Abstract
estudos de associação
Genome-larga (GWAS) identificaram 19 variantes de risco associados ao câncer colorretal. Como a maioria dessas variantes de risco residem fora das regiões codificantes dos genes, realizamos
cis
-expression loci de características quantitativas (
cis
-eQTL) analisa a investigar possíveis funções reguladoras sobre a expressão da vizinha genes. Quarenta microssatélites ilha methylator tumores colorretais fenótipo negativo estáveis e CPG e emparelhados tecidos normais adjacentes do cólon foram utilizados para SNP do genoma e perfil de expressão gênica. Descobrimos que três variantes de risco (rs10795668, rs4444235 e rs9929218, usando proxies perto rs706771 perfeitos, rs11623717 e rs2059252, respectivamente) foram significativamente associadas (FDR
q
-valor ≤0.05) com os níveis de genes próximos expressão ( 2 Mb para cima ou para baixo-stream). Observou-se uma associação entre o alelo baixo colorectal risco de câncer (A) para rs10795668 em 10p14 e aumento da expressão de
ATP5C1
(
q
= 0,024) e entre o alelo de alto risco de câncer colorretal (C ) para rs4444235 em 14q22.2 e a expressão aumentada de
DLGAP5
(
Q
= 0,041), tanto em amostras de tumor. O alelo câncer colorretal baixo risco (A) para rs9929218 em 16q22.1 foi associado com uma diminuição significativa na expressão de ambos
NOL3
(
q
= 0,017) e
DDX28
(
Q
= 0,046) nas amostras de tecido de cólon normais adjacentes. Dos quatro genes,
DLGAP5
e
NOL3
tenham sido previamente relatado para desempenhar um papel na carcinogênese do cólon e
ATP5C1
e
DDX28 Quais são proteínas mitocondriais envolvida no metabolismo celular e a divisão, respectivamente. A combinação de resultados GWAS, estudos funcionais anteriores, e
cis
-eQTL análises descritas aqui sugerir atividades funcionais putativos para três o câncer GWAS loci risco identificado colorectal como regular a expressão de genes vizinhos.
Citation: Loo LWM, Cheng I, Tiirikainen M, Lum-Jones A, Seifried A, Dunklee LM, et al. (2012)
cis
-Expression QTL Análise da Fundação Câncer Colorretal Risco Variantes em tumores de cólon e tecido normal adjacente. PLoS ONE 7 (2): e30477. doi: 10.1371 /journal.pone.0030477
editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 01 de setembro de 2011; Aceite: 16 de dezembro de 2011; Publicação: 17 de fevereiro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Loo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional do Câncer, dos Institutos Nacionais de Saúde, sob RFA # CA-95-011; e através de acordos de cooperação com a Universidade de Hawaii Colorectal família Registro de Câncer (U01 CA074806), Mayo Clinic Cooperativa de Registro Familiar para Colon Cancer Studies (U01 CA074800), Ontario Registro de Estudos de Familial Câncer Colorretal (U01 CA074783), a University of Southern California familial colorectal Neoplasia Grupo Colaborativo (U01 CA074799), e os membros do Colon Registro Familiar Câncer e PIs Além disso, este trabalho foi parcialmente financiado pela concessão 5U24 CA074806 e Affymetrix Colaborações Cancer Research Program in. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
estudos de associação
Genome-larga (GWAS) de câncer colorretal revelaram 19 variações genéticas comuns em 14 loci que contribuem para o risco de cancro colo-rectal [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Todos, exceto um (rs10936599) destas variantes de risco residem em regiões intrônicas, intergênicas ou gene-deserto (Tabela 1) e podem servir como marcadores para variantes causais que regulam genes vizinhos ou distantes. Assim, o desafio atual é elucidar como essas variantes de risco influenciar especificamente o desenvolvimento de cancro colorectal. Uma abordagem promissora é avaliar estas variantes para as suas associações com a expressão diferencial de genes desde transcrição abundância pode agir como um fenótipo intermediário útil para decifrar a ligação entre um locus genético e um fenótipo clínico [8].
Os níveis de expressão de genes são altamente hereditárias [9], [10], [11] e expressão diferencial de genes pode ser mapeado para um local determinado genética como um locus de expressão de características quantitativas (eQTL) que afeta perto (
cis
) ou distantes (
transacções
) genes [12], [13]. Com efeito, os loci de risco GWAS têm sido relatados para ser enriquecido para eQTLs, fornecendo informações sobre possíveis efeitos mecânicos, bem como auxiliar na identificação de variantes adicionais que podem ser responsáveis para a hereditariedade da doença [14]. Embora vários estudos eQTL anteriores foram realizados quase exclusivamente em linhas celulares linfoblastóides [12], [15], [16] associações, alguns estudos recentes têm mostrado específicos de tecidos de variantes genéticas e expressão de genes [17], [18], [19]. Para loci risco de câncer, as associações eQTL observados no tecido originário dando origem ao tumor são esperados para ser mais informativo [20].
Para descobrir se as variantes de risco estabelecidos para o câncer colorretal afetar a expressão de genes diferencialmente vizinhos por genótipo, realizamos um
cis
-eQTL análise do risco colorectal GWAS-identificaram variantes usando as amostras de tecido adjacente normal e tumor do cólon emparelhado coletados de 40 pacientes com câncer de cólon. Este é o primeiro estudo a realizar um
cis
-eQTL análise sobre ambos os tecidos normais e tumorais adjacentes a partir de um grupo homogêneo de tumores colorretais molecularmente caracterizado (MSS e CIMP-negativos).
Materiais e métodos
Declaração de Ética
a aprovação para este estudo foi obtida em conformidade com as exigências locais Institutional Review Board (IRB) em todos os centros participantes. Todos os indivíduos incluídos no estudo assinaram um consentimento informado por escrito.
Os sujeitos do estudo e amostras de tecidos
fresco congelado, adenocarcinomas do cólon e amostras de tecidos normais adjacentes emparelhados foram coletadas em três locais (Mayo Clinic, Mount Sinai, e Cleveland Clinic) dos participantes na Família Registry colorectal Cancer (C-CFR) [21] e testados para a instabilidade de microssatélites (MSI) e CpG fenótipo ilha methylator (CIMP). Amostras de 40 estável microssatélite (MSS) /tumores CIMP-negativas, a forma mais comum de câncer de cólon, e suas amostras pareadas normais adjacentes de tecido (um total de 80 amostras) foram utilizados para este estudo. Os 40 pacientes eram de ascendência europeia, com uma idade média de diagnóstico de 57 anos de idade.
DNA e RNA Isolation
Todas as amostras de tumor foram seccionados e corados com hematoxilina e eosina, então revisado por um patologista para determinar o teor de células de tumor. Amostras tumorais utilizados para o estudo tinha teor de células de tumor de 70%. DNA genómico e RNA total foram extraídos dessas amostras de tecido usando o QIAGEN AllPrep DNA /RNA Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA) seguindo as recomendações do fabricante.
Estado da MSI MSI e CIMP Testing
foi determinada através da análise de 10 loci microssatélites (
BAT25
,
BAT26
,
BAT40
,
BAT24C4
,
D5S346
,
D17S250
,
ACTC
,
D18S55
,
D10S197
, e
MYCL
) como descrito anteriormente [22]. Os tumores foram classificados como MSS, se há marcadores exibiram instabilidade. Para os testes CIMP, ADN do tumor foi tratada com bissulfito de sódio e analisados utilizando o MethyLight Ensaio baseado em PCR em tempo real automatizado para identificar locais CpG metilados nas regiões promotoras de um painel de cinco genes estabelecido para CIMP (
CACNA1G
,
IGF2
,
NEUROG1
,
RUNX3
, e
SOCS1
) e na região promotora de
MLH1
. CIMP estado foi avaliado como anteriormente descrito em [23]. Os tumores foram classificados como CIMP negativo se hipermetilação do promotor foi encontrado em ≤ 2 genes do painel de cinco gene e se não havia
MLH1
methyation DNA promotor.
Análise Microarray
perfis de expressão genética para tumores de cólon e tecido normal adjacente foram avaliadas com o Affymetrix GeneChip Exon Human 1.0 ST array (Affymetrix, Santa Clara, CA); GEO número Adesão GSE31737. RNA ribossomal (rRNA) foi removido a partir do ARN total utilizando o kit de isolamento de RiboMinus humano /murganho transcriptoma (Invitrogen de Carlsbad, CA). Após redução rRNA, a Affymetrix GeneChip Whole Transcrição (WT) Sense alvo Labeling ensaio foi usado para gerar amplificado e alvos de ADN sentido vertente biotinilados para a hibridação no GeneChip Exon Human 1.0 ST Arrays, seguindo as recomendações do fabricante.
Genomic o DNA foi extraído a partir de tecido de cólon normal (n = 34) ou sangue (n = 6) e amostras genotipadas utilizando o Affymetrix Genome-Wide SNP Humana 6,0 matriz. Em resumo, as amostras de ADN foram transformados, marcado e hibridado de acordo com as recomendações do fabricante. Todas as matrizes foram digitalizados no GeneChip® Scanner 3000 7G usando o Software Affymetrix GeneChip Console Command (AGCC) para medir as intensidades dos sinais fluorescentes em cada local da sonda. A taxa média de chamadas para as 80 amostras foi de 99,6%.
Seleção de variantes de risco para CRC
Foram considerados todos os 19 variantes de risco estabelecidos para o câncer colorretal relatado por estudos de associação do genoma, até novembro, 2010 (Tabela 1) [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]. dados de genótipos para 12 dos 19 variantes não estavam disponíveis a partir do 6.0 matriz Affymetrix (Tabela 1). Para cada um destes 12 não variantes na matriz, um proxy foi selecionado entre os SNPs digitados dentro de uma região de 20 kb montante ou a jusante do alelo de risco, que estava em maior LD (r
2≥0.90) com o risco variante entre HapMap CEU (https://gvs.gs.washington.edu/GVS/). Porque rs10411210 em 19q13.1 não tiver um proxy aceitável (r
2 0,90). Na matriz Affymetrix 6.0, ele foi excluído, resultando em um total de 18 variantes de risco para análise
Real- PCR em tempo validação
validação técnica de perfis de expressão de genes foi efectuada em 20 pares normais de tumor adjacente incluídos nos ensaios de microarray. Real-Time PCR quantitativo (qPCR) foi realizada para os genes encontrados para ser diferencialmente expressos por geneotype neste estudo (
ATP5C1
,
DLGAP5
,
NOL3
,
DDX28
) e para quatro genes (
APC
,
MACC1
,
DCC
, e
DSC2
) previamente identificado para ser diferencialmente expressos em tumores colo-rectais. Resumidamente, o ADNc foi preparado a partir de até 2 ^ g de ARN total usando não tratada de Alta Capacidade de ADNc A transcrição inversa Kit (Applied Biosystems Foster City, CA). For Real-Time qPCR, 21-25 ng de cDNA (com base na entrada RNA) foi executado em 384 poços placas de PCR em triplicado usando 1 × gene TaqMan ensaios de expressão e TaqMan Universal PCR Mastermix com os perfis térmicos recomendados na 7900HT rápido real -time PCR System (Applied Biosystems Foster City, CA).
análise estatística
para cada uma das 18 variantes de risco analisados, a
cis
-eQTL análise foi realizada para investigar a associação entre genótipos SNP e expressão do gene de todos os genes próximos (dentro de 2 Mb a montante ea jusante de cada SNP). Cada SNP foi examinado por modelos de co-dominantes e dominantes, usando o alelo principal relatado entre os europeus como o alelo de referência. variantes de risco que têm uma categoria genótipo com menos de 2 amostras não são apresentados. valores de expressão de genes genome-wide foram log
2-transformados e normalizados utilizando Robust Multi-matriz Análise (RMA), usando sumarização polonês mediana [24]. O valor da expressão transcrição para cada gene considerado foi baseada na média da intensidade de sondas para aquele gene. Para identificar
cis
-genes associado com expressão diferencial por SNP genótipo, foi realizada análise multivariada de covariância (ANCOVA), ajustando para o estágio do tumor e do lote de ensaio. O Benjamini e taxa de detecção falsa de correcção de Hochberg (FDR) foi aplicada para corrigir o número de genes testados dentro do intervalo de 4 Mb pesquisados para cada alelo de risco [25]. Spearman testes de correlação foi conduzido para validar a correlação entre microarray e ensaios qPCR. A Partek Genomics Suite 6.5 Software (St. Louis, MO) foi utilizado para microarray e análises de dados estatísticos.
Resultados
Em nosso conjunto de amostras de 40 tumores colorretais emparelhado MSS e CIMP-negativas e tecidos normais adjacentes, foram identificados 50 genes que foram diferencialmente expressos pelo genótipo para 11 dos 18 variantes de risco estudados (
p
-Valores 0,05; Tabela S1). Depois de corrigir para múltiplo-teste, quatro genes (
ATP5C1
,
DLGAP5
,
NOL3
,
DDX28
) foram identificados para demonstrar uma diferença estatisticamente significativa nos níveis de expressão em que o tumor ou tecido do cólon normal adjacente em uma ou mais das três categorias de genótipo para rs10795668 (10p14), rs4444235 (14q22.2), ou rs9929218 (16q22.1) (global do teste: FDR
Q
-valor 0,05; Quadro 2). Para rs10795668 em 10p14, foi observada uma diferença significativa nos níveis de expressão de genes pelo genótipo em tumores para o gene que codifica para a subunidade gama no complexo F1 da ATP sintase mitocondrial (
ATP5C1
;
q
-valor = 0,024). Em contraste, não havia nenhuma diferença nos níveis de expressão de genes por genótipo de
ATP5C1
ou outros genes vizinhos em tecido do cólon normal adjacente para esta variante. Da mesma forma, para rs4444235 em 14q22.2, foi observada uma diferença significativa nos níveis de expressão de genes pelo genótipo para o
Drosophila
homólogo de discos, grande proteína associada 5 (
DLGAP5; q
-valor = 0,041) quando se comparam os níveis de expressão de gene em tecido de tumor, mas não no tecido normal adjacente. Para rs9929218 em 16q22.1, dois genes foram observados para ter uma diferença nos níveis de expressão do genótipo: proteína nucleolar 3 (
NOL3
;
q
-valor = 0,017) ea caixa MORTOS polipeptídeo 28 (
DDX28
,
q
-valor = 0,046), na adjacente normal, mas não o tecido do tumor.
as comparações específicas de genótipo para as três variantes de risco com
cis
-eQTL associações são mostrados na Tabela 2 e Figura 1. observou-se uma expressão aumentada estatisticamente significativa de
ATP5C1
nos tumores de pacientes homozigóticos para o alelo (
Q
-valor = 0,006) em rs10795668 (10p14) em comparação com o genótipo de referência (GG). Para rs4444235 (14q22.2), tumores de pacientes que eram homozigóticos para o alelo C tinha expressão significativamente mais elevada para
DLGAP5
em comparação com os tumores de aqueles com o genótipo de referência (TT) (
Q
-valor = 0,014). Para rs9929218 (16q22.1), a expressão específica do genótipo para o
NOL3
e
DDX28
no tecido do cólon normal adjacente foram significativamente menores entre os pacientes heterozigotos para o alelo A versus aqueles com o genótipo de referência (GG) (
q
-valor = 9,34 × 10
5 e
q
-valor = 4,15 × 10
-4, respectivamente).
Os diagramas de caixa de níveis de expressão de genes normalizado de
ATP5C1
,
DLGAP5
,
NOL3
,
e DDX28 Compra de tecido do cólon normal adjacente emparelhado (n = 40) e tecido de tumor do cólon (n = 40). Cada ponto representa os níveis de expressão de RNA normalizadas para um indivíduo. O nível de expressão do gene de mediana para cada grupo de genótipo específico é indicado por uma linha dentro de cada caixa dentro do gráfico. O
p
-valor indica a importância do teste global, comparando a expressão através genótipos. Se os valores de p foram significativas (
p
-value≤0.05), o FDR
q
-Valores foram fornecidos, indicando o significado após correção para comparações múltiplas.
Devido ao pequeno número de indivíduos que eram homozigotos para os menores alelos de câncer colorretal, também consideramos os níveis de expressão de genes em amostras realizadas uma ou duas cópias do alelo menor, em comparação com o genótipo de referência (última coluna Mesa 2). amostras de tumores de pacientes com uma ou duas cópias do alelo menor (s) (qualquer um) para rs10795668, em comparação com o genótipo GG, demonstrou aumento da expressão de
ATP5C1 Restaurant at 10p14 (
q
-valor = 0,004). Do mesmo modo, para as amostras de tumor de pacientes com uma ou duas cópias do alelo secundário (s) (qualquer C) em rs4444235 (14q22.2), expressão de
DLGAP5
foi aumentado em comparação com tumores com o TT genótipo (
q
-valor = 0,032). Não houve diferença estatisticamente significativa na expressão de
NOL3
e
DDX28
no tumor ou tecido normal adjacente ao comparar pacientes com uma ou duas cópias do alelo menor (s) (A) versus aqueles com o genótipo GG para rs9929218 em 16q22.1 (Tabela 2).
os quatro genes que foram identificados para ser diferencialmente expressos em relação aos três variantes de risco ter sido mostrado ter um papel no cancro-relacionada mecanismos, tais como o metabolismo e a proliferação celular e a apoptose [26], [27], [28], [29]. Portanto, foram comparados os níveis dos quatro
cis
genes -regulated (
ATP5C1
,
DLGAP5
,
DDX28
,
NOL3
) entre tumores e tecidos do cólon normal adjacente. Todos os quatro genes foram diferencialmente expressos em tumores em comparação com as amostras de tecido de cólon normais adjacentes. O nível de
ATP5C1
(
p
-valor = 0,005) foi menor nos tumores, expressão que os níveis de expressão de
DLGAP5
(
p viajantes – value = 7,80 × 10
-7),
DDX28
(
p
-valor = 0,016) e
NOL3
(
p
-valor 0,044) foram mais elevados em tumores em comparação com tecido do cólon normal adjacente (Figura 2).
Os diagramas de caixa de níveis de expressão do gene de
ATP5C1
,
DLGAP5
,
NOL3
,
e DDX28
em emparelhado tecido tecido do cólon e tumor de cólon normal adjacente (n = 40 pares). O significado da expressão diferencial é indicado pelo
p
-valor.
Para confirmar a fiabilidade dos resultados de microarray, foi realizada uma validação técnica utilizando testes qPCR dos níveis de expressão de genes em 20 casos com ARN remanescente, a partir dos 40 casos originais, para ambas as amostras de tecidos normais e tumorais adjacentes. coeficientes de correlação grau de ordem de Spearman para os quatro genes identificados no
cis
-eQTL análise no tipo de tecido (tumor ou normal), onde foi observada a expressão diferencial específicas do genótipo foram,
ATP5C1 r
s
= 0,39;
DLGAP5 r
s
= 0,68;
NOL3 r
s
= 0,11;
DDX28 r
s
= 0,22. Como um passo adicional validação técnica, nós ensaiadas quatro genes (
APC
,
MACC1
,
DCC
, e
DSC2
) que tenham sido previamente estabelecida para ser diferencialmente expressos entre tumor e tecido normal adjacente no cancro colorrectal [30], [31], [32], [33]. Encontramos uma boa correlação (correlação Rank Ordenar de Spearman,
r
s Art 0,5) nos perfis de expressão genética para todos os quatro genes entre o nosso microarray e ensaios qPCR. Especificamente, menor expressão de
APC
,
DCC
, e
DSC2 Comprar e maior expressão de
MACC1
foi observado nas amostras de tumor em relação ao emparelhado tecido normal adjacente em ambos o microarray e ensaios qPCR. Estes dados de validação técnica apoiar a confiabilidade de nossas observações com base nos resultados de microarray de expressão gênica.
Discussão
Nosso estudo analisou 18 das variantes de risco de câncer colorretal 19 GWAS-identificadas em associação com a expressão de genes vizinhos (dentro de 2 Mb a montante ea jusante do SNP) em 40 pacientes com MSS e câncer de cólon CIMP-negativo, utilizando amostras de tumores de cólon normal e adjacentes fresco congelado emparelhado (Figura S1). Foram identificados quatro genes (
ATP5C1
,
DLGAP5
,
NOL3
, e
DDX28
) em três locos de risco, com uma diferença estatisticamente significativa na expressão do gene níveis de genótipo.
ATP5C1
codifica a subunidade gama do núcleo catalítico (F1) da ATP sintase mitocondrial, o complexo enzima responsável pela síntese de ATP, conhecida por desempenhar um papel central na celular respiração. Um evento comum em células tumorais é a chave de respiração metabólica (na mitocôndria) de glicólise (no citosol), muitas vezes referido como “o efeito Warburg” [34], [35]. Vários mecanismos podem iniciar este interruptor, um dos quais é um decréscimo na expressão da subunidade beta da sintase ATP (F1) (
ATP5B
), que conduz à ruptura da função catalítica do complexo ATP sintase, um evento que foi anteriormente observado em vários tipos de cancro [26], [29]. Nas amostras de tumores analisados no presente estudo, observou-se um aumento nos níveis de
ATP5C1
que foi significativamente associada com o alelo em rs10795668 expressão. O alelo A foi associada a uma diminuição do risco de cancro colorectal (OR = 0,89;
P
= 2,5 × 10
-13) num GWAS anterior [6]. Assim, o aumento da expressão de
ATP5C1
associados com o alelo seria consistente com a manutenção das atividades da ATP sintase e respiração celular e potencialmente inibir a progressão do tumor para o cancro colorectal.
DLGAP5
, também conhecido como o
HURP
(hepatoma proteína sobre-regulada), codifica uma proteína de ligação de microtúbulos envolvidos na formação e função de fusos mitóticos [36], [37] e acredita-se ser uma célula regulador de ciclo e de destino da Aurora quinase [38], [39]. A sobre-expressão de
DLGAP5
tem sido associada com a desregulação de formação de fibras do fuso durante a mitose e a função [38]. Além disso, tem sido relatado que
DLGAP5
pode ter um papel na manutenção de células estaminais e sobrevivência e foi observada a ser sobre-expressos em células de cancro colorrectal [27], [28], [40]. O alelo C para rs4444235 foi previamente relatado em GWAS para aumentar o risco de câncer colorretal (OR = 1,11;
p
= 8,1 × 10
-10) [3]. Nossa descoberta de que o alelo C está associada com o aumento da
DLGAP5
expressão nos tumores, sugere um potencial mecanismo pelo qual esse alelo pode promover a progressão do tumor para o cancro colorectal. Além disso, notamos que rs4444235 foi mostrado para ter uma associação significativamente mais forte com MSS-subtipos de cancro colo-rectal [3], que foi o subtipo molecular das amostras tumorais incluídos em nosso estudo.
DDX28
codifica para uma proteína caixa de MORTOS com a atividade RNA helicase. Embora
DDX28
especificamente não foi reportado ter um papel no cancro colo-rectal, outras helicases de RNA dead box foram mostrados para ser sobre-expresso em tumores colorrectais, demonstrando uma função de helicases de ARN na tumorigénese [41], [42 ], [43]. O
NOL3
gene, também conhecido como ARC (repressor apoptose com o domínio de recrutamento de caspase) codifica para uma proteína anti-apoptótica que regula p53 e as caspases 2 e 8 [44], [45]. Vários estudos têm mostrado que
NOL3
é regulada por N- activado e H-Ras e é sobre-expresso em cancro colorrectal [41], [46], [47]. Observamos, também,
NOL3
a ser overexpressed no tumor contra o tecido normal adjacente. Além disso, nosso
cis
-eQTL análise indicou uma associação para a diminuição da expressão de ambos
DDX28
e
NOL3
em tecidos normais adjacentes do cólon de indivíduos portadores do alelo A, particularmente casos com o genótipo GA para rs9929218. Tomados em conjunto com a constatação de que o alelo em rs9929218 está associado à diminuição do risco de cancro colorectal (OR = 0,91;
p
= 1,2 × 10
-8) [3], a nossa observação de uma associação entre esse alelo e diminuição
DDX28
e
expressão NOL3
no tecido normal adjacente sugere que esses genes pode diminuir risco de câncer colorretal, funcionando para inibir eventos iniciais da carcinogênese colorretal. Nossas descobertas podem também sublinham a importância de se estudar o tecido normal, além de tecido tumoral, em estudos eQTL de câncer.
Curiosamente, os genes diferencialmente expressos identificados neste estudo não eram genes directamente vizinhos as variantes de risco GWAS. Por exemplo, para rs10795668,
GATA3
é o gene vizinho mais próximo, mas não observamos uma associação significativa para expressão diferencial de
GATA3
eo genótipo deste SNP (
p
-valor 0,05). Da mesma forma, para rs4444235 e
BMP4
, que são separados por menos de 10 kb, e por rs9929218, que está localizado em um intron de
CDH1
, observamos nenhuma associação com o genótipo ea expressão do gene. Em um estudo recente, Carvajal-Carmona et al. relatado em um estudo de mapeamento fino para alelos de risco de câncer colorretal em 8q23.3 e 16q22.1 [48]. Eles também não encontraram nenhuma associação com a expressão genética do gene mais próximo, como
EIF3H
e
CDH1
em linhas celulares de monócitos, respectivamente, mas encontrar uma associação com genes mais distantes tais como
UTP23
para rs16892766 em 8q23.3 e
ZFP90 Compra de rs2059254 em 16q22.1 [48]. Em nosso estudo de amostras de tecido do cólon, também observamos uma associação (
p
= 0,03) para o
ZFP90
níveis de expressão e do alelo de risco em 16q22.1 (Tabela S1); no entanto, a associação não foi mais significativa após ajuste para comparações múltiplas. Estes resultados e os de outros estudos [3], [12], [15], [49], sugerem que as variantes de risco pode não preferencialmente regulam genes que estão mais próximos. Em vez disso, mecanismos reguladores da transcrição impactados por status alélica pode envolver complexos estados de confirmação da cromatina e função dentro de um contexto específico do tecido.
Poucos estudos examinaram a relação entre variantes de risco de cancro colorrectal e expressão genética em genes nas. O estudo investigou COGENT seis variantes de risco GWAS por seu efeito sobre a expressão de um pequeno número de genes candidatos vizinhos em 90 CEU HapMap, linhas de células linfoblastóides transformadas com EBV (rs9929218 para
CDH1
e
CDH3
, rs4444235 para
BMP4
, rs10411210 para
RHPN2
, rs961253 para
BMP2
, rs6983267 para
c-MYC
e rs3802842 para
LOC120376
) [3]. Não foram encontradas associações significativas. Embora não fomos capazes de avaliar rs10411210, nós semelhante não encontraram associações entre os restantes quatro variantes e expressão diferencial destes genes antes ou após a correção para o teste múltiplo em tecido do cólon e tumor normal adjacente (
p
-Valores 0,05). Além disso, similar aos nossos achados, um estudo anterior do rs6983267 encontrada nenhuma associação com
expressão de c-MYC
em 117 amostras de tecido do cólon normal, [50].
Este é o mais abrangente e um dos maiores tecido específico-o
cis
-eQTL estudos relatados até agora para o cancro colorectal. No entanto, a interpretação de nossos resultados é limitada por nosso poder estatístico limitado ( 60% para detectar uma diferença de 15% na expressão entre os genótipos) e a necessidade de estudos de replicação com amostras maiores para confirmar o efeito dessas variantes de risco para a regulação expressão gênica de genes vizinhos. Os pontos fortes mais notáveis deste estudo foram a inclusão de ambos os tecidos normal e maligno adjacente e a restrição a um grupo homogêneo de tumores colorretais caracterizados molecularmente (MSS e CIMP-negativos).
Em resumo, os nossos dados indicam que a análise dos efeitos de alelos de risco na expressão do gene em tumores bem caracterizadas e a sua emparelhado tecido normal adjacente é susceptível de ser altamente informativa. Uma análise mais aprofundada das variantes de risco e genes diferencialmente expressos terão de ser realizados para confirmar nossos resultados, bem como expandir a análise para outros subtipos moleculares de câncer colorretal e abordando eventos mecanicistas em um contexto específico do tecido.
Informações em apoio
Figura S1. gráfico
Fluxo de
cis
-eQTL análise de variantes de risco de câncer colorretal. O fluxograma descreve os procedimentos para analisar os efeitos de alelos de risco na expressão do gene, de genes dentro de uma gama de 4 MB do alelo de risco, no bem caracterizado tumores colo-rectais e seu tecido normal adjacente emparelhado
doi:. 10.1371 /journal.pone.0030477.s001
(TIF)
Tabela S1.
diferencialmente expressos genes associados com variantes de risco para o câncer colorretal. A lista dos 50 genes que foram identificados para ser diferencialmente expressos pelo genótipo para 11 do risco de 18 variantes estudadas (
p
-Valores 0,05) na análise de 40 tumor colorretal emparelhado MSS e CIMP-negativo e tecidos normais adjacentes
doi: 10.1371. /journal.pone.0030477.s002
(PDF)
Reconhecimentos
O conteúdo deste manuscrito não reflecte necessariamente as opiniões ou políticas do National Cancer Institute ou qualquer um dos centros colaboradores nas CFRs, nem a menção de nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações implica o endosso pelo governo dos EUA ou do CFR. Agradecemos também aos participantes do Registro Colon família que têm contribuído para uma melhor compreensão das contribuições genéticas para câncer de cólon. Nós também gostaríamos de agradecer Programa de Pesquisa Affymetrix Câncer e Drs. Gordon Okimoto e Hansong Wang para orientação analítica.