Abstract

miRNAs de circulação do sangue pode ser útil como um biomarcador para a detecção precoce do cancro do pulmão. Nós investigamos os níveis séricos de quatro miRNAs diferentes em pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) e avaliou o seu valor diagnóstico para NSCLC. Amostras de soro de 112 pacientes com NSCLC e 104 controles (20 fumantes atuais sem câncer de pulmão, 23 pacientes com pneumonia, 21 pacientes com câncer gástrico, e 40 controles saudáveis) foram submetidos a Taqman reação em cadeia de polimerase baseada sonda reversa quantitativa (RT-PCR) . Os dados mostraram que os níveis séricos de miR-182, o miR-183 e miR-210 foram significativamente regulada positivamente e que o nível de miR-126 foi significativamente regulada negativamente em pacientes com NSCLC, em comparação com os controles saudáveis. Além disso receiver operating characteristic (ROC) análise da curva de soro revelaram que o miR-182, o miR-183, o miR-210, ou o nível de miR-126 pode servir como um biomarcador de diagnóstico para a detecção precoce de NSCLC, com uma elevada sensibilidade e especificidade. A combinação destes quatro miRNAs com antígeno carcinoembrionário (CEA) aumentou ainda mais o valor de diagnóstico, com uma área sob a curva (AUC) de 0,965 (sensibilidade, 81,3%; especificidade, 100,0%; e precisão, 90,8%), utilizando modelo de regressão logística análise. Além disso, os níveis relativos de soro de miR-182, miR-183, miR-210 e miR-126 podia distinguir NSCLC ou em fase inicial NSCLC de fumantes de tabaco atuais sem cancro do pulmão e pneumonia ou pacientes com câncer gástrico com uma alta sensibilidade e especificidade. Os dados do estudo validado que os quatro miRNAs soro poderia servir como um biomarcador tumor de NSCLC diagnóstico precoce

Citation:. Zhu W, Zhou K, Zha Y, Chen D, J Ele, Ma H, et al . (2016) Valor diagnóstico da Serum miR-182, miR-183, miR-210 e miR-126 níveis nos pacientes com início de carreira Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 11 (4): e0153046. doi: 10.1371 /journal.pone.0153046

editor: Canção Guo Zheng, Penn State University, Estados Unidos

Recebido: 28 de outubro de 2015; Aceito: 21 de março de 2016; Publicação: 19 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Zhu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada em parte por doações do Departamento de Ciência e Tecnologia de Zhoushan (# 2011C12039, # 2011C12040) para YKZ e WYZ, o Bureau Medical da província de Zhejiang (# 2015ZDA032, # 2016143029) para HBL e WYZ, os Serviços de Saúde Ministério médica da província de Zhejiang (# WKJ2014-2-021) para YKZ, e do Programa Provincial de Zhejiang para o cultivo de alto nível talentos saúde inovadores para XGL. Estas agências de financiamento não tem nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados, análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, e até 85% de câncer de pulmão é classificado como câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) [1]. Até à data, mais de 75% de doentes com NSCLC são diagnosticados em estágios avançados ou metastáticos da doença, o que resulta numa taxa de sobrevivência global fraca de menos de 15% [1]. Irressecável NSCLC também leva a uma alta taxa de recorrência do tumor após a terapia quimio-radioterapia, contribuindo assim para uma sobrevivência pobres [1]. Em contraste, a taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes com estágio patológico IA NSCLC atinge atualmente a 83,9% ea do estágio IB NSCLC é de aproximadamente 66,3% [2]. Assim, a detecção precoce ainda é a chave para melhorar a sobrevida de pacientes com NSCLC. Até à data, o diagnóstico de NSCLC em estágio inicial depende principalmente da tomografia computadorizada, ressonância magnética, tomografia por emissão de pósitrons, citologia do escarro, ou exame histológico de tecidos broncoscópicas [3]. Estas técnicas são geralmente caros ou não é prático para a detecção precoce NSCLC em um grande grupo de população. Assim, o desenvolvimento de um biomarcador no sangue não-invasivo ou minimamente invasiva, tal como ADN [4], os genes metilados de circulação do sangue [5], as células tumorais, ou microARNs (miARNs), pode proporcionar uma nova abordagem para a detecção clínica precoce do NSCLC . Além disso, o desenvolvimento de marcadores biológicos mais estáveis, sensíveis e específicas podem proporcionar um fácil de usar e ferramenta precisa para clínicos para diagnóstico de câncer mais cedo do que é actualmente possível.

miRNA é uma classe de não-codificantes pequenos RNAs de até 24 nucleótidos de comprimento que é muito estável na circulação sanguínea; Assim, poderia ser útil para a detecção de NSCLC, proporcionando uma sensibilidade elevada e especificidade [6, 7]. De facto, vários estudos anteriores demonstraram que os níveis de miARN circulantes são alterados em pacientes com NSCLC, em comparação com os de indivíduos saudáveis ​​[8-12]. Por exemplo, Mitchell

et al

. [8], em 2008, relatada pela primeira vez que o soro de miR-141 é regulada positivamente em cancro da próstata, o que sugere que poderia distinguir pacientes com cancro da próstata a partir de controlos saudáveis. Além disso, Markou

et al

. [9] descreveram níveis alterados de três miARNs circulantes (isto é, o miR-21, o miR-10a, e miR-30E-5p) em doentes com NSCLC e demonstraram a sua utilidade potencial na detecção de NSCLC. Outros estudos analisaram ainda mais a sensibilidade e especificidade dos diferentes miRNAs no diagnóstico da fase inicial NSCLC [6, 10]. Por exemplo, Tang

et al

. [11] demonstraram que a combinação de miR-21, o miR-155 e miR-145 era um biomarcador adequado para distinguir pacientes com NSCLC de controlo, uma vez que produziu uma sensibilidade de 76,5%, uma especificidade de 81,3%, e uma área sob a curva (AUC) de 0,87. Um estudo adicional avaliada a dinâmica de soro de miR-21 e miR-24 em doentes com NSCLC pré e pós-operatórias como biomarcadores para prever a eficácia do tratamento [12]. Em geral, a utilização de um painel de miARNs aumenta a sensibilidade e especificidade do diagnóstico diferencial de-fase inicial NSCLC, uma vez que a expressão de miARN é alterada de uma variedade de doenças, incluindo o cancro, doenças infecciosas, ou até mesmo os indivíduos saudáveis ​​que fumo do tabaco. Portanto, no presente estudo, foi validado estes quatro miARNs como sendo especificamente desregulado no soro de doentes com NSCLC [9, 13-15] e explorado o seu valor no diagnóstico precoce e diferencial da doença. Este estudo demonstra que o uso de um conjunto de miRNAs fornece uma ferramenta de diagnóstico útil para o diagnóstico precoce do NSCLC.

Materiais e Métodos

Os pacientes

Um total de 221 sangue amostras que atenderam aos critérios de elegibilidade foram coletadas de Zhoushan Hospital, província de Zhejiang, na China, entre Janeiro de 2011 e setembro de 2014. Estas amostras incluiu 112 pacientes com NSCLC, 20 fumantes atuais sem câncer de pulmão, 23 pacientes com pneumonia, 21 pacientes com câncer gástrico, e 40 saudáveis controlos. Pulmão e cancros gástricos foram diagnosticados histologicamente e confirmados pelos dois patologistas, de acordo com os critérios National Comprehensive Cancer Network [16, 17]. Pacientes com pneumonia foram diagnosticados com base nas manifestações clínicas, cultura bacteriana da expectoração, e achados radiológicos. Todos os pacientes não tinham história prévia de terapia, incluindo cirurgia, quimioterapia, radioterapia ou terapia antibiótica. Pacientes e controles estavam livres de outras doenças concomitantes, como a doença pulmonar obstrutiva crônica, diabetes, hipertensão, asma, hepatite, tuberculose e doenças neurológicas ou psiquiátricas. A tabela 1 resume as características clinicopatológicas dos sujeitos do estudo. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Comitê de Revisão de Zhoushan Hospital da China. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes. Todos os participantes eram chineses Han étnicas.

As amostras de sangue foram coletadas de todos os participantes no início da manhã. Os soros foram separadas imediatamente após a recolha de sangue e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Os técnicos de laboratório estavam cegos para a identidade do paciente. Um método de quimioluminescência foi usada para medir miARN no soro. Como parte da avaliação clínica de rotina, os dados referentes ao antígeno carcinoembrionário (CEA) níveis foram determinados a partir dos prontuários dos pacientes de Zhoushan Hospital.

Preparação Serum, isolamento de RNA e quantitativa transcrição reversa Polymerase Chain Reaction ( RT-PCR)

para obter amostras de soro, de 10 ml de sangue periférico foi tirado para tubos de gel separadas e, em seguida, submetido em 30 minutos a centrifugação a 1500

g

durante 10 min a 4 ° C . Os sobrenadantes foram transferidos para tubos de 1,5 mL e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Para detectar a expressão de miARN, 600 mL da amostra de soro a partir de cada participante foi submetido a isolamento de ARN utilizando um kit de isolamento de ARN miRvana PARIS (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração de ARN foi determinada utilizando um espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies) e um gel de poliacrilamida a 15% desnaturada. As amostras de RNA foram sujeitas a uma reacção de transcrição reversa utilizando um TaqMan MicroRNA Transcrição Reversa Kit (Applied Biosystems), de acordo com as instruções do fabricante. Subsequentemente, qPCR foi realizado em amostras de soro, em triplicado, utilizando TaqMan Universal PCR 2 × Master Mix sem AmpErase UNG (Applied Biosystems) em um sistema de PCR ABI 7500 Real-Time (Applied Biosystems). As condições de amplificação foram qPCR definido para um ciclo inicial de 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. Os valores limite de ciclo (Ct) foram calculados utilizando SDS 2.0.1 software (Applied Biosystems). Sem controlos de modelo foram usados ​​em qualquer um dos passos de RT ou de PCR para assegurar a amplificação específica do alvo. Os miRNA controle foi U6 RNA nuclear pequeno (snRNA), de acordo com um estudo anterior [18]. Os níveis de expressão de miARN médios no soro foram calculados usando o 2

-ΔCt método em relação à média de snRNA U6 [19]. Para determinar a alteração dobra de miARN alvo ao miARNs expressos em controlos normais, a expressão foi usado 2

-ΔΔCt [20]. O valor médio das quatro Ct miARNs foi calculada, excluindo valores extremos (i.e., replica com Ct se afasta mais do que um ciclo da mediana). Além disso, se o valor de Ct significativo para U6 não era entre 20 e 32 ciclos, o ensaio foi repetido, pelo menos, uma vez em algumas das amostras. As amostras com níveis snRNA U6 baixo não foram incluídos para análise dos dados deste estudo.

Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas com GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) e MedCalc 9,0 software (MedCalc software Inc., Mariakerke, Bélgica). Os dados foram analisados ​​de acordo com o grau de homogeneidade. A não pareado

t

teste ou teste de Mann-Whitney foi utilizado para analisar as diferenças entre sujeitos e controles ou a correlação entre os níveis de expressão de miRNA e características clinicopatológicas dos pacientes. operating characteristic (ROC) do receptor foram gerados para avaliar a precisão do diagnóstico de cada parâmetro. O melhor par sensibilidade /especificidade foi selecionado com base no máximo Índice de Youden. Os valores de AUC foram também calculados e comparados usando uma abordagem não paramétrico [21]. A análise de regressão logística múltipla foi realizada para avaliar a precisão do diagnóstico da combinação de miRNAs no soro em pacientes com NSCLC. Todos os testes estatísticos foram em frente e verso, e uma

P valor

≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

expressão diferencial de soro miRNAs em diferentes doenças e controles saudáveis ​​

com base em estudos anteriores [9, 13-15, 22], foram selecionados e avaliados quatro miRNAs soro desregulados em 216 amostras (ou seja, 112 pacientes com NSCLC, 23 pacientes com pneumonia, 21 pacientes com câncer gástrico, 20 fumantes atuais sem câncer de pulmão, e 40 controles saudáveis). Os nossos dados mostraram que os níveis de miR-182, o miR-183 e miR-210 foram significativamente aumentado no soro de doentes com NSCLC, em comparação com os de controlos saudáveis ​​da mesma idade e sexo (

P

0,0001, 0,0181 e 0,0299, respectivamente), enquanto que o soro miR-126 níveis foram significativamente menores nos pacientes com NSCLC (

P

0,0001; Fig. 1)

os gráficos mostram dot -plots de medianas e intervalos inter-quartil de log valores de cada miRNA

2-transformado em soros de 112 pacientes com NSCLC (

black

) e 40 controles saudáveis ​​(

cinza

). U6 snRNA foi utilizado como a referência.

valores P

de miR-182, miR-183, miR-210 e miR-126 foram

0,0001, 0,0181, 0,0299, e 0,0001, respectivamente, utilizando o teste de Mann-Whitney. *

P Art 0,05 entre pacientes e controles.

Circulação Serum miRNA Distingue NSCLC pacientes de pneumonia pacientes, pacientes com câncer gástrico, e os fumantes de tabaco

Descobrimos que os níveis relativos de soro de miR-183 e miR-210 foram expressão aumentada nos pacientes com NSCLC, em comparação com aqueles dos fumadores (

P 0,0001 e 0,0024

, respectivamente). Os níveis séricos de miR-182, o miR-183 e miR-210 foram também aumentadas em pacientes com NSCLC, em comparação com as dos pacientes com pneumonia (

P

= 0,0197, 0,0400, e 0,0278, respectivamente); Considerando que o nível sérico de miR-182 foi reduzida nos pacientes com NSCLC, em comparação com os que, em doentes com cancro gástrico. Além disso, o nível sérico de miR-183 foi aumentada nos vs. pacientes com câncer gástrico NSCLC (

P

0,0001 e 0,0351, respectivamente).

Em 87 early-stage (0 e I) em doentes com NSCLC, os níveis séricos de miR-182, o miR-183 e miR-210 foram significativamente aumentados, em comparação com aqueles dos fumadores (

P

= 0,0015, 0,0001 e 0,0006, respectivamente ); os níveis séricos de miR-183 e miR-210 também foram aumentadas, enquanto que o nível de miR-126 foi reduzida, em comparação com os pacientes com pneumonia (

P

= 0,0293, 0,0142 e 0,0113, respectivamente). Os níveis séricos de miR-183 e miR-210 foram também aumentadas e o nível sérico de miR-182 foi reduzida, em comparação com as dos doentes com cancro gástrico (

P

= 0,0239, 0,0048, e 0,0001 , respectivamente; Figura 2). No entanto, não houve diferença óbvia nos níveis séricos destes quatro miRNAs (miR-182, miR-183, miR-210 e miR-126) entre fase inicial e em pacientes com NSCLC em estágio final (

P

= 0,0724, 0,2874, 0,2991 e 0,4754, respectivamente).

Os níveis séricos de miR-182, miR-183, miR-210 e miR-126 foram avaliados em 112 pacientes com NSCLC, 20 fumantes atuais , 23 pacientes com pneumonia, e 21 pacientes com câncer gástrico utilizando qRT-PCR. U6 snRNA foi utilizado como a referência. *

P Art 0,05 entre os grupos utilizando o teste de Mann-Whitney.

Cedo valor de detecção dos Quatro miRNAs Sérum para o NSCLC pacientes vs. controles saudáveis ​​

Em seguida, foi realizada a análise da curva ROC para avaliar o valor diagnóstico destes quatro miRNAs circulantes sérica e CEA. Em primeiro lugar, foi identificado um valor de corte que distinguiu 112 pacientes com NSCLC de 40 sexo- saudável e controles pareados por idade. Os dados da curva ROC mostrou que todos os quatro destes miARNs poderia distinguir os pacientes com NSCLC dos controlos. Especificamente, o nível sérico de miR-182 tinha uma sensibilidade de 63,4% e uma especificidade de 80,0% para diferenciar os pacientes com NSCLC de controlos saudáveis, com uma AUC de 0,734 no ponto de corte óptima (

P

0,0001, 95% intervalo de confiança [CI]: 0,657-0,803). miR-183 teve uma sensibilidade de 41,1% e uma especificidade de 82,5%, com uma AUC de 0,626 (

P

= 0,0091, IC 95%: 0,544-0,703). miR-210 teve uma sensibilidade de 33,9% e uma especificidade de 100,0%, com uma AUC de 0,616 (

P

= 0,0121, IC 95%: 0,534-,694). miR-126 teve uma sensibilidade de 60,7% e uma especificidade de 92,5%, com uma AUC de 0,793 (

P

0,0001, IC 95%: 0,719-0,854). CEA apresentou uma sensibilidade de 55,4% e uma especificidade de 77,5%, com uma AUC de 0,711 (

P

0,0001, IC 95%: 0,632-0,782; Fig 3). Clinicamente, o nível de CEA no soro é utilizado rotineiramente para detecção do câncer. Deste modo, foram comparadas as AUC de CEA com a dos quatro miARNs e constatou que o valor de diagnóstico de CEA não foi significativamente diferente dos de miR-182, o miR-183, o miR-210 e miR-126 (

P

= 0,7290, 0,2056, 0,1818, e 0,1271, respectivamente). No entanto, os valores previstos de análise de regressão logística mostrou que a análise ROC combinado desses quatro miRNAs mais CEA revelou um aumento do valor de AUC de 0,965, com uma sensibilidade de 81,3%, uma especificidade de 100,0% e uma precisão de 90,8% (

P Art 0,0001, IC 95%: 0,923-0,988; Fig 3 e Tabela 2). A análise de regressão logística multivariada da curva ROC destes quatro miRNAs mais CEA é mostrada na Tabela S1.

O

valores P

de soro de miR-182, miR-183, miR-210, miR-126, e CEA, bem como o valor preditivo de regressão logística foram

0,0001, 0,0091, 0,0121, 0,0001, 0,0001, e 0,0001, respectivamente.

Além disso, análise da curva ROC foi utilizada para avaliar o valor diagnóstico destes quatro miRNAs entre 87 de fase inicial NSCLC (estágio 0 e I) pacientes e 40 sexo e controles saudáveis ​​pareados por idade. Os dados mostraram que os níveis séricos de miR-182 teve uma AUC de 0,781, com uma sensibilidade de 67,8% e uma especificidade de 85,0% (

P 0,0001

, IC de 95%: ,699-0,849); miR-183 teve uma AUC de 0,638, com uma sensibilidade de 41,4% e uma especificidade de 82,5% (

P

= 0,0065, IC 95%: 0,548-0,721); miR-210 teve uma AUC de 0,650, com uma sensibilidade de 35,6% e uma especificidade de 100,0% (

P

= 0,0019, IC 95%: 0,561-0,721); miR-126 teve uma AUC de 0,845, com uma sensibilidade de 62,1% e uma especificidade de 97,5% (

P

0,0001, IC 95%: 0,770-0,903); enquanto CEA tinha uma AUC de 0,648, com uma sensibilidade de 63,2% e uma especificidade de 62,5% (Cl

P

= 0,0045, 95%: 0,558-0,731; figura 4). A AUC do miR-126 foi mais ampla em comparação com a de CEA (

P

= 0,0012). No entanto, as AUCs de miR-182, o miR-183 e miR-210 não foram diferentes do AUC de CEA (

P

= 0,0589, 0,8855, e 0,9796, respectivamente). Além disso, os valores previstos da análise de regressão mostra que a análise ROC combinada destes quatro miARNs mais CEA exibido um maior valor de AUC de 0,975, com uma sensibilidade de 88,5%, uma especificidade de 92,5%, e uma precisão de 91,3% (

P

0,0001, IC 95%: 0,930-0,994; Fig 4 e Tabela 2). A análise de regressão logística multivariada da curva ROC destes quatro miRNAs e CEA é mostrada na Tabela S1.

O

valores P

do nível sérico de miR-182, miR-183, miR- 210, miR-126, e CEA, bem como o valor preditivo de regressão logística foram 0,0001, 0,0065, 0,0019, 0,0001, 0,0045, e 0,0001, respectivamente.

valor diagnóstico destes quatro miRNAs séricos mais CEA em NSCLC pacientes vs. outra doença Grupos em

As curvas ROC foram construídas para avaliar o valor diagnóstico da expressão relativa (2

-ΔΔCt) destes quatro miRNAs mais CEA no diagnóstico de NSCLC. Os dados mostraram que os níveis de miR-182, miR-183 e miR-210 foram significativamente distinta entre pacientes com NSCLC e fumantes de tabaco, com AUC de 0,764, 0,781 e 0,714; sensibilidades de 71,4%, 71,4% e 50,9%; e especificidades de 90,0%, 80,0% e 90,0%, respectivamente (

P 0,0001

,

0,0001 e 0,0001; 95% CI: 0,683-0,834, 0,701-0,848 e 0,629-0,789; Fig 5), enquanto que os níveis de miR126 e CEA não tinha diferença óbvia na AUC para distinguir NSCLC e fumantes de tabaco (

P

= 0,1322, 0,5053; Fig 5). Além disso, a combinação destes quatro miARNs e CEA tinha uma AUC de 0,861, com uma sensibilidade de 83,0% e uma especificidade de 80,0% (

P 0,0001

, IC de 95%: 0,790-0,915; Fig.5 e S2 Tabela).

o

valores P

de soro de miR-182, miR-183, miR-210, miR-126 e CEA, bem como o valor preditivo de regressão logística foram

0,0001, 0,0001, 0,0001, 0,1322, 0,5053, e 0,0001, respectivamente.

Em-fase inicial NSCLC, os dados mostraram que os níveis de miR-182, miR-183 e miR-210 foram significativamente distinta entre pacientes com NSCLC e fumantes de tabaco, com AUC de 0,728, 0,787, e 0,748; sensibilidades de 67,8%, 74,7% e 55,2%; e especificidades de 90,0%, 80,0% e 90,0%, respectivamente (

P 0,0001

,

0,0001, e

0,0001; 95% CI : 0,634-0,810, 0,698-0,861, e 0,655-0,827; S1 Fig), enquanto os níveis de miR-126 e CEA não tinha diferença óbvia na AUC para distinguir NSCLC e fumantes de tabaco (

P

= 0,1205, 0,4240; Fig S1). Além disso, a combinação destes quatro miARNs mais CEA tinha uma AUC de 0,842, com uma sensibilidade de 86,2% e uma especificidade de 70,0% (

P 0,0001

, 95% CI: ,759-,905; S1 Fig e S2 Tabela).

Além disso, as curvas ROC mostrou que os níveis de soro de miR-182, o miR-183, o miR-210 e miR-126 foram capazes de distinguir NSCLC de pneumonia, com as AUCs de 0,655 , 0,636, 0,646, e 0,679; sensibilidades de 61,6%, 70,5%, 93,8% e 52,7%; e especificidades de 73,9%, 56,5%, 39,1% e 87,0%, respectivamente (

P

= 0,0061, 0,0259, 0,0350, 0,0002, IC 95%: 0,568-0,735, 0,549-0,717, ,559-,726, ,593-,756; Figura 6). No entanto, o nível de CEA não tinha diferença óbvia na AUC para distinguir NSCLC e pneumonia (

P

= 0,1914; Fig 6). Além disso, o valor de diagnóstico da combinação dos quatro miARNs mais CEA tinha uma AUC de 0,861, com uma sensibilidade de 48,2% e uma especificidade de 82,6%, para distinguir NSCLC de pneumonia (

P = 0,0031

, 95 % CI: 0,586-0,750; Fig 6 e S3 Tabela)

O

valores P

de soro de miR-182, miR-183, miR-210, miR-126 e CEA como. bem como o valor preditivo de regressão logística foram 0,0061, 0,0259, 0,0350, 0,0002, 0,1914 e 0,0031, respectivamente.

Em-fase inicial NSCLC, os dados mostraram que os níveis de miR-182, miR-183, miR-210, miR126a e CEA produzidos AUCs de 0,618, 0,648, 0,667, 0,672 e 0,676, com sensibilidade de 56,3%, 78,2%, 94,3%, 56,3% e 56,3% e especificidades de 73,9%, 52,2%, 39,1%, 87,0% e 73,9%, respectivamente, para distinguir NSCLC de pneumonia (

P

= 0,0487, 0,0182, 0,0145, 0,0006 e 0,0059; 95% CI: 0,521-0,709, 0.552- 0,737, 0,571-0,754, 0,576-0,759, e 0,580-0,762; S2 figura). A combinação destes quatro miRNAs mais CEA produziu uma AUC de 0,731, com uma sensibilidade de 62,1% e uma especificidade de 73,9% (

P

0,0001, IC 95%: 0,638-0,811; S2 e S3 Fig tabela).

Foram também analisadas as AUC entre NSCLC e câncer gástrico, ou seja, miR-182, miR-183 e miR-210 mostraram AUCs de 0,848, 0,645 e 0,661, com sensibilidade de 69,6%, 70,5% e 56,3% e especificidade de 90,5%, 66,7% e 76,2%, respectivamente, para distinguir NSCLC de câncer gástrico (

P

0,0001, 0,0241 e 0,0063; 95% CI: 0.775- 0,904, 0,558-0,726, e 0,574-0,741, respectivamente; Figura 7). A combinação destes quatro miARNs mais CEA mostrou uma AUC de 0,972, uma sensibilidade de 97,3% e uma especificidade de 85,7% para distinguir NSCLC de cancro gástrico (

P 95% CI;

0,0001: 0.928- 0,993; Fig 7 e S4 Table)

o

valores P

de soro de miR-182, miR-183, miR-210, miR-126 e CEA, bem como o valor preditivo. de regressão logística foram 0,0001, 0,0241, 0,0063, 0,3961, 0,0744, e . 0,0001, respectivamente

Em-fase inicial NSCLC, as curvas ROC mostrou miR-182, miR-183, miR-210 e CEA com AUCs de 0,826, 0,660, 0,699 e 0,706; sensibilidades de 66,7%, 73,6%, 66,7% e 83,9%; e especificidades de 90,5%, 66,7%, 71,4% e 57,1%, respectivamente, para distinguir NSCLC de câncer gástrico (

P 0,0001

, = 0,0150, 0,0009 e 0,0016; 95% CI: 0.741- 0,892, 0,562-0,748, 0,603-0,783, e 0,611-0,790, respectivamente; Fig S3). A combinação destes quatro miARNs e CEA mostrou uma AUC de 0,976, uma sensibilidade de 94,3% e uma especificidade de 90,5% para distinguir NSCLC de cancro gástrico (

P 0,0001

; IC de 95%: 0.927- 0,996;. S3 e S4 Fig Table)

Serum miRNAs e NSCLC patologia clínica

Em termos de patologia clínica do NSCLC, não houve associação significativa entre os níveis séricos de quatro miRNAs e estatuto tabagismo, metástase linfonodal, tipo histológico do tumor, tamanho do tumor, ou estágio patológico (

P

0,05; dados não mostrados).

Discussão

miARNs no soro são úteis como novos biomarcadores tumorais para vários tipos de cancro humano, mas uma variação significativa existe nos dados entre os diferentes estudos da mesma doença [23]. A variação é em grande parte atribuída a diferentes populações de estudo, a falta de controles endógenos padrão para os miRNAs estudados [24], idade, tamanhos limitados amostra [25], e diversidade funcional de miRNAs [26]. Portanto, a validação dos níveis séricos de miARN é essencial para aplicação futura no diagnóstico da doença. Além disso, estudos prévios têm-se centrado sobre o valor de diagnóstico da miARNs entre pacientes com NSCLC e controlos saudáveis ​​[14, 19, 25] circulante. No entanto, poucos estudos têm relatado sobre o valor diagnóstico de circulação de miRNAs entre pacientes com NSCLC e fumantes, pacientes com pneumonia ou outras pessoas com outras doenças malignas. Assim, no presente estudo, foram detectados os níveis séricos de miR-182, o miR-183, o miR-210 e miR-126 em pacientes com NSCLC, à luz dos nossos estudos anteriores e literatura publicada [9, 13, 14, 22] . Os nossos resultados demonstraram que estes quatro miARNs são potenciais biomarcadores tumorais para o diagnóstico de NSCLC. Especificamente, verificou-se que os níveis de miR-182, o miR-183 e miR-210 foram significativamente aumentados no soro de doentes com NSCLC, ao passo que os níveis de miR-126 foram significativamente menores no soro de doentes com NSCLC, em comparação com os sãos controlos. As análises de curva ROC mostrou que o miR-182, o miR-183, o miR-210, ou o miR-126 sozinho era útil como um biomarcador de tumor para a detecção precoce de NSCLC, com uma elevada sensibilidade e especificidade. A combinação destes quatro miRNAs com CEA aumentou ainda mais o valor de diagnóstico, com uma AUC de 0,965 (sensibilidade de 81,3%, especificidade de 100,0%, e precisão de 90,8%). Além disso, os dados também mostraram que os níveis de expressão relativa de soro de miR-182, o miR-183, o miR-210 e miR-126 activada diferenciação de CPCNP ou de doentes com NSCLC em fase inicial de fumadores actuais, bem como a partir de pacientes com pneumonia ou cancro gástrico, com uma elevada sensibilidade e especificidade. Em conclusão, os dados atuais indicam que os quatro miRNAs soro poderia servir como biomarcadores tumorais para a detecção precoce do NSCLC.

Para o melhor de nosso conhecimento, nosso estudo é o primeiro a reportar o uso de soro combinado miR -182, miR-183, miR-210, e os níveis de miR-126 para diferenciar-fase inicial NSCLC de controles saudáveis, fumantes atuais e pneumonia ou pacientes com câncer gástrico. De facto, individualmente, um estudo anterior demonstrou que os níveis séricos de miR-182 e miR-183 foram elevados em pacientes com NSCLC, em comparação com controlos saudáveis ​​[13]. Tanto o miR-182 e miR-183 pertence à família de miR-183 e actuar como onco-miARNs na tumorigénese humana através da promoção do crescimento de células tumorais e a migração, visando o crescimento inicial da proteína factor de transcrição de resposta de 1 [27, 28]. Uma meta-análise anterior revelou que a expressão de membros da família miR-183 é regulada em muitos tipos de câncer humano, em que NSCLC está classificada em terceiro lugar [29]. Os nossos resultados são consistentes com estudos anteriores que demonstram que a expressão de miR-182 e miR-183 é aumentada não apenas em tecidos de tumor de pulmão, mas também no soro de doentes com NSCLC [13]. Zheng

et al

. [30] demonstraram que o plasma miR-182 é significativamente aumentada em pacientes com NSCLC, mas não conseguiram distinguir a fase I NSCLC de controles sem câncer. Além disso, Abd-El-Fattah

et al

. [31] demonstraram que o miR-182 é elevada em pacientes com NSCLC ou pneumonia. No entanto, em contraste com os nossos resultados indicam que o soro de miR-126 e miR-183 níveis foram alteradas entre 0 e fase I NSCLC, Lin

et ai. [32] mostraram diferenças significativas no soro miR-126 e miR-183 níveis entre pacientes com NSCLC fase IV e controles; enquanto que na fase I /II pacientes com NSCLC, o miR-126 e os níveis de miR-183 mantiveram-se estáveis ​​e consistentes. A razão para esta discrepância é desconhecida, mas pode estar relacionada com o tamanho das amostras limitadas e populações de estudo. Além disso, o nível de miR-126 foi regulada negativamente em NSCLC em comparação com os tecidos do pulmão não cancerosas devido ao fato de que o miR-126 participa na angiogénese tumoral, visando a expressão do factor de crescimento endotelial vascular-A [33, 34]. Regulada positivamente de miR-126 também inibe a adesão de células tumorais, a migração e a invasão, o qual pode mediar a expressão parcialmente Crk [35]. Em nosso estudo, mostramos que miR-126 foi regulada negativamente em soros de pacientes com NSCLC, de acordo com um estudo anterior [15]. Além disso, o miR-210 tem sido chamado “o micromanager da via de hipoxia” e está envolvido no crescimento de tumor, apoptose, angiogénese e [36]. Além disso, o miR-210 tem sido relatado para ser aumentada em tecidos de tumor de pulmão e de expectoração de doentes com NSCLC [37, 38]. No presente estudo, nós demonstramos regulação positiva de soro de miR-210 em pacientes com NSCLC, que pode actuar como um desenvolvimento onco-miARN em NSCLC.

Embora a análise destes quatro pequenos RNAs tem sido relatado anteriormente, o seu valor de diagnóstico para NSCLC distinguir de outras doenças ou condições, tais como fumo de tabaco de corrente, a pneumonia, ou outros tipos de cancro, não foi avaliada até à data. O nosso estudo revelou que os níveis de miR-182, o miR-183 e miR-210 em NSCLC ou de fase inicial NSCLC foram significativamente diferentes das dos fumadores de tabaco, bem como pacientes com pneumonia ou cancro gástrico, e eles mostraram um elevado sensibilidade e especificidade. O nível sérico de miR-126 foi capaz de distinguir NSCLC de pneumonia, ao passo que os níveis de soro de CEA não tinha essa capacidade de distinguir NSCLC de outras doenças. Assim, estes quatro miARN pode ter o potencial de ser ainda avaliada como biomarcadores para o diagnóstico precoce do NSCLC. Além disso, a combinação destes quatro miARNs com CEA marcadamente aumentado o valor de AUC, com uma elevada sensibilidade e especificidade, sugerindo o seu papel potencial no diagnóstico precoce de NSCLC. Além disso, estudos anteriores demonstraram que estes quatro miARNs são diferencialmente expressos nos soros de outras doenças individualmente, mas não houve nenhum estudo que relata a utilização da sua combinação como um biomarcador para uma doença. Alguns exemplos destes miARNs na literatura são como se segue: Li

et ai. (2

-ΔΔCt).

doi:10.1371/journal.pone.0153046.s007

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Acknowledgments

This