Abstract

Photoimmunotherapy (PIT) de utiliza câncer Os anticorpos monoclonais específicos de tumor conjugado com um corante fotossensibilizador IR700 ftalocianina que se torna citotóxica após irradiação com luz de infravermelho próximo. Neste estudo, objetivou-se avaliar a eficácia do PIT em células cancerosas pancreáticas humanas in vitro e in vivo num modelo de ratinho nu ortotópico. A capacidade de ligação do anticorpo anti-ACE para BxPC-3 de cancro pancreático humano células foi determinada por análise FACS. Um ensaio de citotoxicidade in vitro foi usado para determinar a morte celular após tratamento com PIT. Para a determinação in vivo da eficácia PIT, os ratinhos nus foram implantados ortotopicamente com tumores BxPC-3 pancreáticas que expressam a proteína fluorescente verde (GFP). Após o enxerto do tumor, os ratinhos foram divididos em dois grupos: (1) tratamento com o anticorpo anti-ACE-IR700 + 690 nm do laser e (2) tratamento com apenas 690 nm do laser. Anti-CEA-IR700 (100 ug) foi administrado com o grupo (1), através de injecção na veia da cauda 24 horas antes da terapia. Os tumores foram então exposta cirurgicamente e tratado com fototerapia, a uma intensidade de 150 mW /cm

2 durante 30 minutos. imagem de corpo inteiro foi feito posteriormente, durante 5 semanas, utilizando um sistema de pequenos animais imagiologia OV-100. O anticorpo anti-ACE-IR700 ligado às células BxPC3 a um grau elevado, como mostrado por análise de FACS. Anti-CEA-IR700 causou grandes matar células de câncer após a ativação de luz em comparação com células de controlo em ensaios de citotoxicidade. Nos modelos ortotópicos de cancro do pâncreas, do grupo de anti-CEA-IR700 tinham tumores significativamente menores do que o controlo após 5 semanas (p 0,001). Não houve diferença significativa nos pesos corporais dos ratos no anti-CEA-IR700 e grupos de controle, indicando que PIT foi bem tolerada pelos ratos

Citation:. Maawy AA, Hiroshima Y, Zhang Y, Heim R , Makings G, Garcia-Guzman M, et al. (2015) Near Infra-Red Photoimmunotherapy com Anti-CEA-IR700 Resultados em extensivo de lise tumoral e uma diminuição significativa da carga tumoral em camundongo ortotópico modelos de cancro do pâncreas. PLoS ONE 10 (3): e0121989. doi: 10.1371 /journal.pone.0121989

Editor do Academic: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, United States |

Recebido: 30 de novembro de 2014; Aceito: 09 de fevereiro de 2015; Publicação: 23 de março de 2015

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho está disponível sob a licença Creative Commons CC0 domínio público dedicação

Data Availability:. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Este trabalho foi apoiado por subsídios o National Cancer Institute CA142669 e CA132971 (a MB e anticancerígeno, Inc). AntiCancer, Inc. e Aspyrian Therapeutics forneceu apoio sob a forma de salários para os autores YZ, RH, LM, e MG-G, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação de o manuscrito

Conflito de interesses:. Robert M. Hoffman é um acionista e não-assalariados associado de AntiCancer, Inc. Yukihiko Hiroshima é um sócio não-remunerada da AntiCancer, Inc. George A. Luiken é um acionista e associado não assalariado de OncoFluor, Inc. os autores confirmam que isso não altera os autores adesão a PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Photoimmunotherapy (PIT) usa tumor específico os anticorpos monoclonais que são conjugados com o corante fotossensibilizador ftalocianina, IR700, que é citotóxica após irradiação com (NIR) de luz de infravermelho próximo [1-3].

Vários anticorpos monoclonais (mAbs) têm sido utilizados com PIT em modelos de ratinho de cancro da mama, incluindo o trastuzumab, um anticorpo monoclonal (Acm) dirigido contra o factor de crescimento epidérmico humano receptor 2 (HER-2), e panitumumab, um anticorpo monoclonal dirigido contra o factor de crescimento epidérmico humano do receptor-1 (HER-1) [ ,,,0],4,5]. A morte celular foi induzida imediatamente após a irradiação de células alvo mAb-IR700-bound com luz NIR. Na redução do tumor in vivo, após a irradiação com luz NIR foi demonstrada em células alvo que expressam o receptor do factor de crescimento epidérmico. Os conjugados de mAb-IR700 foram eficazes quando ligada à membrana celular e não produziu fototoxicidade, não ligadas, o que sugere um mecanismo diferente para PIT, em comparação com terapias convencionais fotodinâmica [1].

o cancro do pâncreas é um tumor com letal altas taxas de recorrência local e distante [6,7]. No presente estudo, foi utilizado um anticorpo monoclonal quimérico contra o antígeno carcinoembrionário (CEA) para PIT, que é frequentemente sobre-expressos em câncer de pâncreas e foi previamente utilizado por nosso laboratório para a cirurgia guiada por fluorescência e fluorescência laparoscopia [8-17]. O anticorpo anti-CEA foi conjugada com IR700 e utilizado para o tratamento PIT de câncer pancreático humano em modelos ortotópicos rato, bem como as células cancerígenas pancreáticas in vitro.

Materiais e Métodos

Cultura Celular

a linha de células de cancro pancreático humano BxPC-3 foi estavelmente transduzidas para expressar verde proteína fluorescente (GFP) como descrito anteriormente [18,19]. As células foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Logan, UT), penicilina /estreptomicina (Gibco-BRL, Carlsbad, CA), piruvato de sódio (Gibco-BRL), bicarbonato de sódio (Cellgro, Manassas, VA), L-glutamina (Gibco-BRL), e aminoácidos não essenciais meio mínimo essencial (Gibco-BRL). Todas as células foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora.

Determinação do nível de expressão do antigénio CEA

BxPC-3-GFP a partir de células de 75 cm

2 balão foram colhidas com tampão de dissociação de células sem enzima, lavou-se uma vez com tampão de incubação (PBS + 0,5% de FBS + 0,1% de azida de sódio), e recuperada em tampão de incubação a 2 x 10

6 células /ml e mantidas a 4 ° C. As células (5 x 10

5) foram incubadas com anticorpo anti-CEA quimérico (Genara Biosciences LLC, Morgan Hill, CA) (10 ug /ml) em tampão de incubação 300 uL durante 1 hora a 4 ° C, lavou-se três vezes com PBS e coradas com um burro conjugado Alexa488 anticorpo anti-IgG humana (H + L) (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) durante 45 minutos, seguido por três lavagens com PBS. Um controle sem anti-CEA foi elaborado em paralelo. Perfis de citometria de fluxo a partir das células tratadas com anticorpo anti-ACE e as células não tratadas foram estabelecidos com um goiaba EasyCyte Além disso citómetro de fluxo (Merck Millipore, Billerica, MA). A capacidade de ligação de anticorpos para anti-CEA foi determinada utilizando contas de referência (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN) e médias geométricas de acordo com o protocolo do fabricante.

Animais

nu atímicos /ratinhos nus nu (AntiCancer Inc., San Diego, CA), 4-6 semanas de idade, foram utilizados neste estudo. Os ratos foram mantidos em uma instalação de barreira sob a filtração HEPA. Os ratinhos foram alimentados com uma dieta de laboratório de roedores autoclavada. Todos os procedimentos cirúrgicos do rato e de imagem foram realizados com os animais anestesiados por injecção intramuscular de 50% de cetamina, xilazina 38%, e 12% de maleato de acepromazina (0,02 ml). Os animais receberam buprenorfina (0,10 mg /kg ip), imediatamente antes da cirurgia, e uma vez por dia durante os 3 dias seguintes para melhorar a dor. CO

2 inalação foi utilizado para a eutanásia de todos os animais em 5 semanas após a cirurgia. Para garantir a morte na sequência de CO

2 asfixia, foi realizada deslocamento cervical. Todos os estudos com animais foram realizados com um AntiCancer, Inc. Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) -protocol aprovado especificamente para este estudo e de acordo com os princípios e procedimentos descritos no Instituto Nacional de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais sob Assurance Número A3873-1.

Antibody-Dye Conjugação

Um derivado de silício-ftalocianina solúvel em água, éster IRDye 700DX NHS foi obtido a partir LI-COR Bioscience (Lincoln, NE). de anticorpo quimérico anti-CEA (Genara Biosciences LLC) (2 mg de [~ 14 nmol]) a uma concentração de 2 mg /ml em 0,1 M de Na

2HPO

4 (pH = 8,6) foi incubada durante 2 horas à temperatura ambiente com éster NHS IR700dye (135 ug, 70 nmol), preparada no seio de DMSO anidro a 5 mmol /L. Após o período de incubação, a IR700-conjugado foi trocada de tampão e purificou-se com solução salina tampão de fosfato (PBS, pH = 7,1) utilizando unidades de filtro Amicon Ultra Centrifugal (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA). O conjugado IR700-mAb foi repetidamente diluída com 10 ml volumes de PBS e, em seguida, concentrou-se utilizando as unidades de filtro até menos do que 2% do corante IR700 espécies não conjugado manteve-se, conforme determinado por HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC). A análise dos conjugados por SE-HPLC foi realizada utilizando um sistema de HPLC Agilent 1100 equipado com uma coluna TSKgel G2000SWxl (Tosoh Biosciences, Tóquio, Japão). O tampão de eluição de SE-HPLC foi 1X PBS (pH = 7,1) com uma taxa de fluxo de 1 ml /min. Detecção de UV /Vis a 280 nm e 690 nm foi utilizada para determinar a proporção média de corante-de-anticorpo (DAR) para cada conjugados. Com este exemplo, foi alcançada uma pureza de 97,6% com o corante livre de 0,5% e uma DAR de 4,1.

implantação do tumor

Depois de confluência, BxPC-3-GFP células cancerosas pancreáticas humanas (1 X 10

6) foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos nus e deixou-se enxertam e crescer durante um período de 4-6 semanas. Os tumores foram então colhidas e fragmentos de tumor (1 mm

3) a partir de tumores subcutâneos foram suturadas para a cauda do pâncreas, usando nylon 8-0 suturas cirúrgicas (Ethilon; Ethicon, Inc., Somerville, NJ). Em conclusão, a cauda do pâncreas foi devolvido para o abdómen, e a incisão foi fechada em uma camada usando nylon 6-0 suturas cirúrgicas (Ethilon) [20,21]. Os fragmentos de tumor foram deixadas a crescer durante um período de 2 semanas.

estudos de citotoxicidade

BxPC-3 foram semeadas em branco na parede placas de 96 poços (4000 /poço) e deixou-se ligar durante a noite. As células foram incubadas com o conjugado, anticorpo anti-CEA-IR700, (proporção de corante de anticorpos de 5,1) a 10 mg /ml durante 2 horas a 37 ° C. Quatro cavidades de cada vez foram submetidos a tratamento com 690 nm de luz de um LED (Marubeni Corporation, Tóquio, Japão) a uma densidade de potência de 50 mW /cm

2 que foi calibrado com um medidor de potência equipado com um sensor de potência fotodíodo (Thorlabs Inc., Newton, NJ). Depois de tratamento com luz, a solução de anticorpo foi substituído com meio completo RPMI 1640, contendo CytoTox verde (Promega, Madison, WI) para controlar a morte celular.

Photoimmunotherapy anticorpo in vivo anti-CEA ( 100 ug) (Genara Biosciences LLC, Morgan Hill, CA) conjugada com IR700DX reconstituído a 100 ul foi injectado via veia da cauda no grupo de tratamento de 24 horas antes da intervenção, enquanto o grupo de controlo tinham 100 ul de PBS semelhante injectado 24 horas antes da injecção . Cada grupo consistia em 10 ratinhos com tumores BxPC-3-GFP ortotópicos.

Após 24 horas, os tumores pancreáticos em todos os 10 ratinhos no grupo de tratamento foram expostas através de uma incisão lateral esquerdo e fotografada para detectar tanto o GFP sinal e o sinal de 700 nm. Todos os murganhos foram subsequentemente sujeitos a photoimmunotherapy por exposição do tumor a um laser de 690 nm a 150 mW /cm2 durante 30 minutos, para um total de 270 J /cm2. Os tecidos normais circundantes foram protegidos com folha de alumínio durante PIT. Os ratinhos foram fotografadas no momento do tratamento e semanalmente depois disso com o tumor exposto a avaliar a resposta à terapia. Após 5 semanas, os ratos foram sacrificados, em que ponto eles foram fotografados e tiveram seus tumores ressecados e pesados.

de imagem animal

Os ratos foram fotografadas por semana usando o sistema de imagens de pequenos animais Olympus OV100 (Olympus Corp. Tóquio, Japão), que contém uma fonte de luz MT-20 (Olympus Planegg Biosystems, Alemanha) e DP70 câmara CCD (Olympus Corp. Tóquio, Japão) [22]. Todas as imagens foram analisadas usando o programa Image-J (Instituto Nacional de Saúde Bethesda, MD) e foram processados ​​com o uso de elementos de Photoshop-11 (Adobe Systems Inc., San Jose, CA).

a determinação do tamanho do tumor

O ratinhos em ambos os grupos tiveram laparotomia semanal para expor os tumores pancreáticos através de uma incisão lateral esquerdo. Os tumores foram fotografadas com o OV-100 por expressão da GFP. O tamanho do tumor foi avaliada usando software Imagem-J (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Análise Estatística

Toda a análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS versão 21 (IBM, Armonk, NY ). Para comparações de pares, as variáveis ​​quantitativas foram calculados utilizando o teste t-pareado de Student e confirmado com o teste de soma de postos de Wilcoxon. Um valor de p ≤0.05 foi considerado significativo. intervalos de confiança de 95% obtidos na análise dos dados foram configurados para as barras de erro das figuras e gráficos apropriados.

Resultados e Discussão

Anti-CEA-IR700 liga-se a CEA-expressando o câncer de pâncreas células in vitro e provoca extensa morte celular após a activação de luz em relação ao controle

a capacidade de ligação do anticorpo anti-CEA de células de cancro do pâncreas humanos BxPC3 foi 2,227,000 locais de ligação por célula por análise de FACS (Fig. 1). As células foram incubadas com anticorpo anti-ACE-IR700 e tratou-se com 690 nm de luz. No final da incubação, houve morte celular a 100% no grupo de 690 + nm de luz anti-CEA IR700 em comparação com uma quantidade insignificante de morte celular no grupo nm de luz não-690 (Fig. 2). A morte de células 690 de luz tratada nm, em ausência de anticorpo anti-ACE-IR700 foi insignificante (dados não mostrados).

BxPC-3 células foram tratadas com o anticorpo anti-ACE e coradas com um anticorpo secundário conjugado com fluorocromo contra anti-CEA (vermelho, cheio), ou controle-coradas com anticorpo secundário única (preto, aberto) e analisadas por citometria de fluxo. Gating foi para a população principal (A). A capacidade de ligação do anticorpo anti-ACE, determinada com pérolas de referência, foi muito alta (2,227,000 locais de ligação por célula) (B).

BxPC-3 células foram incubadas com anticorpo anti-ACE-IR700 conjugado ( 10 ug /ml). morte celular rápida foi observada com uma dose de 32 J /cm

2 de 690 nm no infravermelho próximo de luz (círculos azuis), enquanto apenas pouco morte celular ocorreu sem iluminação (triângulos verdes). A morte em células de luz tratada, na ausência de anticorpo anti-ACE-IR700 foi insignificante (dados não mostrados).

PIT resulta numa redução significativa do tamanho e peso do tumor em um modelo de rato ortotópico de pâncreas cancro

Duas semanas após o implante ortotópico de tumores BxPC-3-GFP, o enxerto foi assegurada e os ratinhos foram divididos em 2 grupos com o grupo de tratamento que recebe conjugado anti-CEA-IR700 (100 ug) e o grupo de controlo receptora PBS (Fig. 3). O tamanho do tumor foi avaliada em uma base semanal para avaliar a resposta à terapia e diferenças globais na progressão. No grupo controle houve um aumento exponencial inicial do tamanho do tumor, que começou a estabilizar na semana 4 alcançar uma média máxima de 390,7 mm

2 (IC 95% [347,7, 433,7]). Em contraste, no grupo de tratamento, houve uma diminuição inicial no tamanho do tumor a partir da linha de base com uma resposta máxima observada na semana 1 (Figs. 4 e 5) com um tamanho médio de 6,65 milímetros

Cl 2 (95% [1,75, 11,5]). Durante o decurso da experiência, o tumor começou a crescer novamente, atingindo uma média máxima de 29,5 mm

2 (IC 95% [16,5, 42,5]) com 5 semanas de pós-tratamento. A diferença no tamanho do tumor entre os grupos de tratamento de controlo e foi significativa (p 0,001).

Duas semanas após o implante ortotópico de tumores BxPC-3-GFP, o enxerto foi assegurada e os ratinhos foram divididos em 2 grupos com o grupo de tratamento que recebe conjugado anti-CEA-IR700 (100 ug) e o 2

ND grupo que recebeu uma injecção com PBS. Os ratinhos foram fotografadas em série semanal ao longo de 5 semanas para medir o crescimento do tumor ortotópico.

ratinhos tinham tumores seus exposta através de uma incisão lateral esquerdo e fotografada com o OV-100. O efeito máximo de PIT foi notada uma semana após o início da terapia.

Os tamanhos dos tumores foram determinados usando software de imagem-J (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

no final da experiência na semana 5, os tumores em ambos os grupos foram extirpados e pesados. excisão completa foi confirmada com o OV-100 por meio de fluorescência de GFP. O peso médio do tumor foi de 3872 mg (IC 95% [3213, 4531]) para o grupo de controlo e 239,6 mg (IC 95% [81, 397]) para o grupo de tratamento (P 0,001) (Figuras 6 e 7). .

Uma diferença significativa foi observada com pesos médios do tumor após a ressecção do tumor. Uma diferença significativa no peso do tumor foi observada entre os grupos de tratamento e de controlo (p 0,001).

O painel superior mostra os tumores do grupo de controlo eo painel inferior mostra os tumores do grupo de tratamento.

os pesos médios do corpo dos ratos após uma semana de tratamento foram 26,3 gramas (IC 95% [25,1, 27,4]) para o grupo PIT e 25,1 gramas para o grupo controle (IC 95% [ ,,,0],24, 26.2]), que não era estatisticamente diferente (p = 0,23). Os pesos corporais médios dos ratinhos 5 semanas após o tratamento foram de 29,2 gramas (95% CI [28, 30.5]) para o grupo PIT e 28,7 gramas (IC 95% [27, 30.3]) para o grupo controle, que também não foi estatisticamente diferente (p = 0,64), indicando que a TIP foi bem tolerado pelos ratos.

Apesar dos efeitos anti-tumorais da PIT, no entanto houve uma taxa de recorrência de 100%. Estudos anteriores demonstraram que a taxa e quantidade de destruição de células de tumor é dependente tanto a dose de conjugado e a dose de luz, o produto de que resulta no mesmo efeito citotóxico, independentemente do método de entrega de luz (contínua ou intermitente) [2, 23]. A este respeito, mais estudos são necessários para avaliar como a dosagem do anti-CEA-IR700 complexa e variando o modo e quantidade de entrega de energia poderia aumentar a eficácia.

A única rodada de tratamento foi utilizado no presente relatório como prova de princípio em um modelo ortotópico de câncer pancreático. Várias rodadas de PIT será realizado em experimentos futuros. ciclos repetidos de terapia tem sido demonstrado que o aumento da eficácia da PIT [4]. Espera-se que as rodadas repetidas de PIT iria reduzir a taxa de recorrência. ciclos repetidos de PIT deve ser viável devido à baixa toxicidade observada. PIT deve ser capaz de adicionar a eficácia da cirurgia e terapia de radiação, quando usado em combinação com estas terapias. Isto irá ser testada em modelos ortotópicos, incluindo ratinhos imunocompetentes, e em modelos experimentais elevados metastáticos, assim como no xenoenxerto ortotópico derivados de paciente (PDOX) modelos em experiências futuras.