Abstract

Em estudos anteriores, parasporin-2Aa1, originalmente isolada de

Bacillus thuringiensis

A1547 estirpe, foi demonstrado que é citotóxica contra células de cancro humano específico, embora os mecanismos de acção não foram estudados. No presente estudo, descobrimos que proteinase K proteína ativada parasporin-2Aa1 isolado a partir de um romance

B

.

thuringiensis

tensão, 4R2, foi citotóxico especificamente para endometrial, cólon, fígado, colo do útero, mama e câncer de próstata. Ele mostrou nenhuma toxicidade contra células normais. Após o tratamento com proteinase K-activado parasporin-2Aa1, alterações morfológicas foram observadas e análise de Western blot revelou a clivagem de poli (ADP-ribose) polimerase, caspase-3 e caspase-9 em linhas celulares de cancro exclusivamente, indicativa de morte celular programada, apoptose. As análises de citometria de fluxo, utilizando iodeto de propídio e anexina V, assim como um caspases 3/7 ensaio confirmou a indução de apoptose. Análises adicionais foram realizadas para estudar os percursos de sobrevivência, incluindo AKT, XIAP, ERK1 /2 e PAR-4, um conhecido indutor da apoptose. Estes resultados indicam que parasporin-2Aa1 é uma proteína citotóxica selectiva que induz a apoptose em diversas linhagens de células de cancro humano, a partir de diversos tecidos

citação:. Brasseur K, P Auger, Asselin E, Pais S, Côté JC, H Sirois (2015) Parasporin-2 a partir de um novo

Bacillus thuringiensis

4R2 Strain Induz caspases activação e apoptose em células cancerosas humanas. PLoS ONE 10 (8): e0135106. doi: 10.1371 /journal.pone.0135106

editor: Ferenc Gallyas, Jr., da Universidade de Pecs Medical School, HUNGRIA

Recebido: 09 de abril de 2015; Aceito: 16 de julho de 2015; Publicação: 11 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Brasseur et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo grupo de pesquisa UQTR interno. Kevin Brasseur era titular de uma bolsa de doutoramento da Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Eric Asselin é titular da Canada Research Chair em molecular gineco-oncologia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Bacillus thuringiensis

é uma bactéria Gram-positivas que produz inclusões parasporais cristalinas durante a esporulação. Estas inclusões são feitas de proteínas, as Ô-endotoxinas. Eles são classificados em duas famílias, o cristal (Cry) e as proteínas citolíticas (Cyt) codificadas pelo

chorar

e

sentar

genes, respectivamente [1,2]. As proteínas Cry têm sido extensivamente estudados desde 1970, devido às suas actividades insecticidas específicos contra lepidópteros, coleópteros e dípteros [3]. Após a ingestão por um insecto susceptível, as inclusões parasporais são solubilizados no intestino médio do insecto alcalina, as protoxinas Cry são libertados e depois processado por proteases intestinais para produzir proteínas toxinas activadas. Estes ligam-se a receptores específicos localizados na membrana das células epiteliais do intestino, levando a formação de poros e, finalmente, a morte de insectos [1,4].

O sucesso no desenvolvimento e utilização de

B

.

thuringiensis

baseados em formulações para o controlo de pragas de insectos levou ao isolamento de milhares de novas estirpes e centenas de proteínas Cry agora têm sido caracterizadas em várias extensões [5]. Vários estudos têm demonstrado que as proteínas Cry não insecticidas são mais amplamente distribuído do que as proteínas insecticidas Cry [6]. Isto levou à pesquisa de potencialmente novas atividades biológicas das proteínas Cry não insecticidas. Na sequência de uma grande seleção, algumas proteínas Cry não insecticidas e não-hemolíticas mostraram atividade citotóxica contra células cancerosas humanas e estes novos

B

.

thuringiensis

toxinas foram chamadas parasporins [7,8]. Até agora, seis famílias de parasporins, PS1 -PS6, foram identificados [9]. Cada parasporin família apresenta espectro e mecanismo de ação contra as células cancerosas humanas específicas.

Parasporin-2Aa1 (PS2Aa1, também classificado Cry46Aa1) produzido pelo

B

.

thuringiensis

serovar

Dakota

A1547 estirpe tem sido intensamente estudado por sua ação tóxica em células cancerosas [9-11]. Quando activados por proteinase K, PS2Aa1 é pelo menos 400 vezes mais tóxico para a linha de células de cancro humano HepG2 (cancro do hepatócito humano) do que para a linha celular humana normal HC (hepatócito humano normal) e linha celular de cancro humano HeLa (humano de colo uterino cancro) [12]. Em células HepG2, a toxina monomérica parece ligar-se a uma proteína do receptor desconhecido localizado na jangada lipídica [13]. Uma vez ligado ao receptor, PS2Aa1 oligomerizes para permeabilizar a membrana levando à formação de poros [11,12]. Uma proteína ancorada glicosilfosfatidilinositol (GPI) parece estar envolvido pela ação citocida eficiente dos PS2Aa1 [13]. Pore ​​formação resulta em alterações das estruturas do citoesqueleto, a fragmentação dos organelos, alterações da morfologia das células, tais como células inchaço e finalmente lise [11] célula. O modo da morte celular parece ser não-apoptótica mas esta hipótese não foi confirmada [11-13]. Assim, a caracterização adicional dos eventos intracelulares envolvidos durante a morte celular PS2Aa1 induced- era obrigatória para confirmar ou não a apoptose estava envolvido.

No presente estudo, um adicional de

B

.

thuringiensis estirpe

chamado

Bt

4R2 que contêm o gene que codifica a proteína Cry46Aa1 (PS2Aa1) foi estudado para identificar os mecanismos envolvidos na indução de morte celular citocida-dependente. Descobrimos que PS2Aa1 foi muito citotóxica para muitas células cancerosas

in vitro

. Para explorar ainda mais o mecanismo usando células cancerosas selecionados a partir de tecido diferente (câncer HepG2-hepatócito, o câncer de PC-3-próstata e câncer de MCF-7-mama), descobrimos que a morte celular apoptose estava ocorrendo através de caspases e poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) clivagem. Nós também descobrimos que PS2Aa1 mostra muito baixa toxicidade para as linhas de células normais (Iosé-144, HIESC, HIEEC e MCF-10A).

Apoiamos ainda a hipótese de indução de apoptose com a identificação de vários inibição da via de sobrevivência incluindo AKT , XIAP, ERK1 /2 e a indução do supressor de tumor PAR-4 após o tratamento com PS2Aa1. Nós também descobrimos que a inibição da via /AKT Pi3K em combinação com a toxina aumenta, de uma forma sinergética, a eficiência de PS2Aa1 para induzir apoptose em células de cancro. Assim, PS2Aa1 parece ser uma regulação da apoptose toxina que matam as células discriminar em células cancerosas humanas diferentes.

Materiais e Métodos

bacteriana tensão e cultura da mídia

B

.

thuringiensis

serovar

Dakota

estirpe 4R2 foi utilizado neste estudo. Foi obtida a partir do

Bacillus

Genetic Stock Center (Ohio State University, Columbus, OH, EUA). As células bacterianas foram cultivadas a 30 ° C em agar nutriente a partir de Sigma-Aldrich (St-Louis, MO, EUA) a um pH de 7,1.

Células e condições de cultura

A linha de células de cancro humano HepG2 hepatócitos (HB-8065), linha celular de cancro da próstata humano PC-3 (CRL-1435), linha celular de adenocarcinoma colo-rectal epiteliais humanas Caco-2 (HTB-37), linha celular de adenocarcinoma colo epitelial humano HeLa (CCL-2), útero humano endométrio linha celular de adenocarcinoma HEC-1A (HTB-112), linha celular de adenocarcinoma do útero endométrio humano KLE (CRL-1622), linha celular de adenocarcinoma da mama humano MDA-MB231 (HTB-26), linha celular de cancro da mama humano MCF-7 (HTB -22), células epiteliais humanas não tumorigénicas MCF-10A (CRL-10317), epitelial linha celular de adenocarcinoma do ovário humano OVCAR-3 (HTB-161) e linha celular de adenocarcinoma do ovário humano SKOV-epitelial 3 (foram obtidos HTB-77) a partir da American Type Culture Collection (ATCC). linhagem humana imortal não tumorigénica superfície do ovário células epiteliais Iosé-144 foi gentilmente cedido pelo Dr. David Hunstman (British Columbia Cancer Research Center, Vancouver, BC, Canadá). imortais células do estroma endometrial humanos HIESC e células epiteliais humanas imortais endometriais HIEEC eram um presente amável e produzido por Dr. Michel Fortier (Centre Hospitalier de l’Université Laval, Quebec City, QC, Canadá) [14]. ovário humano células de carcinoma A2780 foram gentilmente cedidas pelo Dr. G. Peter Raaphorst (Ottawa Regional Cancer Center, Ottawa, ON, Canadá). endometrial linha de células de adenocarcinoma humano Ishikawa foi gentilmente cedido pelo Dr. Samuel Chogran (Université de Montréal, Montreal, QC, Canadá). HepG2, PC-3, as células HIEEC e HIESC linhas foram mantidas em meio RPMI 1640 contendo soro fetal bovino a 10% e 50 ug /ml de gentamicina. linhas de células OVCAR-3 e MCF-7 foram mantidas em meio RPMI 1640 contendo soro de crescimento de bovino 10% e 50 ug /ml de gentamicina. A linha celular MDA-MB-231 foi mantida em meio RPMI 1640 contendo soro de crescimento bovino a 5% e 50 ug /ml de gentamicina. linha celular de HEC-1A foi mantido em meio de McCoy com soro de crescimento bovino a 5% e 50 ug /ml de gentamicina. A linha de células SKOV-3 foram mantidas em meio de McCoy com soro de crescimento de bovino a 10% e 50 ug /ml de gentamicina. HeLa, linhas de células de Ishikawa e A2780 foram mantidas em meio DMEM-F12 contendo soro de crescimento bovino a 2% e 50 ug /ml de gentamicina. A linha de células MCF-10A foi mantida em meio DMEM-F12 contendo 5% de soro fetal de crescimento, 20 ng /mL de EGF, 0,5 mg /ml de hidrocortisona, com 100 ng ml de toxina /cólera, 10 ug /ml de insulina e 1X penicilina-estreptomicina. A linha celular KLE foi mantida em meio DMEM-F12 sem soro contendo HEPES crescimento de bovino a 10% e 50 ug /ml de gentamicina. A linha celular Caco-2 foi mantida em meio DMEM-F12 contendo soro de bovino fetal a 10% e 50 ug /ml de gentamicina. A linha celular Iosé-144 foi mantida em meio MCDB105 contendo soro fetal bovino a 10% e 50 ug /ml de gentamicina. Todas as células foram mantidas a 37 ° C com 5% de CO

2.

Isolamento total DNA

O DNA total de

B

.

thuringiensis

4R2 foi isolado a partir de uma cultura durante a noite 5mL usando DNA QIAmp mini-sangue kit (Qiagen, Toronto, ON, Canadá), de acordo com as instruções do fabricante para a extração de DNA bacteriano.

amplificação PCR

os iniciadores utilizados neste estudo foram projetados em nosso laboratório a partir do

chorar

sequência de nucleotídeos do gene 46Aa1. Os iniciadores para a amplificação por PCR foram as seguintes:

Bt

4R2-2F: 5′-TAACCGGAGGGCTTCAAG -3 ‘(sentido) e

Bt

4R2-1R: 5′-TAATTCCCCCATTTTGGG -3′ (anti-sentido ). De PCR foram conduzidas num Applied Biosystems 2720 termociclador (Life Technologies, Ottawa, ON, Canadá). As reacções de PCR foram realizadas num volume de 50 uL contendo 200 uM de cada desoxinucleósido-trifosfatos (dNTP), tampão de PCR 1X, cada um dos iniciadores 0,5μM, 100 ng de ADN e 1,25 unidades de polimerase de ADN de Taq. Todos os reagentes de PCR foram da New England Biolabs (Ottawa, ON, Canadá). O PCR foi realizado por um passo de desnaturação inicial a 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos a 94 ° C durante 45 s, 50 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 2 minutos e uma extensão final a 72 ° C durante 7 min. Os produtos de PCR foram tamanho separados num gel de 1% de agarose e visualizados utilizando SYBR-Safe (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) mediante coloração de transiluminação UV.

sequenciação de ADN

amplicons foram purificados utilizando o Mini Elute PCR Purification Kit da Qiagen. As reações de PCR purificados foram resolvidos em um 3130XL Genetics Analyser (Applied Biosystems) no Ibis Plate-forme d’Analyses Génomiques (PAG) de l’Université Laval (Quebec City, QC, Canadá). Ambas as cadeias da sequência de ADN foram sequenciadas: A sequência de 940pb foi comparada utilizando a ferramenta de Explosão-N (Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia; www.ncbi.nim.nih.gov)

Preparação de proteínas ativadas parasporais

Bacillus thuringiensis estirpe

4R2 foi cultivada em placas de agar nutriente, incubadas durante 4 dias a 30 ° C até a lise das células. As células foram colhidas a partir das placas e lavada duas vezes com água destilada estéril. O sedimento contendo a proteins- esporos-cristais foi solubilizado em 500 ul de tampão de solubilização que contém 56mm de Na

2CO

3 (pH 11,4) e 11 milímetros de ditiotreitol (DTT) durante 1 h a 37 ° C. O material insolúvel foi sedimentado por centrifugação a 13 200 rpm durante 2 minutos e o sobrenadante foi passado através de um filtro de membrana de 0, 22μm. 250 � do filtrado foi transferido para um tubo de centrífuga estéril 1,5mL e o pH foi ajustado para 8 com 1 M de Tris-HCl (pH 4,98).

As proteínas solubilizadas foram digeridas com proteinase K, quer (concentração final em 185μg /mL) ou com tripsina (concentração final de 300 � /mL) durante 1 h a 37 ° C. fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) foi adicionado (concentração final 1 mM) para parar o processamento proteolítico. Para confirmar a presença das proteínas parasporais, a análise de SDS-PAGE foi realizada como descrito noutro local [15] utilizando 4% de gel de empilhamento e 12% gel de separação. Após a electroforese, o gel foi corado com 0, 1% de azul de Coomassie R-250 (Sigma-Aldrich). A concentração de proteína foi determinada com o Bio-Rad DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canadá).

Ensaio de citotoxicidade

A actividade antiproliferativa de

B

.

thuringiensis

4R2 proteínas de toxina foi avaliada utilizando o ensaio MTT [16,17]. Resumidamente, as placas foram semeadas com 180μL de células normais e cancerosas em suspensão (por HIESC, 14 000; Iosé-144, 12 000; HIEEC, 15 000; Ishikawa, 16 000; HeLa, 16 000; KLE, 14 000; HEC- 1A, 12 000; Caco-2, 20 000; PC-3, 16 000; HepG2, 20 000; A2780, 16 000; OVCAR-3, 20 000; SKOV-3, 14 000; MCF-7, 16 000; MDA-MB231, 12 000 e MCF-10A, 8000) em meio usando 96 poços placas. As placas foram incubadas a 37 ° C, 5% de CO

2 durante 24 h. Recém solubilizado e ativado

B

.

thuringiensis

4R2 proteínas toxinas (com proteinase K ou tripsina) em tampão de solubilização foram diluídas em meio fresco, e alíquotas de 100 ul contendo concentrações crescentes de proteínas de toxina (0μg /ml a 20 ug /mL) foram adicionados e as placas foram incubadas durante mais 24h. A concentração final do tampão de solubilização (56mm de Na2CO3, 11 mm de DTT, 100 ug /ml de proteinase K (ou 30 mg /mL de tripsina) e PMSF 1 mM) no meio de cultura foi de 8% e foi mantida constante em todas as experiências. Depois de 24h, 10 � de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) (5 mg /ml em PBS) foram adicionadas aos poços. Quatro horas mais tarde, foram adicionados 100 uL da solução de solubilização (sulfato de dodecilo de sódio a 10% (SDS) em HCl 0,01 M) e as placas foram incubadas durante a noite (37 ° C, 5% de CO

2). A densidade óptica foi lida utilizando um BMG Fluostar Optima (BMG Labtech Inc., Durham, NC, EUA) a 565nm. As leituras obtidas a partir de células tratadas foram comparadas com as medições a partir de placas de células de controlo fixos no dia de tratamento; e a percentagem de inibição do crescimento celular foi calculada para cada proteína toxina (proteinase K, tripsina activada ou activada). As experiências foram realizadas em triplicado. Os ensaios foram considerados válidos quando o coeficiente de variação para um determinado conjunto de condições e dentro da mesma experiência foi 10%.

A microscopia de luz observação

Para a observação das alterações morfológicas, normal (HIESC) e as células cancerosas (PC-3, MCF-7 e HepG2) foram observados após tratamento com proteinase 24h K activado proteínas de toxina a 1 ug /ml (MCF-7) ou 2 ng /mL (HIESC, PC-3 e HepG2). 10X e 20X ampliações foram usados ​​com um Olympus (modelo BX60) microscópio de luz (Carsen Group, Markham, ON, Canadá).

Anticorpos e reagentes

O Na

2CO

3, DTT, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio, HCl, SDS, PMSF, Tris-HCl e proteinase K foram todos obtidos a partir de Sigma-Aldrich. Todos os anticorpos primários foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Bervely, MA, EUA) excepto para β-actina (Sigma-Aldrich). O anticorpo secundário, de cabra conjugado com HRP anti-coelho foram compra a partir de Bio-Rad Laboratories. Anexina V /kit de apoptose PI foi adquirido de Invitrogen. MEK ½ inibidor, U0126, foi obtido a partir de Cell Signaling Technology e inibidor de PI3K, wortmanina, foi obtido a partir de Sigma-Aldrich.

Western blot

PS2Aa1 células tratadas foram lavadas com PBS e submetidas a lise em inibidores da protease frio tampão RIPA contendo (completo da Roche Applied Science, Laval, QC, Canadá) e inibidor de fosfatase (PhosSTOP da Roche Applied Science) seguido por três ciclos de congelamento e descongelamento. Quantidades iguais de lisados ​​de células, determinada usando ensaio de proteína Bio-Rad DC, foram separadas em géis de poliacrilamida (10-14%) e transferidos em membranas de nitrocelulose (Bio-Rad). As membranas foram bloqueadas em 5% de leite, PBS 1X, 0,06% de Tween 20 durante 1 h à temperatura ambiente, sondada com o anticorpo primário, lavadas em PBS 1X, 0,06% de Tween 20, e incubadas com anticorpo secundário de rábano silvestre conjugado com peroxidase (Bio-Rad ). A detecção foi realizada utilizando substrato SuperSignal Oeste Femto (Thermo Fisher Scientific, Nepean, ON, Canada), como descrito pelo fabricante, utilizando sistemas UVP bioimaging.

Medição das células de V /PI anexina

FITC Anexina V /Dead celular Kit de apoptose (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, EUA) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células tratadas foram recolhidas, lavadas com PBS e diluiu-se em 1X tampão de ligação a Anexina (100 ul). Para cada amostra, 5 L de Anexina V e 2 ul de iodeto de propídio (PI) foram adicionados à suspensão de células e incubaram-se durante 15 min à temperatura ambiente. Um volume adicional de 100 ul de tampão de ligação de anexina foi adicionada a cada amostra para um total de 200 ul. As amostras foram analisadas (10 000 eventos), utilizando um fluxo Beckman Coulter citómetro Cytomics FC500. As análises foram realizadas utilizando software de análise CXP (Beckman Coulter, Mississauga, ON, Canadá).

Caspase 3-7 ensaio

Para medir a actividade específica da caspase 3 e 7, um kit de ensaio luminescente foi utilizado chamado caspase-Glo ensaio 3/7 (Promega, Madison, WI, EUA)). Este ensaio proporciona um proluminescent caspase-3/7 contendo uma sequência de substrato (DEVD) específico para a caspase 3 e 7. Se as caspases 3 e /ou 7 estão activos, o substrato é clivado e aminoluciferin será emitida. Resumidamente, as placas foram semeadas com 180μL de células normais e cancerosas em suspensão (por HIESC, 14 000; PC-3, 16, 000; HepG2, 20 000 e MCF-7, 16, 000) em meio. As placas foram incubadas a 37 ° C, 5% de CO

2 durante 24 h. Recém solubilizado e ativado

B

.

thuringiensis

4R2 proteínas toxinas (com proteinase K) em tampão de solubilização foram diluídas em meio fresco. Em seguida, alíquotas de 100 ul contendo a toxina, com ou sem inibidores, foram adicionados e as placas foram incubadas durante mais 24h. A concentração final do tampão de solubilização (56mm de Na2CO3, 11 mm de DTT, 100 ug /ml de proteinase K e PMSF 1 mM) no meio de cultura foi de 8% e foi mantida constante em todas as experiências. Após 24 h, 100 uL de caspase-Glo 3/7 reagente foi adicionada aos poços. Uma hora mais tarde, a densidade óptica foi lida utilizando um BMG Fluostar Optima (BMG Labtech Inc., Durham, NC, EUA). Leituras obtidas a partir de células tratadas foram comparadas com as medições das células de controle usando os aumentos de dobra. . Cada experimentos foram realizados em duplicado

Análise estatística

Os dados foram submetidos a um one-way análise de variância ou o teste t de Student (software PRISM versão 5.00; GraphPad, San Diego, CA ). As diferenças entre grupos experimentais, quando se utiliza uma análise de variância, foram determinadas pelo teste de Tukey. A significância estatística foi aceita quando p 0,05.

Resultados

Caracterização da proteína cristalina citotóxica B. thuringiensis 4R2

A análise SDS-PAGE das proteínas de cristal solubilizados revelou uma grande banda estimada em 37 kDa, correspondendo a a forma nativa da proteína Cry46Aa1 (Fig 1). Em experiências de PCR com iniciadores específicos Cry46Aa1, um produto de amplificação 940bp foi obtido. As análises da sequência de nucleótidos utilizando ferramentas BLAST revelou que a sequência de nucleótidos foi de 100% de homologia com a proteinase K activado sequência de nucleótidos Cry46Aa1 (NCBI número de acesso AB099515.1). Devido a esta identidade de sequência de nucleotídeos, os 37 kDa proteínas de cristal de

B

.

thuringiensis

4R2 foi nomeado PS2Aa1

(A) Pista 1:. Marcador de peso molecular; pista 2: solubilizado pró-PS2Aa1. sequência (B) Nucleotídeos do

chorar

fragmento do gene 46Aa1 obtido na sequência de amplificação com o par de primers Bt4R2-2F e Bt4R2-1R.

citotoxicidade do PS2Aa1 em câncer e células normais

a tripsina (usado como tratamento controle) e proteínas de cristal activado proteinase K de

B

.

thuringiensis

4R2 (PS2Aa1) foram examinados para citotoxicidade contra células humanas normais e cancerosas usando MTT Ensaio para um 24 h de tratamento (Fig 2). Nenhuma actividade citocida foi observada após tratamento com tripsina das proteínas cristalinas solubilizadas por qualquer das linhas de células. Entre as células testadas, proteínas de cristal activado proteinase K foram altamente citotóxico para as células HepG2, as células MCF-7, a KLE, HEC-1A, MDA-MB231 e células PC-3, enquanto sendo moderadamente citotóxico para as células Caco-2. Nenhuma actividade citotóxica significativa foi observada em células A2780, OVCAR-3, SKOV-3 e linhas de células de cancro HeLa. Nenhuma das linhas celulares normais (Iosé-144, HIEEC, HIESC e MCF-10A) mostrou efeitos citotóxicos. A citotoxicidade das proteínas formadoras de cristais era dependente da dose e foi examinada utilizando diluições em série de proteínas. Com base na sua elevada sensibilidade para PS2Aa1, HepG2, foram seleccionadas linhas de células PC-3 e MCF-7 de cancro para outras experimentações. HIESC células foram utilizados como um modelo de linha celular normal para explorar ainda mais os efeitos de PS2Aa1 em células não-cancerosas.

As células normais humanas cultivadas (A) e as células humanas de cancro cultivadas (B) (2 X 10

4 células) foram pré-incubadas a 37 ° C durante 20 h; a toxina tratada com tripsina (○) ou proteinase K (●) foi adicionado (concentração final, 0.3μg /mL a 20 ug /ml) incubadas durante mais 24 horas. A proliferação celular foi testada usando MTT.

As alterações morfológicas nas células cancerígenas induzida por PS2Aa1

Para estudar o efeito do PS2Aa1, as concentrações de 1 ug /ml a 2 ug /mL foram usados ​​baseados na experiência anterior, a viabilidade celular. Seguindo o tratamento por proteínas activadas PS2Aa1 proteinase K em HepG2 (2 ug /mL), PC-3 (2 ug /mL) e células MCF-7 (1 ug /ml), as características morfológicas das células tratadas foram observados sob microscopia de luz (Figura 3) . encolhimento celular, característica da morte celular apoptótica [18], foi observada apenas em células HepG2, as células cancerígenas MCF-7 e PC-3. No entanto, não houve alterações morfológicas foram observadas em HIESC; confirmando a não citotoxicidade de PS2Aa1 em células normais como anteriormente observados com a experiência com MTT. Não foram observadas alterações morfológicas como de necrose celular inchaço ou formação de bolhas [18].

PC-3 (A), células MCF-7 (B), HepG2 (C) e HIESC células (D) foram tratados com 1 ug /mL ou 2 ug /ml

B

.

thuringiensis

4R2 proteínas toxinas para 24h. Depois de 24h, as células foram observadas por microscopia de luz, com uma ampliação de 10X e 20X. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes.

PS2Aa1 induz a morte celular por mecanismos apoptóticos

para confirmar nossas observações anteriores sobre as alterações morfológicas relacionadas à apoptose ocorre em células cancerosas, realizamos anexina V /iodeto de propídio (PI) coloração em análise das células tratadas. Anexina V tem a capacidade de manchar fosfatidil serina no folheto exterior da membrana plasmática e a sua presença no folheto exterior em vez de o folheto interno é uma característica única da apoptose [19]. Os resultados mostraram que 6h e 24h após o tratamento, PS2Aa1 induzida elevado nível de apoptose em todas as linhas celulares três cancro (Fig 4A-4C) e muito pouco na linha normal do endométrio célula cancerosa HIESC (Fig 4D) Isto está em correlação directa com o MTT Os resultados do ensaio (Figura 2). A maioria das células cancerosas mostrou elevado nível de apoptose depois de 6 horas de tratamento, indicando a elevada eficiência de PS2Aa1 na indução de apoptose.

PC-3 (A), células MCF-7 (B), HepG2 (C) e HIESC (D células) foram tratados com

B

.

thuringiensis

4R2 proteínas toxinas (1 ug /mL (B) ou 2 ug /mL (A, C, D)) durante 24 h. Anexina V e coloração de PI foi detectada por análise FACS. Os resultados são a média ± S.E.M. de três experiências independentes. * P . 0,05 em comparação com células falsamente tratados correspondente

Porque PS2Aa1 induz alta toxicidade e grande quantidade de células são PI positiva apenas após 24h, decidimos realizar um ensaio de caspase-3/7 para verificar Se PS2Aa1 activa especificamente as caspases -3 e -7 para induzir apoptose (Fig 5). Após o tratamento de 24 horas, PS2Aa1 aumentou significativamente a actividade de ambas as caspases -3 e -7 em PC-3 e linhas de células de cancro HepG2 (Figura 5A e 5C). MCF-7, linha celular de cancro da caspase-3 é deficiente e considerando esta deficiência, única da caspase-7 pode ser medida por este ensaio nesta linha de células [20]. Um aumento significativo da actividade da caspase pode ser observada em células MCF-7, linha celular de cancro que indica que a apoptose induzida é compensada pela caspase-7, implicado no mecanismo de acção do PS2Aa1 (Fig 5B). Baixo nível de morte celular foi observada anteriormente em HIESC linha celular normal de anexina V /PI citometria de fluxo e, consequentemente, não houve aumento significativo da actividade da caspase-3/7 pode ser medida pelo ensaio de caspase em HIESC (Figura 5D).

PC-3 (A), células MCF-7 (B), células HepG2 (C) e (D) HIESC foram tratados com

B

.

thuringiensis

4R2 proteínas toxinas (2 ug /mL) durante 24 h. O nível de caspases-3/7 foi medido utilizando Caspase-Glo 3/7 ensaio. As células MCF-7 (B) são de Caspase-3 e somente deficiente caspase-7 pode ser medida. * P 0,05 e ** P . 0,01 em comparação com células falsamente tratados correspondente

Para investigar mais profundamente a indução de apoptose, também medidos diferentes marcadores de apoptose por análise de Western blot, tais como a caspase-3 clivada, 8, -9 e PARP clivada. Os nossos resultados mostraram que, tão cedo quanto 6 horas de tratamento com PS2Aa1, a clivagem de caspase-3 /activação foi observado em ambas as células PC-3 de cancro e HepG2 (Figura 6A e 6C; MCF-7 ser caspase-3 negativo). Uma vez activada, a caspase-3 é uma caspase efectora e pode fazer a clivagem proteolítica de várias proteínas, tais como a proteína de reparação de PARP, em seguida, levando a morte celular por apoptose. No entanto, a caspase-3 requer caspases iniciadoras a partir de qualquer via intrínseca ou extrínseca a ser clivado /activado [21,22]. Por análise de Western blot, medimos clivada da caspase-8 (via extrínseca) e caspase-9 (via intrínseca) e constatou-se que apenas a caspase-9 clivagem /activação estava presente em todas as linhas celulares três cancro (Fig 6A-6C), enquanto não foi observada a clivagem de caspase-8 /a activação (dados não mostrados). Em correlação com a clivagem de caspases, PS2Aa1 também induziu a clivagem de PARP /degradação em todas as três linhas de células de cancro (Fig 6A-6C). Clivados PARP clivada e os níveis da proteína caspase-3 são baixos 24h após o tratamento da toxina na linha celular de cancro HepG2 (Figura 6C). Isto é provavelmente porque a maior parte das células foram mortas após 6 h ( 75%). Após 24 horas de tratamento, quase todas as células HepG2 foram flutuante e mortos ( 92%). As proteínas foram provavelmente todos degradada por causa da ação de proteases em apoptose tardia levando a proteína maciça e destruição celular [23]. Isto é ainda suportado pelos dados de MTT (Fig 2B) e anexina V /PI citometria de fluxo (Fig 4C e 4H), que indicam que quase 100% das células estão mortas neste concentração após 24h de tratamento que explica a situação observada. É igualmente de notar que nenhum destes marcadores de apoptose foi observada na linha celular normal HIESC (Figura 6D), indicando que não foi a apoptose que ocorre utilizando a dose máxima de PS2Aa1 (2 ug /ml), previamente utilizado em linhas celulares de cancro. As bandas de Western blot visíveis no HIESC linha de células normais são o nível basal dos diferentes marcadores, observável apenas após alta exposição para revelar as bandas de proteína apropriadas (Fig 6D). Isto está em concordância com a ausência de actividade de apoptose e as caspases-3/7 observada nas experiências anteriores para a linha celular normal HIESC (Figs 4 e 5).

(A), PC-3, MCF-7 ( B), células HepG2 (C) e (D) HIESC foram tratados com

B

.

thuringiensis

4R2 proteínas toxinas (1-2μg /mL) durante 6 h e 24 h. Os níveis de proteínas clivadas específicos de apoptose caspase-3, caspase-9 e PARP foi determinada em células tratadas utilizando análise de Western blot. As células MCF-7 (B) são de Caspase-3 deficiente. p-actina foi utilizado como um controlo de carga. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes.

Regulamento de diferentes vias de sobrevivência e morte em resposta a PS2Aa1

Todos os experimentos anteriores demonstram que a toxina PS2Aa1 pode induzir a morte celular em células cancerosas através da indução de apoptose. A fim de investigar o possível envolvimento de outras vias de sobrevivência /morte, realizamos experimentos adicionais sobre as células cancerosas da próstata PC3 usando análise de western blot. Em primeiro lugar, investigou a via de sobrevivência AKT conhecido por ser um importante mecanismo de sobrevivência para as células cancerosas. As proteínas da via do AKT são frequentemente alterada no cancro e o sinal de alta sobrevivência destas mutações são muitas vezes responsáveis ​​pela resistência das células cancerosas a agentes terapêuticos e tratamentos a impossibilidade para induzir apoptose [24-28]. Nossos resultados mostraram um alto decréscimo de fosforilada (o ativo forma) AKT na serina 473. nível total AKT, também foi reduzida, sugerindo que também é em parte responsável pela diminuição do nível de p-AKT. XIAP, um inibidor da caspase e uma ubiquitina ligase de PTEN (um regulador negativo da fosforilação de AKT) foi também diminuída (figura 7A) [29]. ERK1 /2, as proteínas da via de MAPK, requer a activação /fosforilação para induzir apoptose em células de cancro após tratamento com cisplatina ou outros estímulos de apoptose [30-32]. Como observado em tratamentos cisplatina, PS2Aa1 induziu um aumento de ERK1 2 fosforilação /at 24h após o tratamento enquanto o nível total de ERK foi ficar estável (Fig 7B). Isto sugere que a activação de ERK é necessária para a indução de apoptose. Finalmente, descobrimos recentemente um novo mecanismo relacionado com o supressor de tumor PAR-4, a qual é clivada pela caspase-3 em cima estímulos de apoptose e é capaz de induzir a apoptose, uma vez clivada [33,34]. Por causa da capacidade PS2Aa1 para activar mecanismos de apoptose, que questionado se PAR-4 clivagem pode estar envolvido na indução de apoptose após tratamento com a toxina. Curiosamente, um fragmento clivado de cerca de 25 kDa apareceu como logo que 6h após o tratamento com PS2Aa1 em correlação completa com a nossa hipótese (Figura 7C). A presença do fragmento clivado PAR-4, normalmente presente apenas em células de cancro que sofrem apoptose, reforça a ideia de que PS2Aa1 é um indutor de apoptose em células cancerosas.

PC-3 células de cancro foram tratadas com toxina Bt 4R2 proteínas (2 ug /mL) durante 6 h e 24 h. /Proteínas Akt (B) ERK (A) e os níveis de proteína de PI3K (C) PAR-4 foram determinados em células tratadas utilizando análise de Western blot.