Abstract

A terapia genética representa uma estratégia atraente para o tratamento não invasivo do câncer de próstata, onde as intervenções clínicas atuais mostram eficácia limitada. Aqui, avaliamos a utilização do virus de insecto, baculovirus (BV), como um vector de novo para a terapia genética do cancro da próstata humano. Uma vez que os tumores de próstata representam um ambiente heterogéneo, uma abordagem terapêutica que atinja regressão a longo prazo deve ser capaz de se direccionar múltiplas populações de células transformadas. Além disso, a discriminação de direccionamento da maligna em comparação com células não-malignas teria valor para minimizar os efeitos secundários. Nós empregamos uma série de modelos de cancro da próstata para analisar o potencial de BV para atingir essas metas.

In vitro

, ambas as linhas de células da próstata tradicionais, bem como células epiteliais ou do estroma primárias derivadas de biópsias da próstata de pacientes, em culturas de duas ou três dimensões, foram usadas. Também avaliamos BV

in vivo

em modelos de xenotransplante de cancro da próstata murinos. BV era capaz de preferencialmente transdução de linhas malignos invasivos de células de câncer de próstata em comparação com câncer em estágio precoce e amostras não-malignas, uma restrição que não era uma função da importação nuclear. De maior relevância clínica, células de cancro da próstata derivadas do paciente primários foram também transduzidas de forma eficiente pela BV, com taxas robustas observada em células epiteliais de fenótipo basal, que expressaram os transgenes codificados BV-mais rapidamente do que as células epiteliais de um fenótipo mais diferenciado, luminal. A capacidade máxima de transdução foi observado em células do estroma. BV foi capaz de penetrar através de estruturas tridimensionais, incluindo

in vitro

esferóides e

in vivo

xenotransplantes ortotópicos. BV vectores que contêm um transgene nitro-redutase em uma abordagem de terapia de enzima pró-fármaco dirigida por genes foram capazes de matar alvos de forma eficiente malignas da próstata após a administração do pró-fármaco, CB1954. Assim, BV é capaz de transduzir uma grande proporção dos tipos de células de próstata dentro de um tumor de próstata 3-D heterogéneo, pode facilitar a morte de células utilizando uma abordagem de pró-droga, e mostra-se promissor como um vector para o tratamento de cancro da próstata.

Citation: Swift SL, Rivera GC, Dussupt V, Leadley RM, Hudson LC, MA de Ridder C, et al. (2013) Avaliar Baculovirus como um Vector de Terapia Genética do cancro da próstata humana. PLoS ONE 8 (6): e65557. doi: 10.1371 /journal.pone.0065557

editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Porto Oncology, Portugal |

Recebido: 01 de fevereiro de 2013; Aceito: 26 de abril de 2013; Publicação: 06 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Swift et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi realizado em projectos em colaboração financiados pela União Europeia: Iniciativa da próstata para ‘porco’ Gene Therapy (5º PQ), Baculogenes (FP6) e Gene Therapy: Uma Abordagem Integrada para “gigante” Neoplásicas Tratamento (FP6), com apoio adicional de Pesquisa do Câncer Yorkshire . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

no Reino Unido, mais de 40.000 novos casos de câncer de próstata são diagnosticados a cada ano e 11.000 pacientes morrem como resultado direto da doença (Fonte: Office for National Statistics). A próstata humana é um ambiente heterogéneo, composta principalmente de tipos de células epiteliais e do estroma. O compartimento epitelial é composta por uma bi camada de células: a camada basal contínua de células indiferenciadas que estão em contacto com a membrana basal, sobreposto com células luminais secretoras diferenciadas [1]. A camada epitelial basal representa o compartimento mais proliferativa [2]. Embora a maior parte da maioria dos tumores da próstata compreende células de origem epitelial [3], vários tipos de células têm a capacidade de contribuir para a malignidade, e deve ser erradicada, a fim de alcançar um resultado clínico eficaz.

Normalmente, a fase da doença da próstata e da capacidade de resposta do tumor aos andrógenos são dois factores-chave que as estratégias de tratamento direto. Enquanto os tumores da próstata localizado pode ser ressecada cirurgicamente através de prostatectomia radical, esta é muitas vezes acompanhada por efeitos colaterais indesejáveis. Uma abordagem alternativa, a terapia de ablação de androgénios, remove o fornecimento de androgénios que muitos tumores da próstata dependem para o crescimento e sobrevivência; No entanto, a recorrência de cancro da próstata resistente à castração mais agressivo (CRPC) é um resultado comum. Desde CRPC é, em última análise resistentes à radioterapia e quimioterapia, novas estratégias são essenciais para proporcionar melhores resultados para pacientes com câncer de próstata. A terapia genética é uma solução potencial, e seria idealmente posicionado para atingir ambos os tumores de próstata primários e secundários após a administração sistémica.

Enquanto muitos vectores diferentes foram avaliados quanto à segurança e eficácia em ensaios de terapia genética [4], o uso de não-humanos, os vírus não-patogênicos, como o baculovirus,

Autographa californica

múltipla Nucleopolyhedrovirus (

Ac

MNPV), é uma área relativamente pouco estudada. BV é um vírus de ADN de cadeia dupla que infecta naturalmente os insectos hospedeiros, e embora BV pode transduzir eficientemente células de mamíferos, a replicação produtiva não é possível devido à exigência de uma maquinaria celular específica de insectos [5], [6]. Como um vector de terapia genética, BV tem várias vantagens inerentes. A maior parte da população humana não tem nenhuma exposição prévia a BV e é, portanto, imunologicamente naive. O capsídeo BV é capaz de se expandir para acomodar grandes inserções de transgene, eo tropismo natural de baculovirus é facilmente modificada. BV é capaz de transduzir tanto activamente se dividem e células de mamífero quiescentes, uma característica que é particularmente relevante no tratamento de cancro da próstata, um tumor de crescimento lento [7]. A presença de baculovírus, mesmo a uma elevada multiplicidade de infecção (MOI), não é tóxico e não afecta o crescimento celular e diferenciação [8], [9]. Finalmente, extensos estudos de segurança a longo prazo, realizados na década de 1960, quando baculovirus surgiu como uma perspectiva importante como um inseticida biológico, provaram baculovirus inofensiva para o homem [10].

A capacidade de BV para entregar transgene funcionalmente sustentável expressão em células de mamífero foi demonstrado pela primeira vez em 1995 [11]. Desde então,

Ac

MNPV demonstrou ser capaz de transduzir uma vasta gama de tipos de células de mamíferos, incluindo neurónios primários humanos [12], fígado [11], as células estaminais mesenquimais [13] e de células estaminais embrionárias [9] . Enquanto as primeiras tentativas para conseguir a transferência de genes mediada por BV

In vivo

falhou devido a inactivação vector por componentes do soro, tais como complemento [14], a transdução eficiente de baculovírus pode ser conseguida na presença de químico- ou em proteínas inibidores do complemento com base, quer como co-inóculos [15], [16], [17] ou incorporação na proteína de envelope BV [17], [18], [19]. BV tem sido usada com sucesso como um vector de terapia genética pré-clínico

In vivo

[12], [20], [21], [22], gástrico murino [23], e no contexto de cancro foi tratado com sucesso xenoenxertos [24].

Aqui, avaliamos BV como um vector de terapia genética para o tratamento do cancro da próstata humano. Descreve-se a utilização de BV para transduzir e entregar preferencialmente ambos os genes repórter e de células letais para amostras de próstata malignas de linhagem celular e de origem do paciente, para além de culturas tridimensionais e

tumores murinos in vivo

, com alta eficiência.

Materiais e Métodos

Insect celular Linha Manutenção

Sf21 e Sf9 (Invitrogen) linhas celulares (isolados do tecido ovariano do worm exército queda,

Spodoptera frugiperda

) foram mantidas em frascos Spinner pendurado barra de agitação a 27 ° C em meio de Grace suplementado com 10% de soro de vitelo fetal (PAA Laboratories) e 0,1% (v /v) de Pluronic F-68 (Invitrogen). culturas de monocamada foram mantidas na ausência de Pluronic.

da próstata humano linha celular de manutenção

LNCaP (, células cancerosas sensíveis-andrógenos bem diferenciados da próstata derivadas de uma metástase de gânglio linfático) e PC-3 (, células de cancro independente de androgénios pobremente diferenciadas da próstata derivadas de uma metástase óssea) foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, EUA). PC346C (, células cancerosas andrógeno-sensíveis bem diferenciados da próstata derivadas de um tumor de próstata primário) foram estabelecidos no Centro Médico Erasmus, Países Baixos [25]. P4E6 (células epiteliais derivadas de um tumor da próstata primário bem diferenciado imortalizadas por transfecção com E6 de HPV), PNT1A e PNT2C2 (não-maligno de células de próstata de pacientes diferentes, respectivamente, imortalizadas por transfecção com SV40) foram estabelecidos no nosso laboratório [26] , [27]. Todas as células foram tratadas em condições de boas práticas de laboratório em janelas de passagem definida, foram mensal certificadas como livres de micoplasma e foram genotipados (usando o sistema PowerPlex 1.2 ATCC-aprovado, Promega) para garantir a autenticidade. As células foram rotineiramente passadas sob condições previamente descrito [28].

Cultura de células primárias

tecido da próstata do paciente foi tomada com o consentimento informado e e aprovação por escrito do Comitê de Ética em Pesquisa Iorque a partir de pacientes submetidos a ressecção transuretral da próstata, cistectomia ou prostatectomia radical. As células epiteliais foram isolados como descrito previamente [29] e seleccionado para α

2β

1

oi expressão utilizando adesão rápida para digitar placas I-colagénio revestidas (BD Biosciences). As células foram co-cultivadas em colagénio I Plasticware com células alimentadoras STO murinas irradiadas até que o crescimento foi bem estabelecido, em KSFM suplementado com 5 ng /mL de EGF, 50 ug /ml de extracto de pituitária de bovino e 2 mM de L-glutamina (KSFMsup). Para induzir a diferenciação, as células foram cultivadas numa mistura 50:50 (v /v) de DMEM e F12 de Ham, suplementado com 10% FCS, 10 nM de DHT e 2 mM de L-glutamina (DH10) durante 4-6 dias. As células do estroma isoladas foram propagadas em frascos T25 em meio RPMI suplementado com 10% FCS e 2 mM de L-Glutamina.

Baculovírus Preparação

vectores de baculovírus recombinantes foram construídos utilizando o estojo BacVector 1000 (Novagen), de acordo com as instruções do fabricante, com o pBAC64 feito por encomenda: CMV-EGFPCAT, pBAC64: CMV-EGFP ou pBAC64: plasmídeos de transferência de CMV-NTR-EGFP. Estes plasmídeos têm a espinha dorsal da pBAC4X-1 (Novagen) com inserções de o

polh

promotor e

gp64

gene que codifica sequências de pBACsurf-1 (Novagen) e o citomegalovírus (CMV) imediato precoce promotor da transcrição de EGFP, uma proteína de fusão EGFPCAT (BD Biosciences Clontech) ou mNitroreductase (NTR) dirigindo -IRES-EGFP cassetes de expressão. Os vírus recombinantes foram sujeitas a três ciclos de purificação em placa e stocks de título elevado foram cultivadas por infecção de células de insecto Sf21 a MOI = 0,1 unidades formadoras de placas (PFU) por célula e sobrenadante de colheita de vírus após 5 dias. Vírus sobrenadante contendo células foi concentrado por ultracentrifugação a 24000 rpm durante 90 minutos a 4 ° C utilizando um rotor Beckman SW28 e ainda purificado por ultracentrifugação através de um gradiente de sacarose a 24000 RPM num rotor Beckman SW41. partículas de vírus foram lavadas e ressuspensas em PBS (cerca de 1/500 do volume inicial) e titulado utilizando um ensaio de placas fágicas em células Sf9. A partícula: razão PFU foi geralmente dentro da gama de 100-300 [30], [31], [32]. Para a transdução das células da próstata, o vírus foi diluído em meio isento de soro adequado para cada tipo de célula, salvo indicação contrária.

Confocal análise de microscopia de monocamadas e bicamadas

Para ambos os monocamada e bicamada experimentos confocal , as células foram semeadas em lâminas de câmaras de 8 poços com uma base lamela (Lab-Tek) a uma densidade inicial de 2-5 x 10

4 células por poço (pré-revestidos com 0,1 mg /ml de poli-L-lisina para células de LNCaP). Para gerar uma bicamada, o meio foi mudado a cada 2 dias até se obter uma camada dupla de crescimento epitelial. BV [CMV-EGFPCAT] ou [BV CMV-EGFP] partículas foram adicionados a 500 UFP /célula de um determinado período de tempo após o qual as células foram lavadas para remover vírus não ligada e fixada imediatamente em 4% (w /v) de paraformaldeído . As células foram permeabilizadas em 0,5% (v /v) de Triton X-100 (Sigma) ou 70% de EtOH, depois bloqueados em soro a 10%. A proteína do capsídeo BV, vp39, foi detectada utilizando um anticorpo primário monoclonal (P10C6), cortesia do Dr. L. E. Volkman, University of California, Berkeley, EUA [33] e uma anti-rato Alexa Fluor 568 anticorpo secundário de cabra (Invitrogen). Em experiências de bicamada, as diluições de anticorpos foram preparados em 0,1% (w /v) de BSA Fracção V (Sigma) para ajudar a penetração na camada basal, enquanto que em experiências em monocamada, as diluições de anticorpo foram preparadas em PBS. Para a análise de diferenciação de células primárias, foi adicionado anticorpo HMWCK (Dako) com a aplicação subsequente de um Alexa 568 de anticorpo secundário de cabra anti-ratinho (Invitrogen). Aplicou-se então um segundo anticorpo primário (CK18-FITC (Sigma)). Vectashield contendo DAPI (Vector Lab) foi adicionado antes de visualizar as células sob a fluorescência utilizando um Zeiss LSM 510 meta microscópio confocal.

citometria de fluxo

As células foram plaqueadas a uma densidade de 0,2-1 × 10

5 por poço de uma placa de 48 poços e incubou-se a 37 ° C durante a noite. As células foram lavadas uma vez em PBS antes da adição de virus diluído em meio isento de soro adequado para cada tipo de célula. Após o período de tempo desejado, o vírus foi aspirado, as células foram lavadas uma vez em meio isento de soro e sobreposta em meio de crescimento contendo soro. As células foram descoladas utilizando tripsina:. EDTA e ressuspensas em 0,02% (w /v) de EDTA, com um mínimo de 10.000 eventos singlet ™ contadas utilizando um citómetro de fluxo ADP ciano

PC346C esferoidal Transdução

esferóides espontaneamente formados foram colhidos a partir da superfície de um frasco T25 contendo células PC346C e incubou-se durante 10 minutos a 37 ° C em meio de cultura completo contendo BV [CMV-EGFP] a uma concentração de 8,6 × 10

9 UFP /ml . Os esferóides foram diluídas em 2,5 ml de meio e re-plaqueadas para um balão T12.5. imagens fluorescentes foram capturadas usando um microscópio Nikon Eclipse TE300 em três dias após a infecção.

ortotópico xenoenxertos

Os tumores foram estabelecidos pela injeção de 1 × 10

6 células PC346C ortotopicamente no dorsolateral próstata de ratos atímicos (NMRI nu /nu, Taconic M BA /S, Ry, Dinamarca), como descrito anteriormente [34], em conformidade com os procedimentos éticos e sob a aprovação do comitê de ética Erasmus Experimental animal Center. O crescimento tumoral foi monitorado por ultra-sonografia transretal, utilizando um sistema de ultra-som intravascular adaptada [35]. Em tamanhos de tumores entre 80 e 120 mg, duas doses de (3 × 10

7 ou 1 × 10

8 pfu) de BV [CMV-EGFP] intratumoralmente foram administradas sob anestesia. Os animais foram sacrificados 3 dias mais tarde, os tumores foram colhidos, fixo durante 2 h em 2% (w /v) de paraf ormaldeído em PBS, cortado em uma Vibratome (Campden Instruments, Loughborough, Reino Unido) em 70 mm de espessura e montadas em lâminas de vidro em Vectashield (Vector Lab). expressão EGFP foi visualizada por microscopia confocal (Carl Zeiss, Benelux).

A avaliação da viabilidade das células pelo ensaio MTS

As células foram plaqueadas a uma densidade de 1 × 10

4 células por poço numa placa de 96 poços e deixadas fixar durante a noite. BV [CMV-NTR-EGFP] foi adicionado a cavidades triplicadas a uma moi = 500, durante 4 horas, lavadas e incubadas durante mais 20 horas antes da adição de CB 1954 (20? M para todas as amostras primários e linhas celulares excepto para PC-3, para o qual foi usado 40 uM). Após mais 48 h para linhas de células ou 30 h para as células primárias, a viabilidade celular foi medida utilizando CellTiter a 96® Aqueous Reagente de Ensaio (Promega) de acordo com as instruções e as placas do fabricante lida utilizando um leitor de placas BMG Labtech Polarstar OPTIMA. A percentagem de células mortas foi calculada por comparação de células viáveis ​​em um poço não transduzidas. Um conjunto duplicado de poços foram usados ​​para citometria de fluxo, como descrito acima para determinar a frequência de células transduzidas de forma positiva.

Resultados

BV Transdução é mais eficiente em linhas de células da próstata malignas em comparação aos não-malignas controlos

de forma a determinar a capacidade de BV para transduzir diferencialmente contra alvos de próstata não-malignas malignas, foi avaliada a susceptibilidade de um painel de linhas de células da próstata humanas estabelecidas à BV transdução. As células foram incubadas com um vector recombinante BV modificados para transportar um transgene EGFPCAT (BV [CMV-EGFPCAT]) utilizando uma MOI fixo de 500 e um tempo de incubação de 48 h. linhas de células malignas, com um elevado potencial metastático, incluindo LNCaP, PC3 e PC346C, foram altamente transduzidas (~ 80% de células positivas para EGFP-), enquanto que as linhas de células não malignas e PNT1A PNT2C2 foram menos transduzidas (até 10% de células positivas para EGFP-) (Figura 1A). P4E6, uma linha celular derivada de um tumor de fase iniciada, mas cedo, estava na gama intermédia, com células de aproximadamente 20% EGFP-positivo (Figura 1A). Assim, a frequência de células transduzidas positivamente pela BV correlacionada com malignidade e potencial metastático.

(A) Percentagem de células EGFP positivos seguintes transdução de um painel de alto grau maligna (vermelho), de baixo grau maligna (preto ) ou não-malignas (linhas de células azul) da próstata com BV [CMV-EGFPCAT] a MOI = 500 durante 48 h. As barras de erro representam – /+ um desvio padrão. (B) os níveis de expressão relativos de EGFP seguintes transdução com BV [CMV-EGFPCAT] em um MOI de saturação (500 para LNCaP, PC3 e PNT1A, 1000 para PNT2C2). A percentagem de células positivas para EGFP-foi normalizada para os níveis atingidos após 48 h de incubação na presença de vírus para cada tipo de célula (definido como 1). linhagens de células malignas: PC3 (▴), LNCaP (▪); As linhas de células não-malignas: PNT2C2 (♦), PNT1A (▾). As barras de erro representam – /+ um desvio padrão. (C) confocal imagens de microscopia (única fatia ou Z-stack) de células LNCaP, PC3 ou PNT1A BV-transduzidas às 8 h pós-transdução (MOI = 500). fluorescência vermelha indica capsídeo BV (anti-vp39), coloração nuclear em azul (DAPI) e expressão EGFP BV-impulsionado em verde.

Para investigar as condições óptimas para a transdução altamente suscetíveis (LNCaP, PC- 3) versus menos susceptíveis (PNT1A e linhas de células de próstata PNT2C2), foram analisados ​​tanto o MOI necessária para alcançar a saturação de transdução e a cinética de transdução neste MOI. As células foram incubadas durante 1 h na presença de doses crescentes de BV [CMV-EGFPCAT], e a proporção de células positivas para EGFP-foi analisada após 24 horas. A MOI necessária para atingir o máximo de frequência de células transduzidas foi de 500 pfu por célula para LNCaP, PC3 e PNT1A, e 1000 pfu por célula para PNT2C2 (dados não mostrados). Usando estes MOIs saturação, a cinética de transdução foram investigados ao longo do tempo. linhagens de células prostáticas malignas (LNCaP e PC-3) demonstraram absorção rápida e eficiente da BV [CMV-EGFPCAT], exigindo tempos de incubação única curtas (-45 ou -90 min, respectivamente) para chegar a 50% dos níveis registrados em 48 h (Figura 1B). linhas de células de próstata Por outro lado, não malignas (PNT1A e PNT2C2) necessários tempos de incubação estendidos (~ 10 ~ 8 h ou h, respectivamente) para atingir 50% dos níveis às 48 horas (Figura 1B).

Uma interpretação destas diferenças de transdução é que a importação nuclear do capsídeo BV é defeituoso em alguns tipos de células (revisado por [36]). Para avaliar esta hipótese em nossos modelos de linhas de células da próstata, a localização subcelular de BV cápsides foi investigada utilizando microscopia confocal a 8 horas após a transdução nas linhas celulares LNCaP maligna e PC-3 altamente sensíveis e a linha celular PNT1A não-maligna menos susceptíveis . BV cápsides foram observados no núcleo de todos os três tipos de células (Figura 1C), e análise visual de múltiplos campos de visão, não revelou quaisquer diferenças nos níveis de localização cápside nuclear. No entanto, as células PC-3 tinha um nível mais elevado de BV ligado à superfície, enquanto que as células PNT1A tinha um nível mais elevado de BV no citoplasma (Figura 1C).

Células de Basal (indiferenciado) Fenótipo são transduzidas mais prontamente que luminal (diferenciadas) células na primária da próstata epitelial culturas

a fim de alargar a nossa avaliação da BV em uma situação mais biologicamente relevante, utilizou culturas de células epiteliais primárias paciente derivadas de biópsia da próstata. Uma vez que a maior parte dos tumores da próstata humanos compreende células de origem epitelial, com ambos os indiferenciado (basal) e bem diferenciadas fenótipos (luminal) presente, determinou-se BV foi capaz de se direccionar ambas as populações de células epiteliais em diferentes fases de diferenciação. células epiteliais da próstata primário derivados de três biópsias de tumores de pacientes (escore de Gleason 6, 7 e 8/9) foram cultivadas sob duas condições diferentes: em meio KSFMsup para manter as células em um estado basal, ou em meio DH10 para induzir a diferenciação, com base no trabalho por [37]. Mudanças no estado de diferenciação nestas condições de cultura distintos foram confirmados por análise de imunofluorescência de marcadores de diferenciação clássicos (marcadores basais: citoqueratinas (CK) 1, 5, 10 e 14; marcador luminal: CK18), baseado no trabalho de [38] (Figura Suplementar 1). Numa base por paciente, as células cultivadas em KSFMsup ou DH10 foram incubadas com BV [CMV-EGFPCAT] para aumentar a comprimentos de tempo e analisadas por citometria de fluxo após 48 h. diferenciação epitelial reduzida frequências de transdução total quando as células foram incubadas com o vírus durante menos de 10 h: por exemplo, em células derivadas de um tumor Gleason 6, o nível máximo de infecção alcançado em basal (KSFMsup) células em 4 h (45,33 ± 3,55 %) era consideravelmente mais elevado do que o pico da infecção em luminal (DH10) células (21,69 ± 1,78%) em 8 horas (Figura 2A). Durante longos períodos de BV incubação, a diferença nos níveis de transdução entre KSFMsup- e DH10-cultivadas células tornou-se menos pronunciada, mas permaneceu menor em populações diferenciadas celulares (DH10) (Figura 2A).

(A) Percentagem de células de EGFP-positivos às 48 h pós-transdução com BV [CMV-EGFPCAT] a MOI = 500 para aumentar a comprimentos de tempo em três amostras epiteliais da próstata maligno primário (Gleason 6, 7 ou 8/9), mantidos em um estado basal pela cultura em KSFMsup (▪) ou cultivadas em diferenciar condições em DH10 (▴). As barras de erro representam – /+ um desvio padrão. (B) Localização de BV cápsides em células epiteliais primárias a partir de um tumor Gleason 8/9 crescido numa camada dupla, quer de 1 h ou 16 h após a incubação com BV [CMV-EGFPCAT] a MOI = 250. fluorescência vermelha indica cápsides BV detectada com anti-vp39, coloração DAPI nuclear é mostrado em azul e BV-driven expressão EGFP em verde. imagens confocais de a camada superior de células (luminal semelhante; a um Z-distância média de 14,58? M a partir da posição ventral) e camada inferior (basal semelhante; a um Z-distância média de 6,47 ^ M a partir da posição ventral) sejam mostrando. (C) Frequência (normalizados para zombar = 1%) ou média intensidade de fluorescência das células do estroma primário EGFP positivos derivados de biópsias maligno ou benigno 24 horas após transdução com BV [CMV-EGFPCAT] na MOI = 500.

a fim de investigar mais a rápida transdução de células epiteliais basais com BV, que empregou um

in vitro

modelo de bicamada celular, que imita a estrutura celular da glândula da próstata. A bicamada compreendia uma camada confluente de células epiteliais basais (CK1 /5/10/14 +) coberto com uma camada superior de células imperfeita com um mais diferenciada, fenótipo luminal (CK18 +) [28], [38]. células epiteliais da próstata maligno primário derivadas de um tumor Gleason 7 foram permitidos para formar uma bicamada, em seguida, incubadas com BV [CMV-EGFPCAT] durante 1 h ou 16 horas e visualizada utilizando microscopia confocal. Após incubação com BV durante 1 h, cápsulas virais foram visualizados na camada basal em um padrão de coloração ponteada, mas não foram observadas na camada luminal (Figura 2B). Após um período de incubação (16 horas), cápsulas virais foram detectados em ambas as camadas basais e luminais:. No entanto, as áreas notáveis ​​na camada luminal permaneceu desprovido de cápsides virais (Figura 2B)

BV e podem rapidamente eficientemente células transdução primária próstata estromais

epiteliais e estromais populações representam os dois principais componentes celulares de tumores da próstata. Enquanto as células epiteliais compreendem, tipicamente, a maior parte da população de células malignas, células estromais foram implicados num loop de feedback recíproco que suporta o crescimento e manutenção das células tumorais [39], [40]. Isto sugere que uma terapia do cancro da próstata bem sucedida deve incluir a erradicação do compartimento estromal da malignidade associada-alvo. Por conseguinte, investigada a capacidade de BV para transduzir as células de origem estromal. As células estromais derivadas de biópsias da próstata primário malignas ou não malignas foram incubadas com BV [CMV-EGFPCAT] para 1, 16 ou 24 horas e analisadas por citometria de fluxo. Após 1 h, aproximadamente 30% das células foram transduzidas pelo BV, embora, após 16 h de incubação, todas as células do estroma foi transduzida positivamente pela BV (Figura 2C). Não foi observada diferença na frequência de células estromais positivamente transduzidas com base em malignidade; No entanto, numa base por célula, as células de estroma derivadas de amostras de biópsia da próstata malignas exibiram um maior intensidade de fluorescência média do que aqueles derivados a partir de amostras de biópsias benignas em pontos de tempo iniciais (Figura 2C). As células estromais foram, portanto, altamente susceptíveis à BV transdução.

BV pode transduzir com sucesso 3-D da próstata esferóides e ortotópico xenoenxertos

Tem sido sugerido que um vector de terapia de genes eficaz deve ser capaz de penetrar através várias camadas de células, de modo a alcançar uma resposta clinicamente relevante no tratamento de tumores sólidos. Para caracterizar a capacidade dos BV para migrar através de camadas de células, foram empregados dois

in vitro

e

In vivo

culturas tridimensionais. Para

in vitro

modelagem, esferóides ocos de células PC346C próstata malignas, que compreendia um “shell” de 2-3 camadas de células e espontaneamente separado monocamadas durante a cultura de rotina, foram incubadas com BV [CMV-EGFP] . Às 72 horas pós-incubação, foi observado um padrão altamente eficiente de transdução de células, com a penetração da BV através de todas as camadas de células (Figura 3A).

esferóides PC346C (A) transduzidas com BV [CMV-EGFP] (ou falsamente transduzidas) aos 3 dias pós-infecção. tumores (B) PC346C colhidas a partir de ratinhos xenoenxertados aos 3 dias pós-infecção com BV em 3 × 10

7 (uma imagem representativa mostrada) ou 1 × 10

8 (duas imagens representativas mostradas) pfu por inoculação. fluorescência vermelha mostra núcleos celulares (Hoescht), enquanto que a expressão EGFP BV-driven é mostrado em verde. As setas indicam o local da injecção intratumoral BV.

Para i

n modelagem vivo

, modelos de xenotransplante de cancro da próstata murinos, gerados através de injeção ortotópico da linha celular PC346C na próstata dorsolateral de ratinhos atímicos nus, foram injetados intratumoralmente com BV [CMV-EGFP] em duas concentrações diferentes (3 × 10

7 ou 1 × 10

8 pfu). Às 72 horas, os tumores foram ressecados e analisadas por microscopia de fluorescência. BV foi observada com êxito a penetrar no interior do tumor, e migram para longe do local de injecção inicial. Isto foi particularmente evidente após a administração da dose mais elevada de vírus (Figura 3B). Assim, mesmo em culturas tridimensionais, BV era capaz de alcançar um elevado nível de transdução celular.

células da próstata malignas podem ser eficientemente mortos mediante BV vetores em um GDEPT Abordagem

baseada em nitro-redutase

a fim de testar a capacidade de BV para alcançar um resultado de células-letal, que empregue uma terapia enzimática pro-droga dirigida por genes (GDEPT) abordagem focalizada sobre bacteriana

nitro-redutase (NTR), que converte a pró droga CB 1954 (5- (aziridin-1-il) -2,4-dinitrobenzamida) em um agente de ligação cruzada de ADN potente [41]. Assim, construiu-se uma BV tendo uma cassete de expressão onde o forte promotor de CMV mamífero de expressão manada MNTR-IRES-EGFP (BV [CMV-NTR-EGFP]). Um painel de linhas celulares prostáticas malignas e não-malignas foram transduzidas com BV [CMV-NTR-EGFP], e a viabilidade das células foi avaliada após a administração do pró-fármaco, CB1954. A proporção de células não viáveis, tal como medido pelo ensaio de MTS após 48 h, foi significativamente mais elevada em amostras malignas com elevado potencial metastático (PC346C, PC3 e LNCaP) em comparação com amostras não-malignas (PNT1A e PNT2C2) (p 0,001) (Figura 4A). amostras malignas em início de carreira (P4E6) caiu na faixa intermediária da viabilidade. Além disso, a viabilidade das células após a administração pró-droga estava directamente relacionado com a taxa de transdução BV (Figura 4A). Esta análise foi estendida em culturas de células epiteliais derivadas de pacientes primários. Três amostras malignas e não-malignas dois foram transduzidas com BV [CMV-NTR-EGFP] e tratou-se com CB1954. Em 30 horas após a administração do pró-fármaco, a morte das células nessas culturas variou de 10% a 50%, independentemente do estado da doença (Figura 4B).

(A) Percentagem de células não viáveis ​​às 48 h pós-transdução com BV [CMV-NTR-EGFP] (MOI = 500) e tratamento com CB 1954 num painel de linhas de células da próstata, mostrado em relação à frequência de células transduzidas e ajustados para controlos não tratados. linhagens de células malignas: PC346C (♦), PC3 (▴), LNCaP (▪), P4E6 (×); linhas de células não-malignas PNT1A: (+), PNT2C2 (•). Estatísticas representam t-teste entre PC346C /PC-3 /LNCaP vs. PNT1A /PNT2C2. (B) Percentagem de células não viáveis ​​em 30 h pós-transdução com BV [CMV-NTR-EGFP] e o tratamento com CB1954 nas amostras de células epiteliais da próstata primário individuais (n = 3 maligna e n = 2 não-maligna), ajustados para controlos não tratados.

Discussão

vários modelos de doença demonstraram que baculovírus tem um grande potencial como um vector de novo para a terapia genética. Aqui, temos explorado a sua utilidade para o tratamento de cancro da próstata humano. BV foi capaz de transduzir eficientemente uma variedade de células da próstata derivados de múltiplas fontes, incluindo

in vitro Comprar e

in vivo

modelos. BV demonstrado transdução diferencial de maligna em comparação com as células da próstata não-malignos, uma observação que apareceu independente da taxa de crescimento, uma vez que as linhas de células em questão exibiram capacidades proliferativas semelhantes (tempos de duplicação PNT2C2: (39 h), LNCaP (34 h) PC- 3 (30-34 h) e PNT1a (30 h) [26], [42], [43]). Embora um receptor celular de mamífero primário para BV anexo permanece não identificado, especula-se que a regulação positiva associada à malignidade de proteoglicanos modificada com sulfato de heparano (HSPGs) na superfície da célula tumoral [44], [45], que se sabe estar envolvido na ligação BV [16], [46], desempenha um papel importante neste resultado.