Abstract

Introdução

inerente e resistência adquirida cisplatina reduz a eficácia deste agente no tratamento de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). A compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a este processo pode resultar no desenvolvimento de novos agentes para melhorar a sensibilidade de cisplatina.

Métodos

Um modelo isogénicas de resistência a cisplatina foi gerada em um painel de linhas celulares de NSCLC (A549, SKMES-1, MOR, H460). Durante um período de doze meses, resistentes linhas celulares cisplatina (CISR) foram obtidos a partir de células originais, pareados por idade pai (PT) e posteriormente caracterizados. Proliferação (MTT) e ensaios de sobrevivência clonog�icas (cristal violeta) foram realizados entre as células PT e CISR. A resposta celular a distribuição do ciclo celular e a apoptose induzida por cisplatina foram examinadas por análise FACS. Um painel de marcadores de células estaminais pluripotentes e cancro foi analisada, para além das proteínas de EMT, c-Met e β-catenina. -DNA cisplatina formação de aduto, danos no DNA (γH2AX) e absorção de platina celular (ICP-MS) também foi avaliado.

Resultados

estudos de caracterização demonstrou uma capacidade proliferativa diminuída de células tumorais de pulmão em resposta a cisplatina, o aumento da resistência à morte celular induzida por cisplatina, acumulação de células resistentes na fase G0 /G1 do ciclo celular e da capacidade de sobrevivência clonogénica melhorada. Além disso, as células resistentes exibida uma assinatura haste-putativa como com o aumento da expressão de CD133 + /CD44 + e células o aumento da actividade de ALDH em relação às suas células parentais correspondentes. Os marcadores de células-tronco, NANOG, Oct-4 e SOX-2, foram significativamente regulada como foram os marcadores de EMT, c-Met e β-catenina. Enquanto sublinhas resistentes demonstraram diminuição da absorção de cisplatina em resposta ao tratamento, reduziu a formação de aduto cisplatina-GpG DNA e diminuiu significativamente foram observados focos γH2AX comparação com linhagens de células parentais.

Conclusão

Nossa cisplatina resultados identificados subpopulações resistentes de células NSCLC com uma assinatura de haste-putativo, como fornecendo uma melhor compreensão dos eventos celulares associados com o fenótipo de resistência à cisplatina em cancro de pulmão

citação: MP. Barr, Cinzento SG, Hoffmann AC, Hilger RA , J Thomale, Flaherty JD, et ai. (2013) Geração e Caracterização da cisplatina-resistente células não pequenas linhas celulares de cancro do pulmão Exibindo uma assinatura Stem-Like. PLoS ONE 8 (1): e54193. doi: 10.1371 /journal.pone.0054193

Edição: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

Recebido: 07 de fevereiro de 2012; Aceito: 10 de dezembro de 2012; Publicação: 17 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Barr et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Mais de um milhão de casos de câncer de pulmão são diagnosticados. cada ano. A doença é a principal causa de morte relacionada ao câncer em homens e mulheres [1]. Apesar dos esforços intensivos para controlar a morbidade e mortalidade por câncer de pulmão, a taxa global de sobrevivência de cinco anos continua pobre.

Cisplatina,

cis

-Diamminedichloro-platina (II), é um dos mais vulgarmente utilizados agentes quimioterapêuticos no tratamento do cancro, em particular cancro de pulmão de células não pequenas (NSCLC) [2]. Os efeitos citotóxicos da cisplatina são mediada pela sua interacção com ADN, resultando na formação de aductos de ADN que activam várias vias de transdução de sinal e culminam na activação da apoptose [3]. Enquanto 20-40% de doentes com NSCLC experiência metastático uma resposta parcial para terapias de combinação recentemente desenvolvidos [4], a maioria dos respondedores recaídas nos seis meses [5]. Dentro da população de doentes que tiveram uma recaída, a selecção de células e /ou a aquisição de células resistentes durante o tratamento com quimioterapia resistentes pré-existentes tem sido proposto. Portanto, uma melhor compreensão da base molecular da resistência a cisplatina é garantido, a fim de elucidar os mecanismos e marcadores subjacentes a este fenótipo resistente aos medicamentos, que actualmente limita radicalmente a utilidade clínica desta droga em pacientes com câncer de pulmão.

recentemente, a teoria de células-tronco do câncer (CSC) foi proposto para explicar a heterogeneidade do tumor e carcinogênese [6]. De acordo com este modelo, os tumores podem ser vistos como um resultado da organogénese anormal impulsionado por CSC. Estas são células de tumor auto-renovação que são capazes de iniciar e manter o crescimento do tumor por meio de sub-populações de células tumorais com estaminais ou células progenitoras características. Usando

in vitro

sistemas e

in vivo

modelos de xenoenxertos de cancro do pulmão primários humanos em ratos, a investigação recente demonstrou que as células do tumor do pulmão que expressam marcadores específicos CSC eram altamente cancerígeno, dotado com haste-like características e poupado por tratamento com cisplatina [7].

neste estudo, foram gerados e caracterizados num painel de linhas de células resistentes à cisplatina NSCLC, proporcionando uma valiosa ferramenta com a qual a investigar as vias moleculares e de células estaminais putativas marcadores que podem ser associados a este fenótipo de resistência no cancro do pulmão.

Materiais e Métodos

Linhas Celulares

A linha de grande humano de células de câncer de pulmão de células, NCI-H460 (a seguir referido como H460) e sua variante resistente foi gentilmente doado pelo Dr. Dean Fennell, Centro de Pesquisa do Cancro e Biologia celular da Universidade de Belfast da Rainha [8]. A linha celular de adenocarcinoma humano, MOR [9], e sua correspondente variante resistente a cisplatina foi obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC) (LGC Promochem, Teddington, Reino Unido). A549 (adenocarcinoma) e SKMES-1 (carcinoma escamoso) linhas celulares também foram adquiridos a partir do ATCC [10], [11]. células MOR e H460 foram cultivadas em Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) médio. As células A549 foram cultivadas em meio F12 de Ham suplementado com 4 mM de L-glutamina, enquanto as células SKMES-1 foram cultivadas em meio EMEM, suplementado com 2 mM de L-glutamina e aminoácidos não essenciais a 1% (NEAA). Para todas as linhas de células, o meio foi suplementado com soro inactivado pelo calor 10% fetal de bovino (FBS), penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 ug /ml) (Lonza, Reino Unido). Todas as células foram cultivadas como culturas em monocamada e mantidas numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 no ar a 37 ° C.

Drogas

Cisplatina [

cis

-diammineplatinum (II) dicloreto] foi obtido a partir de Sigma-Aldrich e dissolveu-se em NaCl 0,15 M. As fracções foram armazenadas a -20 ° C durante até um máximo de três meses e descongelada imediatamente antes da utilização.

Indução de cisplatina-resistência em células NSCLC

() CISR variantes resistentes à cisplatina de cada linha celular foram obtidas a partir de cada (PT) linha original parental celular por exposição contínua a cisplatina (Sigma-Aldrich, Reino Unido) a partir de estudos de dose-resposta iniciais de cisplatina (0,1 uM-100 uM) durante 72 h a partir da qual IC

obtiveram-se 50 valores. Inicialmente, cada sub-linha CISR foi tratado com cisplatina (IC

50) durante 72 h. O meio foi removido e as células foram deixadas a recuperar durante mais 72 h. Este período de desenvolvimento foi efectuada durante cerca de 6 meses, período após o qual IC

50 concentrações foram re-avaliados em cada linha de células resistentes. As células foram, em seguida, mantida continuamente na presença de cisplatina a estes novos IC

50 concentrações durante mais 6 meses. Enquanto as células A549 foram tratados inicialmente com IC

50 concentrações de cisplatina, as células foram sensíveis ao tratamento com esta concentração resultante na senescência celular e crescimento retardado. Por esta razão, a concentração de cisplatina foi reduzida (IC

25) até ao momento em que as células demonstrou sensibilidade à cisplatina na apropriado IC

50 concentração.

Droga A sensibilidade do ensaio (MTT)

As células (2,5 x 10

3) foram semeadas em placas de 96 poços e deixou-se aderir durante a noite a 37 ° C. Resumidamente, após o tratamento de células com cisplatina durante 72 h, o reagente MTT [brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio] foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 4 horas a 37 ° C . Dimetilsulfóxido (DMSO) foi adicionado a cada poço e misturou-se durante 5 min num agitador orbital. Absorbância foi gravado em 595 nm e sensibilidade à cisplatina foi calculado com base em medições de proliferação celular em 72 h

Ciclo Celular Análise de Apoptose

As células foram recolhidas por tripsinização, sedimentadas por centrifugação a 1300 rpm durante 3 min e suspenso em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). As células foram subsequentemente fixadas em etanol frio a 90% e incubou-se à temperatura ambiente durante 30 min. As células foram sedimentadas e ressuspensas em 1 ml de PBS contendo iodeto de propídio (25 ug /mL) e RNase A (100 ug /ml) sem ADNase. Após a incubação a 37 ° C durante 30 min, a distribuição do ciclo celular de células PT e CISR foram analisados ​​por meio de FACS (Becton Dickinson, UK). As células apoptóticas (SubG0) foram medidos em resposta a concentrações crescentes de cisplatina entre as células PT e CISR a seguir ao tratamento durante 24 h.

Ensaio de sobrevivência clonogénica

A sensibilidade das células NSCLC de cisplatina foi medida usando o ensaio clonogénico, o método de escolha utilizado para determinar a eficácia de agentes citotóxicos, tais como a quimioterapia [12]. As células foram deixadas aderir durante a noite a 37 ° C e tratado com concentrações crescentes de cisplatina para 9-14 dias. As colónias foram fixadas e coradas com metanol (25% v /v), contendo violeta de cristal (0,05% w /v) durante 30 min, após o que solução de coloração residual foi removida e as placas foram lavadas com água. As colónias que consistem em 100 ou mais células foram contadas utilizando o contador de colónias ColCount ™ (Oxford Optronix Ltd, Oxford, Reino Unido). Chapeamento ganhos de eficiência (PE) foram calculados utilizando a fórmula: PE = Número de colónias /Número de células semeadas. A fracção sobrevivente (SF) foi calculada utilizando a fórmula: SF = número de colónias /Número de células semeadas × PE). As curvas de sobrevivência foram construídos para a determinação da capacidade de sobrevivência das células resistentes à cisplatina em relação a células-mãe em resposta a várias concentrações de cisplatina.

Análise por Citometria de Fluxo de cancro putativo marcadores de células-tronco

O pai e a cisplatina As células resistentes ao foram recolhidos por trypsination e lavadas em tampão de SCAF (SFB a 2% a 0,1% de azida de sódio em PBS) e sedimentadas por centrifugação a 1300 rpm durante 3 min. coloração dupla para CD133 e CD44 (marcador de células epiteliais) foi levada a cabo. As células (1 x 10

6) foram incubadas ou com CD133 /1 (AC133) ficoeritrina (PE) ou de anticorpo de isotipo de anticorpo de controlo marcado com (IgG1) (Miltenyi Biotec GmbH), ou anticorpo CD44 conjugado com FITC anti-humano e de controlo de isotipo (IgG2b) (ImmunoTools GmbH, Alemanha) correspondente, durante 30 min no escuro a 4 ° C. As células foram lavadas brevemente e ressuspensas em tampão de FACS para análise subsequente. As amostras foram adquiridos e analisados ​​por FACS. dispersão lateral e perfis de dispersão para a frente foram usadas para eliminar detritos e células dobletes. A percentagem CD133 + e + de células CD44 foi determinada em linhas celulares PT e CISR por citometria de fluxo.

Aldefluor Ensaio

O Kit Aldefluor (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá) foi utilizado para identificar populações de células com actividade aldeído desidrogenase (ALDH1). O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células (1 x 10

6 células /ml) foram colhidas a partir de linhas de células PT e CISR e ressuspensas em Tampão de Ensaio Aldefluor e incubadas durante 60 minutos a 37 ° C. A quantidade de produto da reacção de ALDH fluorescente que se acumula nas células correlaciona directamente com a actividade de ALDH nestas células. efluxo activo a partir das células é inibida pelo formulação especial de Tampão de Ensaio Aldefluor. Para cada linha celular (PT e CISR), as células de controlo foram coradas utilizando condições idênticas mas incluído um inibidor da ALDH específica, dietilaminobenzaldeído (DEAB), para servir como um controlo negativo para cada experiência. Tais células são reconhecidos por comparação da fluorescência numa amostra de teste para que numa amostra de controlo contendo DEAB. Uma vez que apenas as células com uma membrana celular intacta pode reter o produto da reacção Aldefluor, foram identificadas apenas as células viáveis ​​ALDH1-positiva. As células que expressam ALDH1 brilhantemente fluourescent (ALDH1-positivo) foram detectados no canal fluorescente verde (520-540 nm) de uma ciano

ADP citómetro de fluxo (Dako, Glostrup, Dinamarca) e calculadas como as células ALDH1-positiva percentuais em cada linha celular.

Análise Western Blot

a proteína total foi extraída de progenitor e as células resistentes a cisplatina utilizando tampão RIPA arrefecido em gelo (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1% (v /v) de Triton X-100, 0,1% (w /v) de SDS) suplementado com fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) e cocktail de inibidor de protease (AEBSF 2 mM, EDTA 1 mM, 130 uM de bestatina, 14 uM E-64, 1 uM Leupepin, 0,3 uM de aprotinina). As concentrações de proteína foram determinadas usando o ensaio de ácido bicinconínico de acordo com as instruções do fabricante (BCA). A proteína (40 ug) a partir de lisados ​​de células inteiras foi fraccionado em 12% de gel SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de PVDF (Pall Corporation, FL, EUA). a eficiência da transferência de carga e foram confirmadas por coloração reversível da membrana com uma solução Ponseau S (Sigma-Aldrich, Reino Unido) após a transferência da proteína. As membranas foram bloqueadas à temperatura ambiente com leite seco não gordo a 5% em solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 0,1% de Tween-20 (TBS-T) e rastreadas utilizando um painel de marcadores de células estaminais embrionárias humanas (Abcam plc, Reino Unido) . Estes anticorpos de ratinho policlonal incluídos primário de coelho para Nanog, Oct-4 e SOX-2 (1:1000). a expressão da proteína de c-Met (Millipore) e β-catenina (BD Transduction Laboratories) foi também examinada utilizando anticorpos monoclonais de rato em 1:100 e 1:2000, respectivamente. As membranas foram lavadas em TBST e incubadas com peroxidase de rábano secundário (HRP) marcado com anticorpo durante 1 hora à temperatura ambiente (1:2000). As membranas foram lavadas em TBST a seguir à incubação com anticorpos secundários. complexos de anticorpo ligado foram detectadas e visualizadas utilizando SuperSignal

® West Pico reforçada quimioluminescência do substrato (Pierce, IL, EUA). As manchas foram retirados e re-sondado com α /anticorpo Tubulin β (Sinalização celular) para controlar o carregamento. A análise densitométrica foi realizada utilizando software e porcentagem expressão TINA ™ representada em relação aos controlos (100%).

Imunofluorescência Microscopia e Medição de cisplatina-DNA adutos

Células (PT e CISR) foram tratados com cisplatina (IC

50) durante 0, 4, 12 e 24 h, após o que eles foram recolhidos por tripsinização e lavadas duas vezes em PBS. As células (1 × 10

6 células /ml) foram novamente suspensas em PBS e malhado (10 mL), em triplicado, em Superfrost ouro Slides (ThermoFisher). As lâminas foram deixadas a secar ao ar com brevidade à temperatura ambiente. coloração de imunofluorescência e a medição de produtos de ADN platination específica foi realizada como descrito anteriormente [13], com modificações menores. Resumidamente, as células foram fixadas durante a noite em metanol arrefecido com gelo e submetido a digestão proteolítica com 60 ug /mL de pepsina e 40 ug /ml de proteinase K (100? L por mancha durante 10 min a 37 ° C numa câmara humidi ficada). Após o bloqueio dos locais de ligação não específicos com 5% (w /v) de leite em pó não gordo em PBS, as lâminas foram incubadas com anticorpo primário de rato que reconhece especificamente aductos de ADN CDDP GPG (RC-18) a 37 ° C durante 2 h ou 4 ° C durante a noite. A ligação do anticorpo primário foi detectado usando um anticorpo anti-rato marcado com Cy3® (Dianova, Hamburgo). As lâminas foram depois incubadas em 1 ug /ml de DAPI em PBS durante 30 min à temperatura ambiente para contracoloração nuclear (v /w). As imagens foram adquiridas em um microscópio de fluorescência Axioplan (Carl Zeiss GmbH, Göttingen, Alemanha) acoplado a uma câmera CCD C4880 (Hamamatsu Photonics, Herrsching, Alemanha). Para a quantificação de adutos de DNA CDDP-GPG por microscopia de imunofluorescência, sinais de fluorescência foram medidos por análise de imagem digital quantitativa usando o ACAS 6,0 CytometryAnalysis System (ACAS II, Ahrens Electronics, Bargterheide, Alemanha). Os níveis de adutos em cada amostra foram calculadas como unidades de fluorescência arbitrárias (AFU) de, mediante a normalização de fluorescência de derivado de anticorpo integrado a partir de 200 núcleos /amostra para o teor de ADN correspondente individuais. Os dados são apresentados como a média ± AFU intervalo de confiança de 95% (IC) a partir de três experiências independentes.

Formação γH2AX Focos Ensaio

As células (5 × 10

3) foram semeadas, em triplicado, em placas de 96 poços e deixou-se aderir durante a noite. células-mães e resistentes foram tratados com cisplatina, para 0, 4, 8, 12 e 24 h. Em cada ponto de tempo, os meios de cultura de células foi removido de cada poço e fixadas durante 10 min em 100 mL de formaldeído (4% v /v em PBS). As células foram então lavadas duas vezes em PBS. Tampão de bloqueio (soro de cabra a 5%, 3% de Triton X-100 em PBS) foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 1 h à temperatura ambiente. As células foram então incubadas durante a noite a 4 ° C com um primário de coelho anti-fosfo 2AX-histona anti-humano (Ser139) anticorpo (1:100) (Cell Signaling Technology) em tampão de diluição de anticorpo (1% de Triton X- BSA.0.3% 100 em PBS). Após a remoção do anticorpo primário, as células foram lavadas três vezes em PBS e incubadas com anticorpo de cabra marcado com AlexaFluor 488 anti-coelho secundário (Invitrogen) (1:2000) durante 1 h à temperatura ambiente no escuro. O anticorpo secundário foi removido e as células foram lavadas três vezes em PBS. As células foram então incubadas com Hoescht 33342 corante nuclear (3 ug /ml) durante 30 min a 37 ° C, seguido por três lavadas em PBS. Células marcadas para 2AX histona fosforilada (detectado como focos verde fluorescente) foram fotografadas pela immunofluroescence usando alta de análise de conteúdo (GE Healthcare). Dez campos de visão por poço foram adquiridas usando uma objetiva de 20X. A coloração nuclear foi detectada utilizando um filtro de excitação de 360 ​​nm e filtro de emissão de 460 nm, enquanto AlexaFluor 488 foi detectado a 480 nm e 535 nm, respectivamente. A intensidade média de fluorescência nuclear foi usado como uma medida de γH2AX usando Incell analisador 1000 software de análise de imagem.

A quantificação da absorção celular Cisplatina pelo ICP-MS

Para estudos de captação de cisplatina, as células (1 x 10

7 células /ml) foram semeadas em frascos de cultura e deixadas aderir durante a noite. As células foram então tratadas com cisplatina durante 24 h. Após o tratamento, as células foram lavadas em PBS, colhidas e contadas. Para a análise de absorção da droga, as células (1 x 10

6) foram suspensos em 1% HNO

3 durante 24 h a 70 ° C. As células lisadas foram analisados ​​por espectrometria de massa com plasma (ICP-MS). ICP-MS fornece uma análise quantitativa da concentração de um elemento em solução aquosa e tem uma sensibilidade de 5 PPT ou melhor para os produtos de platina. A concentração de analito é proporcional ao número de iões de um elemento específico que atingem o espectrómetro de massa a partir da solução vaporizada a 6000 ° C. Uma medição de ICP-MS única representa a média de 20 varreduras por repetição no prazo de cinco repetições de uma mesma amostra de líquido, com um erro muito pequeno ( 5%). As concentrações de cisplatina relatados foram na média entre quatro séries de culturas, garantindo que os valores sejam devidamente dimensionada para explicar as diferenças população de células e diluições.

As curvas padrão foram geradas usando diluições em série aquosas de soluções de rastreabilidade de volta para o padrão material de referência (SRM) de NIST (National Institute of Standards and Technology). Os coeficientes de variação variou de 1 a 4% (intra-ensaio) e de 5 a 10% (inter-ensaio).

Análise estatística

A comparação estatística entre grupos foi realizada utilizando análise de variância (ANOVA). Onde foram comparadas as médias de dois conjuntos de dados, a significância foi determinada por uma Estudantes bicaudal

t-

teste. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p ≤ 0,05. Os dados são representados graficamente como média ± erro padrão da média (SEM). Todos os dados foram analisados ​​utilizando GraphPad InStat ™ (versão 3) software estatístico.

Resultados

Geração de IC

50 Concentrações e desenvolvimento das células NSCLC com um resistentes à cisplatina Fenótipo

de modo a determinar IC

50 com valores que para o tratamento de linhas celulares parentais na geração de linhas celulares resistentes a cisplatina, as células foram tratadas com concentrações crescentes de cisplatina que variam de 0,1 pM a 100 uM. A linhagem celular H460 CISR foi previamente gerados e mantidos com 5 � cisplatina. A sensibilidade de cada um (PT) linha original de células a doses crescentes de cisplatina foi demonstrada, em que a cisplatina significativamente (p 0,001). Inibiu a proliferação de A549, células MOR SKMES-1 e a 10 uM-100 uM durante 72 horas (Figura 1A ). As curvas de dose-resposta foram gerados e IC

50 concentrações foram calculadas para todas as linhas de células (Fig. 1B). As concentrações de cisplatina (IC

50) variou entre todas as quatro linhas celulares (

A549

5,95 mM,

SKMES-1