Abstract

Embora o câncer é uma doença genética, alterações epigenéticas estão envolvidos na sua iniciação e progressão. Estudos anteriores demonstraram que a reprogramação de células cancerígenas do cólon usando OCT3 /4, Sox2, KLF4, e cMyc reduz malignidade do cancro. Portanto, a reprogramação do cancro pode ser um tratamento útil para células de cancro quimio ou radioterapia-resistente. Também foi relatado que a introdução de ribonucleótidos de pequenas dimensões, não codificante endógenos tais como microRNA 302S (MIR) e miR-369-3p ou -5p resultou na indução de reprogramação celular. miRs são menores do que os genes dos factores de transcrição, possivelmente tornando-os adequados para utilização em estratégias clínicas. Portanto, reprogramado células cancerígenas do cólon usando miR-302s e miR-369-3p ou -5p. Isto resultou na inibição da proliferação celular e invasão e da estimulação do fenótipo mesenquimal-a-epitelial em células cancerígenas do cólon. Importante, a introdução dos ribonucleótidos resultou na reprogramação epigenética de eventos de desmetilação de ADN e de modificação de histona. Além disso,

In vivo

administração dos ribonucleótidos em ratinhos induzida a indução de apoptose de células de cancro, a qual envolve a família de proteínas Bcl-2 mitocondrial. O presente estudo mostra que a introdução de miR-302s e miR-369s poderia induzir a reprogramação celular e modulam fenótipos malignas do cancro colo-rectal humana, sugerindo que a entrega adequada de funcionais de pequeno porte ribonucleotídeos pode abrir uma nova avenida para a terapia contra tumores malignos humanos .

Citation: Ogawa H, Wu X, Kawamoto K, Nishida N, Konno M, Koseki J, et al. (2015) MicroRNAs Induzir epigenética reprogramação e suprimir fenótipos maligna das células cancerígenas do cólon humano. PLoS ONE 10 (5): e0127119. doi: 10.1371 /journal.pone.0127119

Editor do Academic: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiológico Monzino, ITALY

Recebido: 19 Janeiro, 2015; Aceito: 10 de abril de 2015; Publicado: 13 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Ogawa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. doações institucionais foram recebidas parcialmente de Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. (https://www.taiho.co.jp/english/), Baseada em Evidências médica (EBM) Research Center (https://ebmrce.co.jp/index.html), Chugai Co., Ltd. (https://www.chugai-pharm.co.jp/english/index.html), Yakult Honsha Co., Ltd. (https://www.yakult.co.jp/english/index.html) e Merck Co., Ltd. (https://www.merck.co.jp/en/index .html). Este trabalho também foi apoiado um Grant-in-Aid para a Investigação Científica do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia (https://www.mext.go.jp/english/; # 23390199, # 25112708, # 25134711, 30253420 #, # 26670604; MM, KM, HI); um Grant-in-Aid do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar (https://www.mhlw.go.jp/english/; # H23-003; M. M., H.I.); um subsídio do Instituto Nacional de Biomedical Inovação (https://www.nibio.go.jp/english/index.html; # 12-4; M. M., H.I.); e uma bolsa da Universidade de Osaka Fundos Drug Discovery (https://www.osaka-u.ac.jp/en/index.html; M. M., H.I.). suportes parciais foram recebidas de Takeda Ciência e Fundação de Investigação Médica (https://www.takeda-sci.or.jp/index.html; MM, HI), a princesa Takamatsu Cancer Research Fund (http: //www.ptcrf.or .jp /Inglês; MM, HI), Suzuken Memorial Foundation (https://www.suzukenzaidan.or.jp; MK), Yasuda Fundação médica (https://www.yasuda-mf.or.jp; NN), pâncreas Research Foundation (https://www.jprf.or.jp/shoreisho.html; KK), Nakatani Foundation (https://www.nakatani-foundation.jp; HI), e Fundação Nakatomi do Japão (https: //www.nakatomi.or.jp/en/index.html; MK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Doações institucionais foram recebidas parcialmente de Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. (http: //www.taiho.co.jp/english/), Evidence Based médica (EBM) Research Center (https://ebmrce.co.jp/index.html), Chugai Co., Ltd. (http: //www. chugai-pharm.co.jp/english/index.html), Yakult Honsha Co., Ltd. (https://www.yakult.co.jp/english/index.html) e Merck Co., Ltd. ( https://www.merck.co.jp/en/index.html); Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Cada célula cancerosa é em grande parte derivado do tronco ou progenitoras células de tecido somático normal, via genética e alterações epigenéticas. Estas alterações inativar crescimento de restrição genes supressores de tumor (ETG) e activar oncogenes promotores do crescimento. células somáticas normais são desenvolvidos a partir de um oócito fertilizado através de um programa epigenética. Notavelmente, a introdução ectópica de genes que codificam definidos, OCT3 /4, SOX2, KLF4, e c-Myc (OSKM), ou OSK, que são expressos exclusivamente em células estaminais embrionárias (CES), induz uma reprogramação completa de células somáticas diferenciadas de volta para células-tronco pluripotentes. Anteriormente mostrou que a introdução de OSKM em células cancerosas epiteliais de órgãos gastrointestinais modula o fenótipo maligno. Os nossos resultados sugerem que a reprogramação pode suprimir a invasão do cancro, resistência à droga, e tumorigenicidade através da re-activação da via p16INK4a supressor de tumor por desmetilação da sequência do promotor [1]. Além disso, um estudo recente rato de fatores OSK transgénicos mostraram que modificações epigenéticas estão envolvidos na iniciação do tumor e desenvolvimento

in vivo

. Este estudo também demonstrou que, em combinação com a inactivação de sinais de ETG, tais como APC mutante, as modificações podem orquestrar alterações epigenética pelo complexo grupo Polycomb ao módulo central de histona H3 em lisina-27 [2]. Tomados em conjunto com os achados anteriores [1-6], alterações epigenéticas, independentemente das causas ou resultados das mudanças genéticas, contribuem para a ocorrência e desenvolvimento de doenças malignas e pode ser atraente para a descoberta de novos alvos terapêuticos contra o câncer humano.

As aplicações terapêuticas que aumentam vias de sinalização endógenas deve ter o mínimo de toxicidade

in vivo

. A este respeito, a descoberta de medicamentos de microRNAs endógenos (miRNAs, miR), ribonucleotídeos não-codificantes de pequeno porte (22 pb em média), são fontes potenciais para estratégias terapêuticas inovadoras [7,8]. Porque miRs maduros sintetizados não se integram no genoma, eles devem exercer as suas funções sem eventos de integração genômica indesejadas e, se combinado com um sistema de entrega de drogas, miRs poderia exercer esses efeitos específicos sobre alvos terapêuticos [7,8].

recentes estudos descoberta miR identificaram grupos críticos, incluindo miR-302s, que aumentam o efeito reprogramação em colaboração com a transferência de fator de transcrição viral mediada [9-12]. Demonstrou-se que um conjunto de três miRs (miR-302s, 369s e miR-miR-200C) seleccionado a partir de numerosas miRs exclusivamente expressa em células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs) /CES, eliciou reprogramação [13]; um papel significativo para miR-367 também foi mostrado [12]. Alegadamente, a introdução de miR-302s induzida tanto a paragem do ciclo celular, interferindo com cinases dependentes de ciclina (CDKs) e desmetilação globais de ADN em cancro do fígado e melanoma

in vitro

[4,5,14]. Aqui, nós estudamos o efeito de miR-302s e miR-369s

in vitro

e

in vivo

. Estes resultados sugerem que a reprogramação cancro utilizando miR-302s e miR-369s pode ser uma opção de tratamento eficaz para a terapia do cancro.

cultura celular

celulares de cancro colorrectal Materiais e Métodos

linhas HT29, DLD-1, células SW480, HCT116, Caco2, Colo201, RKO e Lovo e linha celular de teratocarcinoma NTERA (NTera 2 /cl.D1 [NT2 /D1]) foram obtidos a partir de RIKEN (Tsukuba, Japão). Estas células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Nakalai Tesque, Quioto, Japão) com 10% de FBS (Gibco Life Technologies, Tóquio, Japão) e 500 ug /ml de penicilina-estreptomicina.

A transfecção

miRs específicos e controle negativo (NC) miR usado em

in vitro

e

in vivo

análise foram adquiridos (Gene projeto Inc., Osaka, Japão; S1 Tabela). As células foram transfectadas com miRs específicos e NC miR utilizando lipofecção (LP) ou carbonato de apatite (CA). Em LP, as células foram transfectadas com miRs Imax utilizando Lipofectamina (Invitrogen, Darmstadt, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante.

reprogramação celular

HT29 e células DLD-1 foram transfectadas com 10 nM de cada miR usando CA. As células foram incubadas em meio RPMI-1640 com 10% FBS durante 24 h e transfecção foi repetido cada dois dias durante um total de três vezes. Após a terceira transfecção, as células foram semeadas em Matrigel-revestidas e mitomicina fibroblastos embrionários de ratinho tratado com C (MEF). As células foram cultivadas em meio de cultura de células estaminais embrionárias contendo DMEM /F12 (Gibco Life Technologies, Tóquio, Japão), suplementado com 2 mM de GlutaMax, substituição soro nocaute 20% (Gibco Life Technologies), mM aminoácidos não essenciais 0,1 (NEAA, Gibco Life Technologies), factor de 10 ng /mL de crescimento básico de fibroblastos (bFGF, Wako, Tokyo, Japão), 55 uM de 2-mercaptoetanol (Gibco Life Technologies), 1% de penicilina-estreptomicina, e inibidores químicos, incluindo 0,5 uM A83-01 (Stemgent , Cambridge, MA), 3 uM CHIR99021 (Stemgent), e 0,5 uM PD0325901 (Stemgent), a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. O meio foi mudado a cada dois dias e as células foram mantidas a 37 ° C num 21% de CO

2 incubadora durante mais 21 dias. Durante este período, as células tumorais foram monitorizados para a formação de colónias ES-like. Estes foram escolhidos para análise posterior com fosfatase alcalina (AP) Stain Vivo (500 ×) (Invitrogen) usando um tudo-em-um microscópio de fluorescência (BZ-9000; Keyence, Osaka, Japão), com capacidade fotográfica digital para seleção de acordo com a as instruções do fabricante. Para estudar miRs eficiência de transfecção, as células DLD-1 foram transfectadas com BLOCK-iT Alexa Controle Fluorescente (Invitrogen) com CA ou LP. Em resumo, as células semeadas DLD-1 numa placa de 6 poços foram transfectadas com BLOCK-iT fluorescente Alexa Controlo e fotografadas após a transfecção usando um microscópio Keyence BZ-8000. A intensidade de fluorescência das células transfectadas como observado usando um classificador de células FACS BD FACSAria III.

Luciferase Assay

região 3 ‘não traduzida (3′-UTR) de CDK2 foi amplificado por RT-PCR utilizando os iniciadores 5’-CTAGCTAGCTAGCCTTCTTGAAGCCCCCA-3 ‘e 5′-CTAGCTAGCGAGCTACAAACTAAATTACA-3’. Os iniciadores foram subclonados, ligado ao Expressão pmirGLO luciferase dupla miARN alvo Vector (Promega) usando NheI, e confirmadas por sequenciação directa. Os ensaios de luciferase foram efectuados utilizando 5 × 10

3 DLD-1 células plaqueadas numa placa de 96 poços. As células foram transfectadas utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen) em meio de soro reduzido OptiMEM (Gibco) com 200 ng de vector vazio ou luciferase-CDK2 3’UTR vector e quer NC miR ou miR-302s (concentração final, 25 nmol /L). A actividade de luciferase foi medida 24 h após a transfecção usando o ensaio de luciferase Dual-Glo Sistema (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante. nível luciferase relativa foi calculada como (Sample Luc /Renilla Amostra) /(Controle Luc /Controle Renilla), onde Luc é a atividade de luciferase de pirilampo cru e Renilla é a atividade luciferase controle de transfecção interno.

ensaio de proliferação celular

para avaliar a proliferação e a sensibilidade das células cancerosas formadoras de colónias AP-positiva ES-como a 5-fluorouracil (5-FU, Kyowa Hakko Kirin Co, Tóquio, Japão), 1 × 10

3 células eram expostas a várias concentrações de 5-FU durante 72 h numa placa de 96 poços. As células viáveis ​​foram avaliadas usando a célula de contagem Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Molecular Technologies, Tóquio, Japão). Para avaliar a influência destes miRs indicado na proliferação de células, as células HT29 e células DLD-1 (5 × 10

4 células /poço numa placa de 12 poços) foram transfectadas com miR-302s, miR-302s mais miR -369s, ou NC mir, como descrito acima. As células foram contadas todos os dias durante três dias, começando 24 h após a transfecção.

ciclo celular análise

Para a análise do ciclo celular por citometria de fluxo, 5 × 10

4 DLD-1 células foram transfectadas com cada miR numa placa de 24 poços, tripsinizadas após 72 h, lavou-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e fixadas em 70% de etanol em gelo. Após centrifugação, as células foram coradas com 50 mg /ml de solução de iodeto de propídio (PI) (Dojindo Molecular Technologies) e 0,1 mg /ml de RNase A (Invitrogen) e analisados ​​por citometria de fluxo usando um classificador de células FACS BD FACSAria III. Cada histograma foi construído com dados de pelo menos 10.000 eventos e foi usada para calcular a percentagem da população de células em cada fase.

invasão celular ensaio

ensaios de invasão Transwell foram realizadas em 24- câmaras bem modificados pré-revestidas com Matrigel (BD BioCoat, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). DLD-1 células e SW480 células foram transfectadas com 10 nM de miR-302s, miR-369s, miR-302s, mais miR-369s e NC miR usando CA. Após 48 h, as células foram tripsinizadas e re-suspensas a uma concentração de 10 × 10

4 células /ml em meio isento de soro e 0,5 ml de suspensão de células foi adicionado ao topo de cada cavidade. Após 48 h de incubação, as células migrando para dentro da câmara inferior, que contém 10% de FBS como um quimio-atractor, foram fixadas e coradas com coloração de Wright-Giemsa (Diff-Quick; Sysmex, Kobe, Japão). Quatro campos aleatórios foram contadas em triplicado. Os dados estão expressos como o valor médio com o erro padrão da média (SEM) de células invadidas numa proporção relativa em comparação com as células cancerosas tratadas com miR NC.

diferenciação celular estudo

Para determinar a capacidade de diferenciação das células cancerosas formadoras de colónias ES-gerados como

in vitro

, as células foram cultivadas em cultura flutuante para formar corpos embrióides (EBS). Após 4-5 dias, a EBS foram transferidas para placas revestidas com gelatina a 0,1% e cultivadas em RPMI-1640 com FBS a 10% durante mais 14 dias.

ARN análise

O ARN total foi extraído utilizando Trizol (Invitrogen, Tóquio, Japão). a qualidade do RNA foi avaliada com um espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) a 260 e 280 nm (A260 /280). A transcrição reversa (RT) para miR foi realizada

in vitro

com o Kit de microRNA transcrição reversa Taqman (Applied Biosystems, Tóquio, Japão). qPCR foi realizada com TaqMan universal Master Mix de PCR (Applied Biosystems).

RT-PCR

RNU48 expressão in vitro e in vivo RNU6B expressão foram usadas como um controlo interno para determinar a expressão relativa de miR. RT para miR foi realizada

in vitro

com miScript II RT Kit (Qiagen, Tóquio, Japão). qPCR foi realizado utilizando o Kit miScript SYBR Green PCR (Qiagen). RNU6B expressão foi usado como um controlo interno. Dobrável mudanças foram calculados e normalizados utilizando o método CT. Os níveis de ARNm foram ensaiadas utilizando o sistema de transcrição reversa (Promega, Tóquio, Japão) e LightCycler FastStart Reacção mistura SYBR Green I num LightCycler (Roche, Tóquio, Japão). Todos os resultados foram normalizados para um controlo GAPDH. estudos de expressão RNA foram repetidos de forma independente, pelo menos, três vezes para confirmar a reprodutibilidade.

análise Proteína

Os níveis de proteína foram determinados por immunoblotting. Os anticorpos contra Bak (1: 200, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), Bid (1: 200, Santa Cruz), Bcl-2 (1: 1000, a CST, Tóquio, Japão), Bcl-XL (1: 1000, CST), Mcl-1 (1: 1000, CST), Caspase8 (1: 1000, CST), Caspase3 (1: 1000, CST), CyclinD1 (1: 200, Santa Cruz), CDK2 (1: 200, Santa Cruz ), CDK4 (1: 200, Santa Cruz), E-caderina (1: 1000, CST), vimentina (1: 1000, CST), Zeb1 (1: 1000, CST), Phospho-Rb (Ser807 /811) ( 1: 1000, a CST), e o ACTB controlo interno (1:. 2000, Sigma Aldrich, Tóquio, Japão) foram usadas

imunotransferência

os sedimentos celulares foram lisados ​​em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação gelo fresco com inibidor da protease. As concentrações de proteína foram determinadas usando o ensaio de Bradford. As proteínas foram separadas em 4-10% Mini-PROTEAN Precast Gel (BioRad, Tóquio, Japão). Após a transferência electroforética durante a noite para uma membrana de PVDF, as membranas foram bloqueadas com bloqueio Uma solução (Nacalai Tesque, Tóquio, Japão) durante 1 h e incubou-se durante a noite a 4 ° C com o anticorpo primário indicado. Finalmente, as membranas foram incubadas com anti-ratinho de toda ou-IgG de coelho secundário acoplado a peroxidase de rábano (GE Healthcare Life Sciences, Tóquio, Japão) durante 1 h à temperatura ambiente. ligação a proteínas alvo do anticorpo foi visualizada por quimiluminescência usando Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagentes (GE Healthcare Life Sciences).

Imunocitoqu�ica

As células foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas em paraformaldeído a 4% para 15 min à temperatura ambiente. As células foram então lavadas duas vezes com PBS e permeadas com 0,1% de Triton X-100 durante 15 min à temperatura ambiente. A ligação não específica foi bloqueada através da incubação em cabra ou soro de cavalo (Vectastain, Funakoshi, Tóquio, Japão) durante 10 min à temperatura ambiente. As células foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Os anticorpos primários utilizados foram policlonal de coelho anti-humano OCT3 /4 (1: 400, a MBL, Nagoya, Japão), anticorpo policlonal de coelho Sox2 anti-humana (1: 400, MBL), anticorpo monoclonal Nanog de murganho anti-humano (1: 2000, a CST ), monoclonal de ratinho anti-humano Ki-67 antigénio (1: 400, Dako), e de coelho anti-humano monoclonal de e-caderina (1: 200, a CST). No dia seguinte, as células foram lavadas duas vezes com PBS e tratados com anticorpo secundário por 30 minutos à temperatura ambiente. Os anticorpos secundários utilizados foram anti-coelho IgG (H + L), F (ab ‘) 2 (Alexa Fluorr 488 Conjugado, 1: 1000, a CST) ou anti-IgG de ratinho (H + L), F (ab’) 2 fragmento (Alexa Fluorr 555 Conjugado) (1: 1000, CST). Os núcleos foram corados com o reagente Prolongar Antifade ouro com DAPI (Invitrogen). As imagens foram capturadas com um microscópio Keyence BZ-8000.

análise de metilação do DNA

miR302 transfectadas DLD-1 células de câncer colorretal foram analisadas para a metilação do DNA. Resumidamente, as células foram transfectadas com miR-302S ou o controlo simulado. proteínas metilados foram imunoprecipitadas a partir do lisado celular utilizando proteína de ligação a metilação. As amostras foram sequenciados (Takara, Kyoto, Japão) para obter dados de metilação do DNA do genoma inteiro. Dados entre as duas amostras foram comparadas para determinar a resposta de metilação do DNA de miR-302s transfecção.

análise histona metilação

extração de histona e medição de níveis de metilação globais de histona 3 lisina-4 (H3K4 ) foram realizadas utilizando o kit global histona H3-K4 metilação de acordo com protocolos do fabricante (Abnova, Taipei, Taiwan).

mouse estudo

os estudos em animais foram realizados em estrita conformidade com os princípios e procedimentos aprovados pela Comissão de Ética de Experimentação animal da Universidade de Osaka (número de aprovação, 24-122-011). O ensaio tumorigenicidade foi realizada utilizando um

in vivo

modelo de xenotransplante. Em primeiro lugar, 5 × 10

6 células em suspensão em um volume total de 200? L de DMEM /Matrigel (1: 1 (v /v) de suspensão) foram injectados nos flancos de ratinhos fêmea de 7-8 semanas de idade (BALB /cAJcl-nu /nu). Quando os volumes dos tumores atingiu 100 mm

3, tal como medido com compassos de calibre e calculada usando a fórmula V = (AB

2) /2, onde a é o comprimento e b é a largura, os tumores foram colhidos e cortados em três 4 mm

3 seções para transplante de série. Secções foram a confirmar vasculaturization por imuno-histoquímica utilizando CD31, um marcador endotelial vascular. xenoenxertos HT29 em série transplantados tinham vasculatura mais abundante, foi uniformemente distribuída ao longo de todo o tumor, e tinham a menor quantidade de necrose central. complexos miRs /CA foram administradas usando uma agulha 30G através da veia da cauda. O tamanho do tumor e peso corporal foram medidos uma vez a cada 3 dias. tumores de xenoenxerto e sangue de camundongos foram coletados durante sacrifício e preservadas em formalina a 10% neutra tamponada para exame histológico e imuno-histoquímico estudos ou em RNAlater RNA Estabilização Reagente (Qiagen, Tóquio, Japão).

Carbonato de preparação apatita

Para preparar uma mistura CA transfecção

in vitro

, 2 mg de cada miR-302 (-a, -b, -c, -d), miR-369 (-3p, -5p) ou NC miR foi misturado com 4 mL de 1 M CaCl

2 em 1 mL de bicarbonato isento de soro (44 mM) -buffered meio DMEM (pH 7,5) incubaram-se a 37 ° C durante 30 min, e utilizado para transfecção [15- 17]. Este método foi utilizado principalmente para

in vitro

experimentos. Para

in vivo

experimentos, uma solução inorgânico (0,9 mM NaH

2 PO?

4, CaCl 1,8 mM

2, pH 7,5) substituiu a solução DMEM. Para um rato, uma mistura de 15 ug cada de miR foi usada para injecção única. A solução foi centrifugada a 12000 rpm durante 3 min e o sedimento dissolvido em 200 ul de solução salina contendo 0,5% de albumina. Os produtos da solução foram sonicadas (38 kHz, 80 W) num banho de água durante 10 min abaixo de 20 ° C para gerar complexos de miR /CA, que foram injectados intravenosamente dentro de 5 min.

amostras de doentes

as amostras clínicas foram coletadas durante a cirurgia a partir de nove pacientes submetidos à ressecção cirúrgica de câncer colorretal no Hospital da Universidade de Osaka e seus hospitais relacionados em 2005. os pacientes estão resumidos na Tabela S2. Todos os pacientes estavam de acordo com o uso de espécimes ressecados neste estudo de acordo com as orientações aprovadas pelo Conselho de Pesquisa Institucional (protocolo aprovado # 213).

A análise imunohistoquímica

A análise imunohistoquímica foi realizada em 3,5 mm secções embebidas em parafina de xenotransplantes. secções embebidas em parafina foram de-parafinado em Hemo-De (Farma) e reidratadas em uma série de etanol graduada. As lâminas foram aquecidas em tampão de recuperação de antigénio de 40 minutos, bloqueou-se com cabra ou soro de cavalo durante 20 min à temperatura ambiente, e incubadas com antigénio monoclonal de ratinho anti-humano de Ki67 (1: 400, Dako), anticorpo policlonal de coelho anti-humano OCT3 /4 (1: 100, MBL), anticorpo policlonal de coelho anti-humano Sox2 (1: 200, MBL), ou anticorpos monoclonais de ratinho anti-humano CK20 (Dako) durante a noite a 4 ° C. O Sistema de Vectastain ABC (Vectastain, Funakoshi, Japão) foi usado para visualizar antigénio. Contra-coloração foi realizada utilizando hematoxilina.

Imunofluorescência análise

Análise por imunofluorescência foi realizada em 3,5 mm secções embebidas em parafina de xenotransplantes para detectar vasos tumorais. secções embebidas em parafina foram de-parafinado e tratada tal como descrito para imuno-histoquímica. As secções foram bloqueadas com soro de cabra por 20 min à temperatura ambiente e incubados com anticorpo de rato anti-ratinho CD31 (01:20, Dianova, Hamburgo, Alemanha) durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, o anticorpo secundário IgG anti-rato (H + L), F (ab ‘) 2 (Alexa Fluorr555 Conjugado): Aplicou-se (1 1000, a CST). As secções foram contra-coradas com Prolongar ouro Antifade Reagente com DAPI. As imagens foram capturadas com um microscópio Keyence BZ-8000.

Alcian azul coloração

coloração azul Alcian foi realizada em 3,5 mm secções embebidas em parafina de xenotransplantes para detectar muco. Resumidamente, as lâminas foram de-pareffinized em Hemo-De (Farma), re-hidratadas numa série de etanol graduada, por imersão em ácido acético a 3% durante 3 min, e coradas numa solução de azul Alcian (1 g Alcian azul 8GX, 3 ml acético ácido, e 97 ml de água destilada) durante 20 min. As secções foram então lavadas e contra-coradas com os núcleos Kernechtrot (TCI, Tóquio, Japão) durante 5 min.

Ensaio de Apoptose

A Anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit (Biovision, Milpitas, CA) foi utilizada de acordo com o protocolo do fabricante para

in vitro

detecção de fase precoce e tardio de células em apoptose. Resumidamente, para detectar a apoptose

in vitro

, 20 × 10

4 DLD-1 células foram transfectadas com miR-302s, miR-369s, miR-302s, mais miR-369s ou NC miR usando o CA em um placa de 6 poços, em triplicado, 60 horas antes do ensaio. As células foram tratadas com tripsina e analisada por citometria de fluxo usando um classificador de células FACS BD FACSAria III. Três experimentos independentes foram realizadas em triplicado.

Para detectar quebras de DNA em células em apoptose

in vitro

, foi utilizado o Fluorométrica TUNEL Sistema deadend (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante. Em resumo, as células foram transfectadas com cada uma utilizando o miR CA usando o Sistema de corrediça Nunc Lab-Tek II Secção (Fisher Scientific, Tóquio, Japão). As lâminas foram lavadas 48 h pós-transfecção e fixados em formaldeído a 4% em PBS durante 25 min a 4 ° C. As lâminas foram lavadas duas vezes em PBS e permeabilizadas em 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 5 min. As lâminas foram em seguida lavadas em PBS, equilibrada em tampão de equilíbrio durante 7 min à temperatura ambiente, e marcadas com TdT mistura de reacção durante 60 minutos a 37 ° C numa câmara humidificada para evitar a exposição à luz. As lâminas foram imersas em 2X SSC durante 15 minutos para parar a reacção. Os núcleos foram contrastadas usando com Prolongar ouro Antifade Reagente com DAPI. As células apoptóticas foram detectadas por um microscópio Keyence BZ-8000.

Para detectar células apoptóticas

in vivo

, um ensaio de TUNEL foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as lâminas foram de-parafinado em Hemo-De, re-hidratadas numa série de etanol graduada, imersos em 0,85% de NaCl, e fixados em 4% de formaldeído. As células foram permeabilizadas com uma solução de 20 ug /ml de proteinase K, durante 10 min à temperatura ambiente. As lâminas foram equilibradas com tampão de equilíbrio durante 10 min à temperatura ambiente e rotulados com TdT mistura de reacção durante 60 minutos a 37 ° C numa câmara humidificada. As lâminas foram imersas em 2X SSC durante 15 minutos para parar a reacção. Os núcleos foram contrastadas utilizando ouro Prolongar Antifade Reagente com DAPI. As células apoptóticas foram detectadas por um microscópio Keyence BZ-8000.

Resultados

expressão endógena de miR-302s e miR-369s em tumores primários e linhas celulares de cancro de cólon

estudos anteriores indicaram que o miR-302a, -B, -C, e-d (miR-302s), miR369-3p, -5p (miR-369s) e miR-200c poderia provocar reprogramação celular em células somáticas normais [13]. Aqui, nós palneed para reprogramar as células cancerosas que usam esses miRs. Começamos por investigar a expressão endógena de miRs estes em linhas celulares de cancro colorrectal e de amostras clínicas de cancro do cólon (Figura 1A e 1B). Expressão de miR-302s em cancro do cólon foi muito baixa ou indetectável em comparação com a de células NTERA teratoma humanos, que supostamente expressar genes-ESC específica e são utilizadas como células de controlo para avaliar a expressão do gene CES semelhante em muitos estudos [2, 3, 5, 11]. Em contraste, a expressão de miR-200C era alta em nove tumores primários examinados e muitas linhas celulares, tais como HT29. Os níveis de expressão de miR-302s e 369s miR-se inferior em comparação com a de miR-200 ° C, sugerindo que a expressão de miR-200c já é elevada em muitas células de cancro do cólon e pode ser refractária à sobre-expressão exógena. Em seguida, nós transfectadas única miR-302s ou miR-369s em células de cancro do cólon. Para optimizar

In vivo

experiências, que imitam os tumores primários, foram estudados os padrões de coloração imunofluorescente de CD31, um marcador endotelial vascular, utilizando DAPI para contracoloração núcleos, em xenoenxertos de HT29, DLD-1 e células SW480 (Fig 1C). xenoenxertos HT29 tinha a vascularização mais abundante, foi uniformemente distribuída ao longo de todo o tumor, e a menor quantidade de necrose. Uma análise mais aprofundada reprogramação cancro por miR-302s e miR-369s foi realizada principalmente com células HT29 e outras linhas celulares complementares.

A) A expressão relativa de endógenos miR-302s (miR-302a, -B, -c, e-d), miR-369s (mIR-369-3p e -5p), e miR-200C em tumores primários e linhas celulares de cancro do cólon. A linha celular de teratocarcinoma humano NTERA foi utilizada como um controlo. B) Expressão miRs em HT29, DLD-1 e SW480 células (n = 3). C) Análise por imunofluorescência da expressão de CD31 em xenoenxertos de HT29, DLD-1 e células SW480. xenoenxertos HT29 exibiu muitas áreas CD31-positivas com pouca necrose. As barras de escala, de 200? M. D) A expressão relativa de miR-302s e miR-369s nas células HT29 24 h pós-transfecção de 30 nm miR-302s-369s mais miR (n = 3). NC, controle negativo. E) A expressão relativa de miR-302s nas células HT29 no dia 2 e 6 após a transfecção de miR-302s (n = 3). NC, controle negativo. F) Para avaliar a eficiência da transfecção, um oligómero de ARNcd marcado por fluorescência foi transfectada com carbonato de apatite (CA) ou lipofecção (LP) em células DLD-1. A eficiência de transfecção foi avaliado por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo, após uma única transfecção, conforme indicado. G) A expressão relativa de miR-302s em células HT29 48 h pós-transfecção por CA ou LP (n = 3).

exógena introdução de miR-302s e miR-369s provoca a reprogramação celular

transfectadas miR-302s-369s mais miR em linhas celulares de cancro do cólon usando CA para alcançar níveis de expressão de miR semelhantes às de células NTERA, que foram utilizados como controlo positivo (Figura 1D) [13]. Nós confirmamos que o miR-302s foram efetivamente transfectadas (Fig 1E). A eficiência de transfecção usando o CA foi maior do que a de LP sob as nossas condições (Fig 1F e 1G). Portanto, o método de CA foi utilizado em todas as experiências subsequentes.

Para determinar se as células cancerosas pode ser reprogramado usando miRs, examinámos o efeito da introdução de exógenos miR-302s com e sem miR-369s três vezes durante período de transfecção. No dia 6, as células foram suavemente tripsinizadas, transferidas para células alimentadoras MEF, e cultivados durante mais 21 dias em meio de ES com três inibidores químicos (3i; 0,5 uM A83-01, um inibidor /receptor de 5 ALK4 /7; 3 uM CHIR99021 , um inibidor de GSK-3β; e 0,5 uM PD0325901, um inibidor da MEK) (Figura 2A) [5,13,18]. colónias redondas foram induzidos em cima transfecção de HT29 com miR-302s. Estas colónias eram semelhantes às dos CES /iPSCs e aparentemente diferentes daquelas das células parentais (Fig 2B). CES /iPSCs são conhecidos como sendo fosfatase alcalina-positiva, de modo que as células coradas utilizando o AP vivo mancha (figura 2C) para identificar e escolher colónias que consistiram de células verdadeiramente reprogramadas [19]. Entre as células que formam colónias ES-like, AP

+ mas não AP

– células mostraram um aumento dos níveis de OCT3 /4, SOX2 e NANOG (Figura 2D) e miR-302S (figura 2e) de expressão. As células transfectadas com miR-302s, mais miR-369s ou miR-302s só foram AP

+ em cultura após 28 dias de reprogramação. Estas células reprogramadas expressaram proteínas marcadoras pluripotentes como OCT3 /4, Sox2, Nanog, e TRA-1-60 (Fig 2F).

A) Esquema de métodos de reprogramação cancro por transfecção de miR-302s ou miR- 302s mais miR-369s. B) miR-302s-induziu alterações morfológicas nas células HT29 nos dias 1, 6 e 28. reprogramado HT29 ter uma aparência-tronco células-like embrionário. As barras de escala, de 100? M. C) Células coradas utilizando fosfatase alcalina (AP) mancha vivo. As barras de escala, de 100? M. D) A expressão relativa de

OCT3 /4

,

SOX2

e

NANOG

comparação com AP

– células por qRT-PCR (n = 3). E) A expressão relativa de miR-302s e miR-369s em AP

+, AP

– e NTERA células. 0,05. Três experimentos independentes foram realizados.