Abstract

Nós descrevemos o uso de primers “superseletiva” que permitem a detecção e quantificação de mutações somáticas cuja presença refere-se a cancro diagnóstico, prognóstico e terapia, em ensaios de PCR em tempo real que pode potencialmente analisar fragmentos de ADN raras presentes em amostras de sangue (biópsias líquido). O desenho destes iniciadores desoxirribonucleótido incorpora tanto um ” ‘sequência de âncora que hibrida fortemente para segmentar os fragmentos de ADN, e um muito curto, fisicamente e funcionalmente separadas,” 3 5 “‘ relativamente longa sequência de pé” que é perfeitamente complementar à sequência alvo mutante desemparelhamentos, mas a sequência de tipo selvagem. Como poucos fragmentos de dez mutantes podem ser detectadas com fiabilidade, na presença de 1.000.000 de fragmentos de tipo selvagem, mesmo quando a diferença entre o mutante e do tipo selvagem é apenas uma single nucleotide polymorphism. Os ensaios de PCR multiplex, empregando um conjunto de iniciadores superseletiva, e um correspondente conjunto de sondas de farol molecular de cores diferentes, pode ser usado em situações onde as mutações diferentes, embora ocorra em células diferentes, estão localizados no mesmo codão. Estas em tempo real Os ensaios de PCR multiplex não-simétricos contêm concentrações limitadas de cada iniciador superseletiva, permitindo assim a determinação simultânea da abundância de cada mutação por comparação do seu valor de limiar para o valor limite de um gene de referência presente na amostra.

Citação: Vargas DY, Kramer FR, Tyagi S, Marras SAE (2016) Multiplex PCR em Tempo real ensaios que medem a abundância de extremamente rara mutações associadas com Câncer. PLoS ONE 11 (5): e0156546. doi: 10.1371 /journal.pone.0156546

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha

Recebido: 23 Março, 2016; Aceito: 16 de maio de 2016; Publicado em: 31 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Vargas et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

Financiamento:. esta pesquisa, a taxa de acesso aberto para a publicação deste artigo, e os salários de todos os autores deste manuscrito foram apoiados por (Instituto de pesquisa de Saúde Pública do laboratório, Universidade Rutgers) parte da renda recebida do licenciamento não-exclusivo de tecnologia balizas molecular por PHRI Properties, Inc., que é uma corporação sem fins lucrativos totalmente detida pela Universidade Rutgers. Nem Propriedades PHRI, Inc., nem nenhum dos seus cerca de 75 balizas licenciados moleculares, teve qualquer papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. FRK , ST, e SAEM receber royalties do licenciamento não-exclusivo de tecnologia balizas molecular por propriedades de PHRI, Inc. os licenciados patentes relevantes dos Estados Unidos são: “marcado de forma detectável dupla Conformação Oligonucle�ido sondas, Ensaios e Kits” 5,925,517; e “Nucleic Acid Detecção Sondas Tendo não-FRET para redução da fluorescência e Kits e ensaios, incluindo tais sondas” 6.150.097. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Ele tem sido um objectivo há muito procurado médico para ser capaz de detectar em um muito estágio inicial mutações extremamente raras, cuja presença em uma amostra clínica é útil para diagnosticar câncer, determinar o prognóstico, e indicando a escolha de uma terapia eficaz [1]. A avaliação quantitativa e detecção de mutações somáticas relevantes tem múltiplas utilizações, incluindo: (i) a detecção do cancro numa fase tratável em doentes que herdam os genes que tornam o cancro mais provável; (Ii) a detecção de mutações em células cancerosas benignos que indicam que elas podem agora metástase; (Iii) a medição da abundância de células de câncer durante o tratamento; e (iv) a determinação de se as células cancerosas resistentes a fármacos têm surgido durante o tratamento, de modo que a terapia pode ser ajustado. Um outro objectivo é o de desenvolver métodos que permitam ensaios multiplex capazes de medir simultaneamente a abundância de diferentes mutações raras. Se tais ensaios eram para se tornar disponível, o câncer poderia ser convertido de uma doença muitas vezes fatal para uma condição crônica que pode ser gerenciado por testes freqüentes combinado com ajustes terapêuticos individualizados.

Estimular esses esforços é sobre a percepção de que as células cancerosas, não importa onde no corpo eles estão localizados, dividir frequentemente, sofrem apoptose e a necrose, e como consequência, os fragmentos de ADN genómico a partir dessas células cancerosas estão presentes no plasma sanguíneo de cada paciente [2]. Esta constatação abriu a possibilidade de que a presença de mutações raras indicativos de cancro diagnóstico, prognóstico e tratamento pode ser detectada e quantificada numa fase muito precoce, através da realização de “biópsias líquidos,” ADN utilizando isolado a partir de plasma [3-5] . O desafio para os designers de ensaio é o de encontrar um meio de detectar selectivamente e quantificar estes fragmentos de sequência mutante raras em ADN de plasma, apesar da presença de fragmentos de sequência de tipo selvagem abundantes originários a partir de células normais de todo o corpo, e apesar do facto de diferentes mutações relevantes , embora originário de células diferentes, frequentemente ocorrem nos mesmos ou adjacentes codões. O sucesso de sequenciação “próxima geração” para a detecção de fragmentos raros de sequências mutantes no DNA plasmático [6-8], embora complexa e dispendiosa, ilustrou o valor desta abordagem.

ensaios de diagnóstico molecular baseada em a amplificação exponencial de sequências alvo de ácido nucleico, tais como reacções em cadeia com polimerase, são baratos e suficientemente sensível para gerar sinais a partir de tão pouco como uma única molécula molde. O desafio é a concepção destes ensaios para ser extremamente selectiva, de modo a que eles permitem a amplificação exponencial de fragmentos de ADN mutantes, enquanto suprimem simultaneamente a geração de produtos de amplificação a partir de fragmentos de ADN de tipo selvagem muito mais abundantes, mesmo quando a única diferença entre a sequência mutante e a sequência de tipo selvagem é um polimorfismo de nucleotídeo único.

abordagens promissoras utilizam iniciadores de amplificação que são projetados para ser altamente seletiva. Por exemplo, as sequências de nucleótidos do sistema de amplificação refractária mutação (ARMS) iniciadores [9] são perfeitamente complementares à sequência alvo mutante, mas que contêm um “nucleótido interrogar” na sua extremidade 3 ‘que não é complementar ao nucleótido correspondente na de tipo selvagem sequências alvo. Os híbridos desemparelhados de tipo selvagem resultantes são muito menos susceptível de permitir a síntese dos produtos de amplificação, por ADN-polimerases requerem um par de base 3’-terminal para iniciar a síntese. Aqui, o mecanismo é selectiva enzimática. Por outro lado, dual priming oligonucleotídeo (DPO) iniciadores [10], primers MYT [11], primers hairpin [12, 13], e primers PASS [14], utilizam um mecanismo diferente. Eles também possuem uma sequência de iniciação que é perfeitamente complementar a um alvo mutante, mas que contêm um nucleótido Interrogating interna que não corresponde à sequência de tipo selvagem correspondente. A duração da sua sequência de preparação é escolhido de modo que, sob condições de recozimento, híbridos mutantes perfeitamente complementares são susceptíveis de formar, e são, portanto, susceptíveis de conduzir à geração de produtos de amplificação, enquanto incompatíveis híbridos de tipo selvagem são muito menos propensos a formar, e são, portanto, muito menos susceptível de conduzir à geração de amplicons. Abordagens alternativas, envolvendo PCR-fixação [15] ou a utilização de bloqueadores de gancho de cabelo de oligonucleótidos [16], utilizar uma mistura que contém os dois iniciadores de ADN convencionais que se ligam a sequências mutantes, e “anti-iniciadores” que são concebidos para se ligarem selectivamente a selvagem -tipo sequências, evitando assim a iniciação da síntese de amplicão de tipo selvagem. No entanto, todas estas abordagens, embora geralmente aplicável para a detecção de sequências mutantes, ou não são suficientemente sensíveis para detectar mutantes extremamente raros [12-15], que não sejam compatíveis com PCR em tempo real, devido à presença de nucleótidos não naturais na sua sequência [10], ou não foram mostrados para permitir determinações quantitativas em ensaios de PCR em tempo real multiplex quando diferentes mutações alvo ocorrem no mesmo códon [9, 11, 16].

Este relatório descreve experimentos que exploram a estrutura e função dos iniciadores de PCR “superseletiva” que permitem a quantificação de metas de mutantes raros. Significativamente, uma vez que estes iniciadores de iniciar a síntese de fragmentos de ADN mutantes, os fragmentos de amplificação resultantes são amplificados exponencialmente com alta eficiência em ciclos térmicos subsequentes, e os dados em tempo real convencionais proporcionam um meio de avaliar a abundância dos modelos de mutantes na amostra original. Além disso, este relatório descreve modelos particulares para os iniciadores superseletiva, e modificações no formato de PCR, que permitem que os ensaios de PCR em tempo real multiplex a ser efectuada que medir a abundância de sequências alvo mutante diferente em relação à abundância de uma referência wild- sequência do tipo presente em cada amostra.

Materiais e Métodos

primers e beacons moleculares

superseletiva sequências de iniciadores foram analisados ​​com o auxílio do servidor web MFOLD [17] eo programa de computador OligoAnalyzer (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) para garantir que sob condições de ensaio que eles não são susceptíveis de formar estruturas em grampo internos, e é improvável que formam auto-dímeros ou heterodímeros com os iniciadores inversos convencionais. Os iniciadores foram adquiridos a Integrated DNA Technologies; e as sondas farol molecular de cores diferentes para detectar os produtos de amplificação foram adquiridos de Biosearch Technologies (Petaluma, CA).

modelos de DNA

Os plasmídeos contendo

sequências de EGFR (ou o L858 sequência mutante ou a sequência de tipo selvagem) foram preparadas através da inserção de um fragmento de gene de 115 pares de bases num pGEM

®-11Zf (+) vector (Promega, Madison, WI). As sequências destes plasmídeos foi confirmado por análise da sequência. O DNA genómico humano que codifica para a

EGFR

mutação L858R foi isolado a partir de linha de células H1975 (CRL-5908, American Type Culture Collection, Manassas, VA) e o ADN genómico humano contendo a sequência de tipo selvagem correspondente foi adquirido a Coriell celular repositórios (Camden, NJ). A de tipo selvagem e mutante

EGFR

plasmídeos, e os DNAs genómicos humanos, foram digeridas através de incubação com endonuclease de restrição Msel (New England Biolabs, Ipswich, MA). As misturas de 20-ul de digestão continha 4 mg de DNA, 10 unidades de Msel, 50 mM de NaCl, 10 mM de MgCl

2, 100 ug /mL de albumina de soro de bovino, e Tris-HCl a 10 (pH 7,9). Estas reacções foram incubadas durante 120 min a 37 ° C, seguido por incubação durante 20 min a 65 ° C para inactivar a endonuclease.

Os plasmídeos contendo

sequências BRAF

(tanto a sequência mutante V600E, a sequência V600R mutante, ou a sequência de tipo selvagem) foram adquiridos a Integrated DNA Technologies, e foram preparadas através da inserção de um fragmento de gene de 200 pares de bases em vectores pIDTSmart Amp. O

BRAF

plasmídeos foram digeridos por incubação com endonuclease de restrição Sca I (New England Biolabs). As misturas de 20-ul de digestão continha 4 mg de DNA, 10 unidades de Sca I, 100 mM de NaCl, 10 mM de MgCl

2, ditiotreitol 1 mM, e Tris-HCl 50 (pH 7,9). Estas reacções foram incubadas durante 120 min a 37 ° C, seguido por incubação durante 20 min a 80 ° C para inactivar a endonuclease.

Os ensaios de PCR

reacções em cadeia da polimerase em tempo real foram realizados monoplex em volumes de 30 ul contendo 50 mM de KCl, MgCl 3 mM de

2, Tris-HCl a 10 (pH 8,0), 250 uM de dATP, 250 uM de dCTP, 250 uM de dGTP, 250 uM de dTTP, 1,5 unidades de AmpliTaq DNA ouro polimerase (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), 120 nM de cada iniciador, e 1 x SYBR

® verde (ThermoFisher Scientific) para monitorização abundância fragmento amplificado durante a fase de alongamento da cadeia de cada ciclo térmico.

real Duplex reacções em cadeia de polimerase foram realizadas -time em volumes de 30 ul contendo 50 mM de KCl, 2,5 mM MgCl

2, Tris-HCl a 10 (pH 8,0), 250 uM de dATP, 250 uM de dCTP, dGTP 250 uM, dTTP 250 ^ M , 1,5 unidades de polimerase Platinum Taq DNA (ThermoFisher Scientific), ou 500 nM (PCR simétrica) ou 60 nm (PCR não-simétrica) de cada

BRAF

primário superseletiva, 1.000 nM do convencional

BRAF

iniciador reverso comum, e 300 nM de cada um farol molecular para o acompanhamento da abundância de cada tipo de fragmento amplificado durante a etapa de recozimento de cada ciclo térmico.

Triplex em tempo real, as reacções em cadeia com polimerase continha os mesmos reagentes conforme as reações duplex, exceto que eles continham 60 nM de cada

BRAF

primário superseletiva, 60 nM do

EGFR

superseletiva primer, 1.000 nM do convencional

BRAF

inversa comum primer, e 500 nM do convencional EGFR

reverter primer. Utilizamos

EGFR

plasmídeos do tipo selvagem como o gene alvo de referência nestes ensaios modelo triplex, uma vez que eles estavam disponíveis em nosso laboratório.

Todas as amplificações foram realizadas em 200 mL de polipropileno branco PCR tubos (EUA Scientific, Ocala, FL) num termociclador espectrofluorométrico IQ5 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). As misturas de reacção foram incubadas durante 10 min a 95 ° C para activar a polimerase de ADN AmpliTaq Gold (monoplex reacções) ou foram incubadas durante 2 min a 95 ° C para activar a polimerase de Platinum Taq DNA (reacções multiplex), seguido por 55 ou 60 ciclos consistindo de desnaturação 95 ° C durante 20 seg, 60 ° C, emparelhamento durante 20 seg, 72 e alongamento da cadeia ° C durante 20 seg.

Resultados

iniciadores superseletiva são oligodesoxirribonucleótidos cuja função numa ensaio de PCR foi dividido em duas partes [10, 14, 18]. A função da eficiência de ligação a um gene de interesse é atribuído a um tempo relativamente longo ‘do segmento 5 sequência (que chamamos a “âncora”), e a função de se ligar selectivamente a uma subsequência vizinhas dentro desse gene que contém a mutação de interesse, e, em seguida, iniciar a síntese de um fragmento amplificado, é atribuído a um “segmento separado, curta 3 sequência (que chamamos de” pé “). O pé contém um “nucleótido interrogar” que é complementar ao nucleótido correspondente na sequência alvo mutante, mas não combina com o nucleótido correspondente na sequência alvo de tipo selvagem. Em primers superseletiva, a âncora é separado do pé por, um segmento adicional, relativamente longo desoxirribonucleótidico sequência (que chamamos de “ponte”). A ponte é escolhido de modo a garantir que ele não forma estruturas secundárias e não é complementar à “sequência intermédia” na molécula molde que se junta à sequência alvo de ancoragem para a sequência alvo pé. Por conseguinte, quando o iniciador é hibridado com uma molécula molde, a sequência de ponte no iniciador e a sequência de intervenção no modelo de formar uma “bolha” de cadeia simples que funcionalmente separa a formação eficiente de o híbrido de ancoragem a partir da formação do híbrido pé . Os iniciadores resultantes são bifuncional: sob condições de recozimento, a longo 5 ‘sequência de âncora permite que o iniciador de se ligar de forma eficiente e selectiva para a região genómica de interesse presentes nos fragmentos de ADN alvo, ao passo que a curta sequência 3’ do pé (que possui as sequências de nucleótidos interrogar ), porque fica presa à sequência de âncora pela sequência de ponte, é capaz de formar um híbrido fraco (perfeitamente complementares) com a sequência alvo mutante; Ainda devido à sua curta duração, o pé é improvável para formar um híbrido consideravelmente mais fracos (incompatíveis) com a correspondente sequência de tipo selvagem.

A Fig 1A mostra um exemplo de um iniciador superseletiva ligada à sua sequência alvo mutante. Esta cartilha particular foi projetado para amplificar selectivamente fragmentos de DNA contendo o

BRAF V600E

polimorfismo de nucleotídeo único, cuja presença em células predispõe ao câncer colorretal hereditário sem polipose [19, 20]. Referimo-nos a esta cartilha como “

BRAF V600E

24-14 /14-5: 1: 1″, o que indica que a sequência de âncora é de 24 nucleótidos de comprimento, a sequência ponte é de 14 nucleótidos de comprimento (em frente a um sequência interveniente no molde que também é de 14 nucleótidos de comprimento), e a sequência de pé é de 7 nucleótidos de comprimento, com as sequências de nucleótidos Interrogating localizado na penúltima posição a partir da extremidade de iniciador 3 ‘.

(a) iniciador superseletiva

BRAF V600E

24-14 /14-5: 1: 1 contém uma sequência de 5′-âncora de longo que se liga fortemente com cadeias molde, uma sequência 3′-pé curto que inclui um nucleótido Interrogating que é perfeitamente complementar à o nucleótido correspondente em um modelo mutante (mas não combina com o nucleótido correspondente num molde de tipo selvagem), e uma sequência de ponte que liga a sequência de âncora à sequência de pé, e que é escolhido para não ser complementar para a sequência de intervenção correspondente no cadeia do molde, formando deste modo uma bolha de cadeia simples que separa a função do dispositivo de ancoragem a partir da função de o pé. (B) em tempo real PCR empregando superseletiva primário

BRAF V600E 24-14 /14-5

: 1: 1. Seis reacções iniciado com 10

6

BRAF

modelos do tipo selvagem mais diferentes quantidades de modelos mutantes (10

1, 10

2, 10

3, 10

4 , 10

5 e 10

6) são plotados em azul; uma reação iniciada com apenas 10

6 modelos do tipo selvagem é plotados com uma linha laranja pontilhada; e uma reacção de controlo não contendo nenhum ADN molde é representada graficamente em vermelho. (C) O ciclo de limiar medido para cada reacção que continham modelos de mutantes está representada graficamente como uma função do logaritmo do número de modelos de mutantes inicialmente presentes em cada reacção. A linha laranja pontilhada indica o ciclo limiar da reacção contendo apenas modelos do tipo selvagem.

ensaios de PCR em tempo real, com primers superseletiva

Real-time PCR foram realizadas, cuja única diferença a partir de um tempo real convencional ensaio de PCR foi a substituição do iniciador directo convencional com o

BRAF V600E

iniciador directo superseletiva mostrada na Fig 1A. Estes ensaios monoplex continha um iniciador inverso convencional que estava presente na mesma concentração que o iniciador superseletiva. Prepararam-se oito ensaios de 30 ul de PCR. Sete das reacções continham fragmentos de ADN a partir de 10

6 plasmídeos que possuam o

BRAF

sequência de tipo selvagem e os fragmentos de ADN a partir de qualquer 10

6, 10

5, 10

4, 10

3, 10

2, 10

1, ou 0 plasmídeos que possuem o polimorfismo de nucleotídeo único no

BRAF V600E

sequência mutante. Um oitavo de reacção que não continham fragmentos de ADN serviu como um controlo. Todas as reacções continham o corante intercalante de ADN, SYBR

® verde, cuja intensidade de fluorescência durante a fase de alongamento da cadeia de cada ciclo térmico reflecte o número de produtos de amplificação sintetizados.

Figura 1B mostra os resultados desta experiência . A reacção de controlo que não continham ADN molde não produzem quaisquer falsos produtos de amplificação, tais como dimeros de iniciadores, apesar do comprimento mais longo dos iniciadores superseletiva. A reacção contendo 1.000.000 modelos de tipo selvagem e não há modelos de mutantes foi suprimida numa medida tal que não produzem um número significativo de produtos de amplificação até cerca de 50 ciclos de amplificação foi levada a cabo. No entanto, as seis reacções iniciadas com 1.000.000 modelos de tipo selvagem e números diferentes de modelos de mutantes teve significativamente menos ciclos de amplificação para gerar um número significativo de produtos de amplificação. Quando o ciclo limiar (Ct) de cada uma das seis reacções foi representada graficamente contra o logaritmo do número de modelos de mutantes em cada reacção, o resultado foi uma linha recta (Figura 1C). Esta relação linear inversa entre o logaritmo do número de alvos mutantes originalmente presentes numa amostra e o valor de Ct observado para a amostra que é a marca de ensaios de amplificação exponencial quantitativos [21, 22]. Significativamente, o valor de Ct da amostra contendo 10 modelos de mutantes na presença de 1.000.000 modelos do tipo selvagem era facilmente distinguível do valor Ct gerado pela amostra contendo apenas 1.000.000 modelos de tipo selvagem (mostrados na figura como uma linha laranja pontilhada) .

nestes ensaios, a etapa selectiva ocorre quando um iniciador superseletiva é ligado a um ADN (-) de modelo cadeia que está presente na amostra original a ser analisada. Uma vez que a sequência de pé de um iniciador superseletiva inicia a síntese de um fragmento amplificado, toda a sequência do iniciador superseletiva (incluindo a sequência de ponte “artificial”) é incorporado a este fragmento amplificado (+). Nos ciclos térmicos subsequentes, os produtos de amplificação resultantes são amplificados de forma eficiente no modo normal, com toda a sequência iniciadora superseletiva servindo como um iniciador convencional de longa que é completamente complementar à (-) produtos de amplificação, os quais incluem o complemento da sequência de ponte do iniciador no lugar a sequência de intervenção da que estava presente no molde original (Figura 2)

o passo selectivo ocorre apenas quando um iniciador superseletiva hibrida com um ADN. (-) fragmento matriz presente na amostra. Devido ao pequeno tamanho da sequência de pé, a probabilidade de início de um fragmento amplificado (+) é significativamente maior, se a sequência alvo do pé no (-) fragmento molde é uma sequência mutante completamente complementar, do que se a sequência alvo de o pé no (-) fragmento molde é uma sequência de tipo selvagem incompatíveis. Se ocorrer a (+) síntese amplicão, em seguida, o resultante (+) amplicão serve como um molde para um iniciador inverso convencional, e é eficientemente copiada durante o próximo ciclo térmico, a geração de um (-) amplicão em que o complemento da ponte única sequência que estava presente em superseletiva iniciador é substituído para a sequência de intervenção que estava presente no original (-) fragmento molde. Como resultado, em subsequentes ciclos térmicos, toda a sequência de iniciador é complementar à superseletiva os (-) amplicon fios, e amplificação exponencial ocorre de forma eficiente, e pode ser seguido em tempo real

Optimização da. a concepção de iniciadores superseletiva

as três partes de um iniciador superseletiva servem funções diferentes. A sequência de âncora a 5 ‘é concebido de modo que seja suficientemente longo e forte o bastante de modo que a temperatura de recozimento do ensaio de PCR que se liga à sequência alvo, independentemente de estarem ou não a sequência alvo é do tipo mutante ou selvagem. A “sequência curta de 3 pés, por outro lado, destina-se a ser capaz de se ligar à sequência alvo mutante completamente complementar à temperatura de recozimento do ensaio de PCR, mas não se ligam à sequência de tipo selvagem incompatíveis sob as mesmas condições . O papel da bolha, formado pela sequência de ponte no iniciador e a sequência de intervenção no molde, é dupla: (i) através da separação da sequência de âncora a partir da sequência do pé, a presença da bolha de cadeia simples faz com que o formação do híbrido pé fraco para ocorrer independentemente da formação do híbrido de ancoragem forte; e (ii) amarrados a sequência de pé no iniciador para a sequência alvo potencial no modelo, a probabilidade de que a sequência de pé curto (6, 7 ou 8 nucleótidos de comprimento) será realmente formar um híbrido é marcadamente aumentada. Uma sequência de livre flutuação do tamanho do pé que quase nunca formar um híbrido com uma sequência alvo, sob condições de recozimento de PCR. A fim de melhor compreender o papel desempenhado pelos diferentes segmentos de sequência de primers superseletiva, e a fim de compreender a melhor forma de projetar esses iniciadores de modo que eles são altamente selectivos para qualquer sequência alvo, realizou-se uma série de ensaios de modelo que explorou o melhor projeto da sequência de pé, e o melhor projeto da bolha.

a sequência de tipo selvagem em que o

ocorre BRAF V600E

mutação é rica em AT (3′-TAAAGTG-5 ‘), garantindo assim que os fracos híbrido incompatíveis que ele forma com o pé do

BRAF V600E

24-14 /14-5: 1: 1 superseletiva primário é muito improvável que formam nas condições de recozimento do ensaio de PCR [23], que conduz à supressão significativa da síntese do fragmento amplificado de tipo selvagem (figura 1). No entanto, quando realizados ensaios semelhantes com um primário superseletiva concebido para detectar o polimorfismo de nucleotídeo único no

EGFR

L858R sequência mutante, cuja presença no cancro do pulmão de não-pequenas células prediz resistência a inibidores da tirosina quinase [ ,,,0],24, 25], verificou-se que a sua presença num rico em GC sequência de tipo selvagem (3′-ACCCGAC-5 ‘) resultou em menor supressão da síntese de amplicão de tipo selvagem. Nós, portanto, realizou uma série de experimentos com

EGFR

L858R superseletiva primers desenhos (Fig 3) para otimizar a discriminação entre a sequência mutante e sua sequência selvagem quase idênticos.

A sequência ponte diferente dentro de cada um dos iniciadores superseletiva é mostrado em azul, e as sequências de nucleótidos Interrogating em cada sequência pé é mostrado em vermelho. O

EGFR

primers L858R são organizados em grupos que refletem sua utilização em experiências comparativas. O

BRAF V600E

sequência alvo é de 69 pares de bases de comprimento;

EGFR

L858R sequências alvo estão entre 79 e 87 pares de bases de comprimento, dependendo do iniciador superseletiva que é utilizado; e

EGFR

sequência alvo T790M é de 68 pares de bases de comprimento.

Efeito da variação do comprimento da sequência de pé

Nós exploramos o efeito da redução do período da sequência do pé do iniciador superseletiva para superar a maior probabilidade de que o pé irá formar um híbrido com a sequência rica em GC presente no

EGFR

alvo de tipo selvagem. Realizou-se três conjuntos de ensaios, cada conjunto utilizando um primer superseletiva cuja sequência pé foi de 6, 7 ou 8 nucleótidos de comprimento. Em todos os outros aspectos, a concepção dos iniciadores foi o mesmo: (i) as sequências de nucleótidos interrogar foi localizado na penúltima posição na extremidade 3 ‘de cada um dos pés; (Ii) a sequência de âncora foi de 24 nucleótidos de comprimento; e (iii) a sequência de ponte e a sequência de intervenção foram cada 14 nucleótidos de comprimento. As sequências destes três iniciadores (

EGFR

L858R 24-14 /14-6: 1: 1;

EGFR

L858R 24-14 /14-5: 1: 1, e

EGFR

L858R 24-14 /14-4: 1: 1) são mostrados na Figura 3. Cada conjunto de ensaios de PCR foi iniciado com diferentes quantidades de molde mutante (10

6, 10

5, 10

4, 10

3, 10

2, e 10

1 cópias) na presença de 10

6 cópias de molde de tipo selvagem. Os valores de limiar resultantes são representados graficamente como uma função do logaritmo do número de modelos de mutantes inicialmente presentes (Figura 4A).

A linearidade da relação entre o ciclo limiar e o logaritmo do número inicial de modelos de mutantes presente em reacções contendo 10

6 modelos de tipo selvagem e diferentes quantidades de molde mutante foi determinada por ensaios de PCR iniciada com diferentes modelos de iniciadores superseletiva. reações (A) PCR iniciado com

EGFR

L858R superseletiva primers que possuem sequências de pés de comprimento diferente. reações (B) de PCR iniciado com

primers EGFR

L858R superseletiva que formam bolhas simétricas de circunferência diferente.

Os valores Ct obtidos com o iniciador possuindo o menor comprimento do pé (seis nucleotídeos, 4: 1: 1) toda a queda em uma linha reta, o que demonstra que, embora o

EGFR

sequência alvo é GC rica, tão poucos como 10 modelos mutantes poderia ser quantificada sem interferência das 1.000.000 modelos do tipo selvagem que estavam presentes. Os iniciadores que possuem comprimentos mais longo do pé (sete nucleótidos, 5: 1: 1; ou oito nucleótidos, 6: 1: 1), no entanto, levou a uma divergência da linearidade quando os alvos mutantes são mais raro, devido a uma supressão insuficiente de síntese amplicão sobre as abundantes modelos do tipo selvagem. Estes resultados demonstram que mais curtos comprimentos de pé, embora diminuindo a abundância de equilíbrio de híbridos pé, resultando em atrasos mais longos antes do ciclo de limiar é alcançado, levar a selectividade melhorada. Do ponto de vista termodinâmico, a selectividade melhorada em comprimentos mais curtos do pé é devido à maior relação entre a abundância de equilíbrio de híbridos mutantes pé perfeitamente complementares em comparação com a abundância de equilíbrio de híbridos de pé do tipo selvagem que não combinam.

efeito da variação a localização do nucleótido Interrogating

também investigou o efeito da variação da localização do nucleótido Interrogating na sequência de pé sobre a capacidade do iniciador de discriminar modelos de mutantes a partir de moldes do tipo selvagem. Realizou-se uma série de ensaios de PCR em que seis primers superseletiva diferentes foram utilizados, cada um possuindo um nucleótido Interrogating em uma posição diferente dentro de uma sequência pé de 7 nucleótidos de comprimento. Os comprimentos da sequência de âncora, sequência de ponte, e sequência interveniente foram mantidas a 24, 14, e 14 nucleótidos, respectivamente. As sequências destes seis

EGFR

L858R iniciadores são mostrados na Fig 3. Duas reacções foram levadas a cabo com cada iniciador, uma iniciada com 1.000.000 cópias de molde mutante, e um iniciadas com 1.000.000 cópias de molde de tipo selvagem. Os ciclos de limiar que foram observadas são listados na Tabela 1. Os resultados mostram que a janela de discriminação (ΔCt) entre o ciclo de limiar para o mutante e o ciclo de limiar para o tipo selvagem é maior quando a localização do nucleótido é mais próximo de Interrogating do iniciador a 3 ‘. Porque existe apenas uma pequena diferença na ΔCt entre o iniciador cujo nucleótido interrogar foi localizada na extremidade 3 ‘do pé (ΔCt = 18,8), e o iniciador, cujo nucleótido interrogar foi localizado na penúltima posição da extremidade 3’ do pé (ΔCT = 18,2), conclui-se que a colocação do nucleótido Interrogating em qualquer posição funciona bem. Uma vez que as sequências de nucleótidos de interrogação na penúltima posição da extremidade 3 ‘do pé não forma um par de bases com o nucleótido correspondente na sequência de tipo selvagem, em condições de recozimento de PCR, as sequências de nucleótidos 3’-terminal do pé é muito improvável para formar um par de bases com o seu nucleotídica complementar correspondente na sequência de tipo selvagem.

efeito da variação da circunferência da bolha

também investigou o efeito da variação da circunferência a bolha de cadeia simples que funcionalmente separam o híbrido âncora do híbrido pé (ver Figura 1).