Abstract

células-tronco cancerosas (CSCs) são definidos como uma pequena população de células cancerosas com as propriedades de alta auto-renovação, a diferenciação e as funções de iniciação do tumor. Estudos recentes têm demonstrado que a aldeído desidrogenase 1 (ALDH1) é um marcador para os CSCs em cancros de adultos. Embora CSCs foram identificados em alguns tipos diferentes de tumores sólidos pediátricos, tem havido nenhum estudo sobre a eficácia da ALDH1 como um marcador para os CSCs. Por conseguinte, a fim de elucidar se ALDH1 pode ser utilizado como um marcador para os CSCs de sarcoma pediátrica, examinámos as características de uma população de células com uma elevada actividade de ALDH1 (ALDH1

de células de alta) em rabdomiossarcoma (RMS), o mais sarcoma de tecido mole comum em crianças. Usamos as linhas celulares RMS embrionário humano (ERMS) RD e Kym-1 e classificadas as células em duas subpopulações de ALDH1

células de alta e células com uma atividade de baixo ALDH1 (ALDH1

células de baixa). Consequentemente, descobrimos que os ALDH1

células de alta composta de 3,9% e 8,2% da população total de células, respectivamente, e mostraram uma maior capacidade de auto-renovação e formação de tumores do que os ALDH1

células de baixa. No que respeita à quimiorresistência, a taxa de sobrevivência dos ALDH1

de células de alta foi encontrada para ser mais elevada do que a dos ALDH1

células de baixa a seguir ao tratamento com agentes quimioterapêuticos para o RMS. Além disso, os ALDH1

de células de alta exibiu um grau mais elevado de pluripotência e o gene de expressão Sox2, que é um dos marcadores de células estaminais. Tomados em conjunto, os ALDH1

células de alta possuía características de CSCs, incluindo habilidades de formação de colônia, chemoresistance, diferenciação e de iniciação tumor. Estes resultados sugerem que ALDH1 é um marcador potencialmente útil das CSCs em ERMS

Citation:. Nakahata K, Uehara S, Nishikawa S, Kawatsu M, Zenitani M, Oue T, et al. (2015) a aldeído desidrogenase 1 (ALDH1) é um marcador potencial para o câncer de células estaminais em Embryonal. PLoS ONE 10 (4): e0125454. doi: 10.1371 /journal.pone.0125454

Editor do Academic: David M. Loeb, da Universidade Johns Hopkins, Estados Unidos

Recebido: 26 Setembro, 2014; Aceito: 21 de março de 2015; Publicação: 27 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Nakahata et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado financeiramente pela JSPS KAKENHI Grant número 23592630 (SU) e 25.861.668 (KN). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução células estaminais-como

Cancro (CSCs) são definidos como uma pequena população de células cancerosas com as propriedades de alta tumor de iniciação, auto-renovação e funções de diferenciação [1]. Além disso, os CSCs são resistentes a terapias convencionais, tais como quimioterapia e radioterapia, e, portanto, responsáveis ​​pela reincidência do tumor após o tratamento, bem como invasão e metástase [2, 3].

Rabdomiossarcoma (RMS) é a mais comum sarcoma dos tecidos moles em crianças. Apesar das melhorias significativas na sobrevivência ao longo das últimas décadas, mais de um terço dos pacientes RMS continuam a morrer da doença [4]. Os pacientes com tumores metastáticos ou refractários apresentam um prognóstico particularmente grave [5]. Aumentando regimes convencionais não melhorou significativamente a sobrevivência, e pesquisa para CSCs de RMS é muito importante para melhorar o prognóstico, uma vez que estas células são supostamente para induzir recidiva e metástase. Embora CD133 (prominin-1) tem sido relatado para ser um marcador para os CSCs [6], que também existe em células estaminais normais, e é necessário para identificar outros marcadores para o RMS.

estudos recentes têm demonstrado que aldeído desidrogenase 1 (ALDH1) é um marcador de CSCs em cancros adultos [7, 8, 9]. Embora CSCs foram identificados em muitos tipos diferentes de tumores sólidos pediátricos [10, 11], não existem actualmente estudos sobre a eficácia da ALDH1 como um marcador para CSCs no campo da oncologia pediátrica.

Neste estudo , a hipótese de que uma subpopulação de células com uma atividade ALDH1 alta (ALDH1

células de alta) iria exibir características de CSCs na RMS e, posteriormente, analisou as características de ALDH1

células de alta em RMS embrionário (ERMS). Foram analisadas linhas celulares RMS embrionário usando um ensaio ALDEFLUOR e descobriu que os ALDH1

células de alta teve características de CSCs, incluindo habilidades de formação de colônia, chemoresistance e de iniciação do tumor, e avaliou a expressão de mRNA das isoformas ALDH1, oncogene e do gene stemness.

Materiais e Métodos

linha celular e cultura de células

A linha de células de rabdomiossarcoma embrionário humano, RD e KYM-1 foram obtidos a partir de ATCC (Manassas, VA, EUA) e JCRB (Ibaraki, Japão), respectivamente. As células foram mantidas em meio RPMI-1640 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 1% de penicilina /estreptomicina e soro bovino fetal a 10% (FBS) e cultivados numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 incubadora a 37 ° C.

ensaio ALDEFLUOR

o aldeído desidrogenase atividade (ALDH) foi detectada utilizando um kit de ensaio ALDEFLUOR (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canadá), de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram coradas com BODIPY-aminoacetaldeído (BAAA) e incubadas durante 40 minutos a 37 ° C. Um inibidor específico de ALDH1, diemethylamino-benzaldeído (DEAB), foi usada para controlar a fluorescência de fundo. As células coradas foram analisadas utilizando o FACS Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) e classificados no ALDH1

de células de alta, que foram detectadas no canal de fluorescência verde (515-545 nm), e uma subpopulação de células com uma atividade ALDH1 baixa (ALDH1

células de baixa). Os dados foram analisados ​​usando o programa de software DIVA FACS (BD Biosciences). De modo a excluir as células não viáveis, 7-AAD (BD Biosciences) foi adicionado a uma concentração final de 0,25 ug /ml.

Colónia ensaio de formação de

As células separadas foram suspensos em 10 mL de RPMI-1640 e FBS a 10%, e 1 x 10

4 células foram plaqueadas em placas de cultura com 3 ml de metilcelulose contendo meio RPMI-1640 suplementado com FBS a 10%, de acordo com o protocolo de Rahadiani et ai. [8]. As células foram coradas com violeta de cristal (0,05% w /v), para visualizar as colónias, e o número de colónias foi contado após dois meses.

A viabilidade celular ensaio

Para avaliar a viabilidade celular , as células separadas foram plaqueadas a 5 x 10

3 células por placas de 96 poços (Corning, Corning, NY, EUA) durante um dia e depois incubadas com várias concentrações de vincristina, ciclofosfamida e etoposido (Wako, Osaka, Japão ) por três dias. Subsequentemente, o grau de viabilidade celular foi investigada utilizando o Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japão) de acordo com o protocolo do fabricante.

A diferenciação de adipocitos ensaio

Para o ensaio de diferenciação de adipocitos, as células separadas foram plaqueadas a uma densidade de 1 x 10

4 células por placa de 6 poços (Corning, Corning, NY, EUA) com 0,1% de DMSO durante três dias. Depois de oito dias em meio RPMI, contendo 1 ug /ml de insulina, 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina, dexametasona 10 mM, 1% de penicilina /estreptomicina e FCS a 10%, a acumulação de lípido neutro foi detectada em células fixadas em 10% de formaldeído células fixadas utilizando Oil Red o (Wako, Osaka, Japão) de acordo com o protocolo de Hwang et ai. [12].

Neurogênese ensaio de imunofluorescência e

Para o ensaio neurogénese, as células separadas foram plaqueadas a uma densidade de 1 x 10

4 células por placa de 6 poços e tratadas com 100 nM ATRA (ácido retinóico all-trans, Wako, Osaka, Japão). Depois de três semanas, as células foram coradas com MACN (1/200) (123C3, monoclonais, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) através de imunofluorescência de acordo com o protocolo de Walter et al. [6], e os núcleos foram contrastadas com DAPI (Dojindo).

Para a coloração de imunof luorescência, as células separadas foram fixadas em 4% de PFA e bloqueada em meio contendo 3% de BSA e 0,1% de Triton X-100 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japão). As células separadas foram coradas durante a noite a 4 ° C, e Alexa Fluor 488 IgG de cabra anti-ratinho (1/1000) (A11001, Life Technologies) anticorpos foram utilizados como anticorpos secundários. Todos os resultados de coloração foram analisados ​​com o dispositivo BZ-9000 (KEYENCE, Osaka, Japão).

transplante de xenoenxerto

As células separadas foram recolhidas e ressuspendidas a uma concentração de 10

2- 10

4 células por 100 ul de meio RPMI-1640 e depois misturado com 100 ml de Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). A mistura de células-Matrigel foi subsequentemente injectado no espaço subcutâneo em /-imunodeficiência 4 semanas de idade não obeso diabético grave combinada (NOD /SCID) (NOD. CB17-Prdkc

SCID /J, Laboratório Charles River , Yokohama, Japão) sob anestesia geral. O crescimento do tumor foi monitorado a cada dois dias e verificou se os tumores foram formados por dois meses

Os experimentos foram revistos e aprovados pela Comissão, da Universidade de Osaka Experimentação Animal. (número de autorização: 23-080-004) e conduzido de acordo com as diretrizes institucionais. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Imunohistoquímica

Os tumores de xenoenxerto dos ratos e as amostras clínicas foram embebidos em parafina, fixadas e analisadas para hematoxilina, miogenina (1/200) (5FD , policlonal, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA), desmina (1/200) (H-76, anticorpos policlonais, Santa Cruz Biotechnology) e ALDH1 (1/200) (44 /ALDH, monoclonais, BD Biosciences) utilizando coloração imuno-histoquímica (IHC). Como um anticorpo secundário, foram utilizados anticorpos anti-ratinho com peroxidase de rábano (HRP) de coelho marcado com (Dako, Glostrup, Dinamarca). Os resultados da coloração foram visualizados com o EnVision + único reagente-Kit (Dako).

análise de PCR quantitativo em tempo real

quantitativa PCR em tempo real foi realizado utilizando o dispositivo AB7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) para determinar a express relativa dos genes ALDH1 (ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L1 e ALDH1L2), os genes de transportadores ABC (ABCG2 /BCRP, ABCB1 /MDR1 e ABCA2), oncogene (c-Myc ) e marcador stemness (Sox2).

O ARN total foi extraído utilizando NucleoSpin ARN (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha). A transcrição reversa foi realizada utilizando a mistura de RT PrimeScript mestre (Takara, Shiga, Japão) de acordo com o protocolo do fabricante.

em tempo real as reacções de PCR foram realizadas em triplicado usando a mistura de SYBR Verde Super platina com ROX (Vida Technologies) em AB7900HT. O gene de manutenção, desidrogenase gliceraldeído 3-fosfato (GAPDH), serviu como um controlo interno, tal como é expresso de forma estável em diferentes tecidos. A Tabela 1 lista os iniciadores utilizados para PCR em tempo real. Os níveis de expressão foram calculados com base no 2

método -ΔΔCT.

Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote de software GraphPad Prism6 (GraphPad Software, La Jolla , CA, EUA).

valores P

de 0,05 foram considerados estatisticamente significativos de acordo com o teste exato de Fisher para o transplante de xenoenxerto e

t

-teste para os outros experimentos

Student Resultados.

Detecção e características de ALDH1

células de alta como CSCs em RD e as células Kym-1 |

inicialmente tentou identificar a ALDH

células de alta em RD e as células Kym-1 utilizando um ensaio ALDEFLUOR. Nas células RD, a razão entre os ALDH1

de células de alta coradas com BAAA foi de 4,1%, enquanto que aqueles dos coradas com BAAA e DEAB como um controlo negativo foi de 0,2%. Portanto, a relação genuína dos ALDH1

células de alta foi de 3,9% de todas as células RD cultivadas (Fig 1A). Do mesmo modo, o rácio das ALDH1

de células de alta foi de 8,2% em KYM-1 células (Fig 1B)

RD (A) e KYM-1 células (B) foram coradas com DEAB (controlo.: painel da esquerda) ou sem DEAB (painel da direita) após ter sido coradas com BAAA e, em seguida, analisada utilizando FACS Aria II com o kit de ensaio de ALUDEFLUOR. A proporção de ALDH1

de células de alta foi de 3,9 ± 0,26% nas células RD e de 8,2 ± 0,14% em células as KYM-1. A média ± SD foi calculada a partir de três experiências independentes. Todos ALDH1

células de alta e um subconjunto dos ALDH1

células baixas foram classificadas como mostrado nos painéis direito da figura 1A e 1B.

Em seguida, foi realizado um ensaio de formação de colónia documentar a capacidade de auto-renovação das ALDH1

células de alta e ALDH1

células de baixa. Por conseguinte, o número de colónias de ALDH1

de células de alta foi maior do que a de ALDH1

células baixas (30,3 vs 14,5 colónias /poço, respectivamente, p 0,05) (Fig 2A e 2B). Os ALDH1

células de alta, portanto, tinha uma capacidade maior formação de colónias do que os ALDH1

células de baixa.

A, ensaio de formação de colónias. O número de colónias que eram macroscopicamente visível, derivada das ALDH1

alto e ALDH1

células de baixa de células RD, foi contada e marcou de dois meses após o plantio. A média ± SD foi calculado a partir de três experimentos independentes (nove poços para ALDH1

células de baixa altas ou ALDH1

no total). Os ALDH1

células de alta formado significativamente mais colónias do que os ALDH1

células de baixa. B, Imagens representativas de colônias são apresentados no painel da esquerda (ALDH1

alto) e o painel direito (ALDH1

baixo).

No que respeita à chemoresistance, examinamos a taxa de sobrevivência de os ALDH1

células de alta nas células RD e células KYM-1 cultivadas com vincristina, ciclofosfamida e etoposide usando o (ensaio WST-8) celular Counting Kit-8. A viabilidade das ALDH1

de células de alta após cultura com vincristina, ciclofosfamida e etoposido foi significativamente maior do que a dos ALDH1

células de baixa tratadas com estes agentes quimioterapêuticos, sugerindo que os ALDH1

de células de alta possuía uma capacidade maior para chemoresistance do que os ALDH1

células baixas (Fig 3).

O ALDH1

células de alta e ALDH1

baixa de RD (A) e as células KYM-1 (B) foram tratados com 100 nM-10 ^ M de vincristina, 5 mM-15 mM e ciclofosfamida 10 uM-100 uM etoposido e a viabilidade celular foi medida após 72 horas, utilizando um ensaio de WST-8. A viabilidade das células “sem tratamento” também foi medida como um controlo. A média ± SD foi calculada a partir de poços em triplicado de uma experiência representativa, e os dados de três experiências independentes são apresentados na figura. A viabilidade das ALDH1

de células de alta foi significativamente maior do que a dos ALDH1

células baixos.

Como CSCs foram documentadas para expor pluripotência, analisou-se a capacidade de diferenciação do ALDH1

células de alta para adipócitos e células neuronais nas células RD. Os ALDH1

células de alta foram encontrados para ser mais rica, com gotículas lipídicas coradas com Oil Red O que os ALDH1

células de baixa (Fig 4A), e colorações positivas foram observadas para MACN na ALDH1

células de alta, indicativa de diferenciação neuronal (Fig 4B). Estes resultados indicam que os ALDH1

células elevados de células RD têm a capacidade de se diferenciar em adipócitos e células neuronais, indicando potencial pluripotência.

a, ensaio de diferenciação de adipocitos. Os ALDH1

altos e ALDH1

células de baixa de células RD foram cultivadas em um meio de diferenciação dos adipócitos. O ensaio foi repetido três vezes, e imagens representativas de Oil Red O coloração são mostrados no painel esquerdo (ALDH1

alta) e no painel da direita (ALDH1

baixo) (x 40). gotículas lipídicas de adipócitos manchado de vermelho com Oil Red O. B, ensaio de diferenciação de células neuronais. Os ALDH1

altos e ALDH1

células de baixa de células RD foram tratados com 100 ácido retinóico nM e coradas para MACN (verde). Os núcleos foram contrastadas com DAPI (azul). O ensaio foi repetido três vezes, e as imagens representativas de imunofluorescência são mostrados no painel esquerdo (ALDH1

alto) e no painel direito (ALDH1

baixo).

O tumor -initiating capacidade do ALDH1

células de alta nas células RD foi examinado pela injeção de 1 × 10

2, 1 × 10

3 e 1 × 10

4 ALDH1

células de alta em NOD /SCID; ALDH1

células baixas também foram injectados do mesmo modo. Consequentemente, a formação do tumor foi observada em dois dos sete ratinhos injectados com 1 x 10

3 ALDH1

de células de alta e cinco dos seis ratinhos injectados com células de 1 x 10

4 ALDH1

elevados, enquanto não foram encontrados tumores em ratinhos injectados com ALDH1

células de baixa em qualquer densidade celular (p 0,05, Quadro 2 e Figura 5A). Estes resultados mostram que os ALDH1

células de alta têm uma capacidade de iniciação tumor significativamente maior do que os ALDH1

células de alta.

A, Imagem representativa de um rato NOD-SCID tumor-rolamento. (Direita: ALDH1

células de alta, para a esquerda: ALDH1

células de baixa). B-D, imuno-histoquímica (IHC) coloração das secções de tumor de xenoenxerto. As secções foram coradas por hematoxilina, marcadores miogénicos (desmina (B), Miogenina (C)) e ALDH1 (D). As células tumorais foram positivas para desmina e miogenina, enquanto apenas algumas células foram positivas para ALDH1, sugerindo que o ALDH1

células de alta promovido rabdomiossarcoma e foram reconstituídas para incorporar toda a gama de heterogeneidade.

O ALDH1

células de alta demonstrado uma capacidade de iniciação tumor maior do que os ALDH1

células de alta. Os dados de dois experimentos independentes estão resumidos.

Em seguida, foi realizada imuno-histoquímica (IHQ) coloração das secções de tumor xenoenxerto do ALDH1

células de alta

. Estas células foram coradas positivas para marcadores miogénicos (desmina, miogenina) e ALDH1 (Fig 5B-5D). As células tumorais foram positivas para a desmina e miogenina, enquanto apenas uma poucas células foram positivas para ALDH1, sugerindo que a ALDH1

de células de alta promovido rabdomiossarcoma e foram reconstituídas para incorporar a heterogeneidade completo.

Tomados em conjunto, nós concluiu que ALDH1

células de alta são enriquecidos com CSCs de RD e KYM-1 células.

os níveis de mRNA de ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L2, ABCB1, ABCG2 e Sox2 foram upregulated na ALDH1

altos células de células RD

Além disso, nós investigamos os níveis de vários membros da família ALDH1 (ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L1 e ALDH1L2) expressão nas células RD. Como resultado, os níveis de expressão de ALDH1A3, ALDH1B1 e ALDH1L2, mas não ALDH1A1, nas ALDH1

de células de alta foram aumentados em comparação com a observada nos ALDH1

células de baixa (Fig 6A).

Uma análise quantitativa por PCR em tempo real foi realizado para avaliar os níveis de ALDH1 (a), os marcadores stemness (B) e transportadores ABC (C) de expressão. A média ± SE foi calculada a partir de poços em triplicado de uma experiência representativa, e os dados para uma de três experiências independentes são apresentados na figura. A expressão de ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L2, Sox2 e ABC transportadores foi significativamente maior nos ALDH1

células de alta do que nos ALDH1

células baixas (p 0,01).

Em seguida, investigámos se sup>

células elevados em relação à ALDH1

células de baixo, ao passo que não há um aumento significativo foi observado na expressão de c-Myc (Fig 6B).

Os níveis de expressão relativa dos três principais transportadores de drogas ABCG2 /BCRP, ABCB1 /MDR1 e ABCA2 foram também examinados. Curiosamente, o ALDH1

células de alta mostraram um aumento da expressão de todos os transportadores, sugerindo que ALDH1

células de alta tem uma capaciity maior para chemoresistance que ALDH1

células de baixa (Fig 6C).

Discussão

O conceito de CSCs tem sido proposto [13]. CSCs são definidos por duas características principais, tumorigenicidade aumentada e a capacidade de auto-renovação /diferenciação [14]. Portanto, a população CSC isolado não só dá origem a de novo de tumores com alta eficiência, mas também recapitula o tumor com tanto populações não-CSC CSC e. Além disso, a maioria dos CSCs exibir resistência a terapias anti-câncer convencionais usando agentes quimioterápicos e radiação ionizante [2]. Até à data, os CSCs foram identificados em várias malignidades, incluindo a leucemia mieloide aguda [15], tumores cerebrais [16], o carcinoma hepatocelular [17], o cancro da mama [7], o cancro do pulmão [18], o cancro pancreático [19] e do ovário cancerosas [8].

ALDH enzimas constituem uma família de enzimas constituídas por 19 isoformas localizadas no citoplasma, mitocôndrias e núcleos. ALDHS são responsáveis ​​para a oxidação de aldeídos a ácidos carboxílicos. Enquanto muitos aldeídos desempenhar um papel fundamental em processos fisiológicos, tais como visão, neurotransmissão e o desenvolvimento embrionário, a maioria dos aldeídos são citotóxicos e deve ser destoxificada, conforme avaliada pelo Marchitti et al [20].

Um método amplamente aceite para identificar CSCs baseia-se na detecção da actividade enzimática de ALDH1, enzima responsável pela oxidação dos aldeídos intracelulares um desintoxicante. A elevada actividade de ALDH1 em CSCs foi usado para isolar CSCs em malignidades diferentes [6, 7, 8, 16, 18, 21, 22]. Portanto, ALDH1

células de alta apresentam características tipicamente encontrados em CSCs, incluindo a auto-renovação, diferenciação e altas habilidades de iniciação do tumor.

Nós confirmamos que o ALDH1

células de alta da RD e KYM- 1 células possuem as características de CSCs e, numa outra experiência utilizando células RMS-ym, uma linha celular de ERM, foi examinada a actividade de ALDH. Ao contrário do que a observada em células RD e KYM-1, não há ALDH1

células foram detectados elevados. Em seguida, como CSCs foram documentadas para ter a capacidade para formar esferas, examinamos a capacidade de formação de esfera dessas células. Por conseguinte, o RD e células KYM-1 formado grandes esferas, enquanto que as células RMS-ym não formaram esferas, em meio isento de soro (dados não mostrados). Estes resultados reforçam a hipótese de que ALDH1

células de alta possuir características de CSCs.

De acordo com Lohberger et al. [23] e Awad et ai. [24], ALDH1

células elevados são tipicamente isoladas a partir de linhas de células humanas de sarcoma (fibrossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma sinovial, e sarcoma de Ewing). O estudo demonstrou que ALDH1

de células de alta são caracterizados por uma elevada taxa de proliferação, a formação de colónias e de expressão de genes transportadores de ABC e marcadores stemness (β-catenina, Sox2 e Nanog). No estudo atual, ALDH1

células de alta exibiu a formação de colónias, bem como um aumento da expressão gênica de transportadores ABC (ABCB1, ABCG2 e ABCA2) e marcadores stemness (Sox2). Por conseguinte, os nossos dados sugerem que ALDH1 é também um potencial marcador de CSCs em ERMS.

O ensaio ALDEFLUOR foi desenvolvido para detectar a actividade da isoforma ALDH1 por isolamento com sucesso de células estaminais hematopoiéticas viáveis ​​a partir de sangue de cordão umbilical humano [25 ] e foi relatado como sendo específico para a isoforma ALDH1 encontrada em abundância elevada nestas células, ALDH1A1 [26]. No entanto, enquanto que outras isoformas individuais ALDH fazer exibir alguma especificidade para o substrato preferido, eles também exibem reactividade cruzada, o que torna provável que o ensaio ALDEFLUOR irá detectar a actividade de várias isoformas ALDH1 ALDH expressas nas células [27]. No presente estudo, a expressão de ALDH1A3, ALDH1B1 e ALDH1L2 nas ALDH1

células de alta foi aumentado, enquanto que a de ALDH1A1, que é pensado para desempenhar um papel funcional importante em células-tronco, e não foi aumentada no ALDH1

células de alta. Marcato et ai. [28] relataram que o aumento da actividade de ALDH em células estaminais de cancro da mama é devido aos efeitos da isoforma ALDH1A3, enquanto Chen et al. [29] relatou que ALDH1B1 é mais profundamente expressa em adenocarcinomas do que ALDH1A1, embora a função ea localização celular da ALDH1L2 permanecem desconhecidos. Uma vez que os nossos dados são consistentes com estes resultados, os CSCs de células RD também podem ter características semelhantes às de células de tumores epiteliais.

Um mecanismo proposto para a quimiorresistência de CSCs baseia-se na expressão aumentada de cassete de ligação de ATP (ABC), proteínas de transporte que são responsáveis ​​por efluxo de drogas [30]. A expressão elevada de transportadores ABC em células estaminais em comparação com células não estaminais resulta em resistência relativa das células estaminais para os efeitos tóxicos de medicamentos de quimioterapia. Neste estudo, analisamos a expressão de três transportadores de drogas (ABCG2 /BCRP, ABCB1 /MDR1 e ABCA2) da família transportador ABC e descobriu que todos os transportadores ABC foram upregulated nas ALDH1

células de alta de RD. Além disso, os ALDH1

de células de alta mostrou o aumento da resistência à vincristina, ciclofosfamida e etoposido, vulgarmente utilizados como os fármacos quimioterapêuticos de rabdomiossarcoma. Na verdade, foi realizada a imunohistoquímica utilizando os espécimes de ERMS, ressecados antes e após a quimioterapia, e descobriu que os espécimes ressecados após a quimioterapia apresentaram uma maior expressão ALDH1 citoplasmática do que o espécime primários (Fig 7A e 7B).

a amostra de biópsia de ERMS obtidos antes da quimioterapia (a) e os espécimes ressecados obtidos após a quimioterapia (B) corados positivo para ALDH1 em imuno-histoquímica. Estas amostras foram retiradas do tecido ERMS vagina,-originado de uma menina de 1 ano de idade. Os espécimes ressecados após a quimioterapia apresentaram uma maior expressão ALDH1 citoplasmática do que os biópsia primários.

Estes dados sugerem que a expressão mais elevada do transportador ABC observada nos ALDH1

células de alta faz com que o chemoresistance. Além disso, estes resultados são semelhantes às células de populações lado (células SP), que expressam vários transportadores ABC responsáveis ​​pela resistência à droga, incluindo ABCG2 (BRCP) [31]. Komuro et ai. [32] relataram células SP foram detectados em RD usando FACS com corante Hoechst. Na verdade, de acordo com Yasuda et al. [33], as células SP e ALDH1

células de alta sobrepõem em células-tronco do câncer de ovário. Portanto, as populações de células de SP, e os ALDH1

de células de alta podem sobrepor-se em rabdomiossarcoma bem.

Este é o primeiro estudo a documentar que ALDH1 pode ser usado como um marcador para o RMS. Nós também usamos uma linha RMS alveolares (braços) célula (RH30) e examinou a atividade de ALDH. Embora ALDH1

células de alta de células RH30 foram detectadas, de forma inesperada os ALDH1

células de alta dos braços não formam colónias ou esferas (dados não mostrados). Uma provável explicação desse fenômeno é que os dois principais subtipos RMS surgem de diferentes células de origem, tendo em conta as distinções clínicas e biológicas substanciais entre eles, como publicado anteriormente pela Pressey et al. [34]. Estamos planejando para examinar se ALDH1 pode ser usado como um marcador em outras linhas celulares braços.

Nos últimos anos, a pesquisa com células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) tem feito progressos rápidos e tem sido aplicada para o campo da oncologia. Oshima et al. [35] relataram a geração de CSCs induzidas (iCSCs) através da introdução de factores definidos (OCT3 /4, Sox2 e KLF4) em linhas celulares de cancro colorrectal humano. Como resultado, os níveis de expressão foram ALDH1 aumentado nos iCSCs. Portanto, ALDH1 pode estar relacionada a propriedades e função CSC como uma ferramenta útil para a pesquisa sobre CSCs. Embora a teoria das células-tronco do câncer permanece controverso [36], nossos resultados suportam a existência de CSCs em ERMS, e acreditamos que ALDH1 pode ser útil para a detecção de CSCs como um alvo terapêutico.

Em conclusão, confirmamos que os ALDH1

células de alta de ERMS possuem características de CSCs, incluindo habilidades de formação de colônia, chemoresistance e iniciação tumor. Estes resultados sugerem que ALDH1 é um marcador potencialmente útil das CSCs em ERMS.