EGFR, ERK, Akt e IGF-1R foram detectadas por western blot. As células A549 (a); (B) As células PC-9. (C) grupo de controlo; (D) docetaxel isoladamente; (G) gefitinib isoladamente; (D-G) de docetaxel seguido por gefitinib; (G-D) gefitinib seguido de docetaxel; (D + L) e docetaxel gefitinib administrado concorrentemente.

Horários

D Ambos → G e D + G inibiu significativamente a fosforilação de IGF-1R em células PC-9, enquanto que em células A549, tal inibição efeito foi apenas detectado. Pelo contrário, L → programação D aumentou a fosforilação de IGF-1R em ambas as linhas celulares. Além disso, nenhum dos três esquemas mostrou efeito detectável na expressão e fosforilação de AKT.

Efeitos de diferentes programas de tratamento com gefitinib e docetaxel no ciclo celular distritution

A Figura 4 mostrou que para PC-9 células, gefitinib sozinho induzida G

0 G

1 prisão significativa /fase comparação com o grupo controle (86,94 ± 2,33% vs. 57,32 ± 3,79%,

P Art 0,05); enquanto docetaxel sozinho induzida significativa G

2 /M detenção fase (45,67 ± 3,90% vs. 15,54 ± 2,57%,

P Art 0,05). D → G também prendeu significativamente o ciclo celular em G

2 /M fase (56,31 ± 1,86% vs. 15,54 ± 2,57%,

P Art 0,05). No entanto, G → D mostraram apenas uma tendência de aumento G

0 /G

1 fase (74,39 ± 2,78% vs. 57,32 ± 3,79%,

P

0,05).

Os efeitos dos diferentes calendários de administração de gefitinib e docetaxel sobre a distribuição do ciclo celular foi detectada por citometria de fluxo. (C) grupo de controlo; (D) docetaxel isoladamente; (G) gefitinib isoladamente; (D-G) de docetaxel seguido por gefitinib; (G-D) gefitinib seguido de docetaxel; (D + L) e docetaxel gefitinib administrado concorrentemente. *

P Art 0,05 comparado com o grupo controle. n = 3.

Para as células A549, gefitinib isoladamente não teve efeitos notáveis ​​sobre a distribuição do ciclo celular, enquanto docetaxel sozinho induzida G

2 /M detenção fase significativa em relação ao grupo controle (49,58 ± 2,70 vs. 6,87 ± 1,35%,%

P Art 0,05). D → G também prendeu significativamente o ciclo celular em G

2 /M fase (60,74 ± 3,57% vs. 6,87 ± 1,35%,

P Art 0,05). No entanto, G → D mostraram apenas uma tendência de aumento G

0 /G

1 fase (78,42 ± 2,52% vs. 72,13 ± 3,89%,

P

0,05).

Discussão

O presente estudo investigou os efeitos antiproliferativos dependentes da sequência de gefitinib e docetaxel em três horários diferentes combinações em ambas as células PC-9 (EGFR mutante, K-ras WT) e células A549 (EGFR WT, K-ras mutantes). Quando gefitinib e docetaxel foram usados ​​isoladamente nas duas linhas de células, o efeito inibitório de gefitinib em células PC-9 foi significativamente mais forte do que em células A549, o que estava de acordo com relatórios anteriores [1]. No entanto, o IC50 de gefitinib era apenas metade no PC-9 em comparação com o que em A549; enquanto no trabalho clínico, gefitinib é muito mais eficaz para pacientes com mutação EGFR de docetaxel. Devemos isso pode ser porque em

em

vitro

estudo, os agentes de teste foram aplicados diretamente sobre as células-alvo, mas em

em

vivo

estudo os agentes eram geralmente dada por meio de sistema de circulação, o que poderia afetar a distribuição e concentração de diferentes agentes.

Nossos resultados também demonstraram que o docetaxel seguido de gefitinib (D → G) foi significativamente superior à de outros modos em conta o efeitos anti-tumorais não só no EGFR mutante e PC-9 células K-ras WT, mas também em EGFR WT e K-ras mutantes células A549. Isto estava de acordo com vários estudos pré-clínicos que se inscreveram um painel de diferentes linhas celulares de cancro de pulmão, tratados com quimioterapia /EGFR-TKI e relataram que a sequência de quimioterapia → EGFR-TKI tinha vantagem sobre outras modalidades de [8], [9], [ ,,,0],15]. Alguns de fase III de ensaios clínicos, incluindo WJTOG0203, informar e FASTACT-2 confirmaram também que a administração sequencial de quimioterapia seguido de EGFR-TKI notavelmente melhorada do resultado [4] – [6]. Portanto, nossas descobertas produziu um forte apoio pré-clínico para superar o planalto terapêutico de EGFR-TKI e quimioterapia, e pode ser especialmente importante para combater contra NSCLC refratário. É preciso notar-se que, no presente estudo, o sinergismo D → G também foi observada em linhas de células de EGFR de tipo selvagem. Embora resultados semelhantes também foram relatados por alguns ensaios pré-clínicos e clínicos [8], [16], [17], muitos mais dados indicaram que pacientes com EGFR de tipo selvagem não poderia beneficiar do tratamento de EGFR-TKI [4] – [6] . Presume-se que era porque em nossas doses estudo IC50 de gefitnib para cada linha celular foram aplicadas, o que significava mil dobras de gefitinib foi usado para células A549 em comparação com células PC-9. Obviamente tais doses extremamente altas não poderia ser duplicado diretamente no trabalho clínico, mas relativamente alta dose de EGFR-TKI já foi julgado por pacientes com NSCLC com metástases cerebrais e os resultados positivos foram relatados [18], [19]. Deve ser especialmente benéfico para pacientes com EGFR de tipo selvagem se modos semelhantes foram julgados e conseguiu tal subgrupo.

Em relação à administração concomitante de docetaxel e gefitinib, nosso resultado parecia meio complicado, com aditivo (0,9 CI 1,1) efeito -synergistic observada em PC-9 células e efeito antagonista-aditivo em células A549. Isto indicou que a D + L foi mais eficaz em células mutantes de EGFR do que nas células do tipo selvagem. Tais dados corresponderam a outros relatórios pré-clínicos que indicavam que o status do gene EGFR pode ser um preditor para a actividade da combinação simultânea [9]. Embora fase inicial III de ensaios não mostrou vantagem de combinação simultânea de quimioterapia + EGFR-TKI mais sozinho em pacientes não selecionados quimioterapia, uma análise de subgrupo do tributo demonstrou que erlotinib simultaneamente combinada com quimioterapia conferida uma taxa de resposta notavelmente maior em pacientes com EGFR mutante do que os pacientes com EGFR de tipo selvagem (53% vs 18%,

P

0,01) [20]. Portanto, presume-se que para a combinação simultânea, EGFR mutação poderia prever um benefício terapêutico. Do mesmo modo, também é necessário que seja notado que as doses de gefitinib utilizados em células A549 foi muito mais maior do que em células PC-9, que pode ter com chumbo para o D + G induzida por efeito aditivo observado em células A549.

Nós ainda sondado sobre o mecanismo subjacente ao sinergismo induzida pela programação D → G. Demonstrou-se que o EGFR-TKI de EGFR ligado de forma competitiva com várias e bloqueado vias de sinalização a jusante de PI3K, incluindo /Akt e Mark /Erk, resultou na inibição da proliferação de células tumorais, a vascularização de tumores e metástase [21], [22]. Um estudo cronograma de Jiang et al. revelou que o sinergismo de programação D → G pode estar relacionado com a relação de MAPK fosforilação [15]. Os nossos dados mostraram que a fosforilação do EGFR e ERK (pERK e pEGFR) foi realçado por docetaxel e foi suprimida por gefitinib. Quando gefitinib foi utilizado após o docetaxel (D → L), o docetaxel aumentou-pEGFR e vantagem foi reprimido por gefitinib subsequentemente utilizado. No entanto, esta inversão não foi detectada em outros dois horários. Esta foi, de acordo com das Giovannetti [8] e Van Schaeybroeck das [23] estudos que relataram que apenas as células exibiram aumento pEGFR poderia beneficiar usado sequencialmente EGFR-TKI. Por conseguinte, sugeriu-se que a quimioterapia induzida por sobre-regulação de pEGFR pERK e reforçou a sensibilidade de células de cancro do pulmão para subsequentemente utilizado EGFR-TKI, e finalmente resultou em melhores resultados.

Western blot mostrou que também induziu a gefitinib repressão de pEGFR pERK e não foi revertida pela exposição simultânea do docetaxel, é, por conseguinte, assumiu-se que o gefitinib falhou para reforçar o efeito inibitório de docetaxel utilizado simultaneamente, devido ao baixo nível de pEGFR e pERK em células A549. Consistentemente, Van Schaeybroeck et al. [24] demonstraram que em células de cancro colo-rectal, sub-regulação de pEGFR levou à interacção entre antagonista de EGFR-TKI e agentes citotóxicos. Pelo contrário, foi observada actividade sinérgica da administração simultânea de EGFR em células mutantes de PC-9. No entanto, de acordo com os nossos resultados mencionados acima, EGFR e fosforilação ERK pode não ser o mecanismo possível. Houve várias evidências que mostra que a expressão de IGF-1R foi correlacionada com a sensibilidade das células à quimioterapia e EGFR-TKI [25], [26]. Interferência de expressão de IGF-1R ou a administração de IGF-1R inibidor melhoraram o resultado de agentes citotóxicos e EGFR-TKI, que pode ser correlacionado com a supressão da via PI3K /Akt [27], [28]. No presente estudo, D + G inibiu significativamente a fosforilação de IGF-1R em células PC-9, enquanto que em células A549, tal efeito de inibição foi apenas detectada. Por conseguinte, assumido que a forte inibição da fosforilação de IGF-1R pode contribuir para o sinergismo alcançado em células PC-9. Outra confirmação é justificada pelo aumento da regulação e para baixo-regulação da pIGF-1R em células PC-9.

O G → programação D apresentou um efeito antagonista em ambos os A549 e células PC-9. No entanto, a regulamentação da pEGFR e pERK falhou em fornecer uma explicação plausível como induzida por gefitinib down-regulação da pEGFR e pERK não foi revertida pela exposição subsequente ao docetaxel. De acordo com estudos anteriores de outros Investigadores [29], a citometria de fluxo análise demonstrou que gefitinib células diminuiu em S e G

2 /M fase. Essa diminuição das células na fase proliferativa pode atenuar a sensibilidade das células à utilizada posteriormente docetaxel, que seletivamente orientadas para o G

2 /M células de fase, e resultar em efeitos antagónicos.

Conclusão

colectivamente, os nossos dados sugerem que a combinação entre as modalidades disponíveis na prática clínica, a abordagem mais eficaz foi a sequência da utilização de agentes citotóxicos, seguido de EGFR-TKI. A fosforilação de EGFR e ERK pode ter contribuído para esta sinergia. No entanto, uma vez que apenas duas linhas de células foram incluídos neste estudo, a expansão a um painel de linhas celulares de NSCLC com status de EGFR diferente, bem como o

em

vivo

estudos em modelos animais são garantidos avaliar melhor o efeito dependente da programação. Também vale a pena comparar os três horários de combinação em ensaios clínicos para identificar a possível “ótimo” modalidade de tratamento para pacientes com NSCLC avançado.