Abstract

Evidências recentes sugerem que alguns tumores sólidos, incluindo o cancro do ovário, contêm populações distintas de células-tronco que são responsáveis ​​pela iniciação do tumor, crescimento, quimio-resistência, e recorrência. A via Hippo tem atraído atenção considerável e alguns investigadores concentraram-se em funções YAP para manter a diferenciação stemness e celular. Neste estudo, foram isoladas com sucesso as células cancerosas do ovário (iniciando OCICs) e demonstrou YAP promovido auto-renovação das células do cancro do ovário iniciado (OCIC) através da sua jusante DAET co-activador. famílias YAP e tead foram necessários para manter a expressão de genes específicos que podem estar envolvidos em stemness e chemoresistance ‘OCICs. Tomados em conjunto, os nossos dados indicam que a primeira YAP /TEAD co-ativador regulada câncer iniciado pluripotência das células de ovário e quimio-resistência. É proposto um novo mecanismo sobre a resistência aos medicamentos em células-tronco do câncer, que via de sinalização Hippo-YAP pode servir como alvos terapêuticos para o tratamento de câncer de ovário em clínica

Citation:. Xia Y, Zhang YL, Yu C, Chang T , Fan HY (2014) YAP /TEAD Co-Activator Regulado pluripotência e chemoresistance em câncer Iniciada células ovarianas. PLoS ONE 9 (11): e109575. doi: 10.1371 /journal.pone.0109575

editor: Hong Wanjin, Instituto de Biologia Molecular e Celular, Biopolis, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de junho de 2014; Aceito: 01 de setembro de 2014; Publicação: 04 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Xia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela National Science Foundation Natural da China (81172473, 31371449), o Programa Nacional de Pesquisa Básica da China (2011CB944504, 2012CB944403 ), e Basic Scientific Research Funding, da Universidade de Zhejiang (2011QN81001). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é o mais letal de doenças malignas ginecológicas, principalmente devido à falta de detecção precoce, o que resulta na maioria dos pacientes sendo diagnosticados em um estágio avançado da doença [1], [2]. Os mecanismos subjacentes câncer de resistência aos medicamentos e recorrência permanecem incertas. Evidências recentes sugerem que alguns tumores sólidos, incluindo o cancro do ovário, contêm populações distintas de células estaminais que são responsáveis ​​pela iniciação do tumor, crescimento, quimio-resistência, e recorrência [3] – [6]. Há alguns pensavam que a resistência quimioterápico por câncer de ovário é principalmente devido à existência de pequenas populações de células-tronco do câncer (CSCs).

Alguns estudos relataram que CSCs organizados, estruturas esféricas autónomas independente de ancoragem [7] . Estruturas similares foram observados no cancro do ovário células ascite de pacientes, que incluíram uma pequena subpopulação de células-propagação de tumores que eram capazes de se organizar em esferóides. Sabe-se que os níveis de marcadores de células estaminais, como OCT-4, SOX-2, Nanog, e Notch-1, elevados de expressão pode ser detectada em CSCs [8]. Alguns marcadores da superfície das células são também altamente expresso por CSCs, incluindo CD44, CD117, CD133 e [9], [10]. É bem aceito que as células cancerosas com alta CD44 e expressão CD117 tornar-se altamente tumorigénico e pode restabelecer a sua hierarquia tumor original [11].

Um pool de células-tronco que inclui células-tronco cancerosas também é fortemente regulada por vias de sinalização de o micro-ambiente do nicho de células-tronco. Entre estes, Hippo via atraiu considerável atenção, e alguns investigadores concentraram-se em funções YAP para manter a diferenciação stemness e celular [12], [13]. expressão YAP ectópica impede a diferenciação de células ES

in vitro

e mantém o fenótipo de células-tronco [14], [15]. No entanto, até à data, os membros da família tead, que são YAP jusante co-activadores, não foram exaustivamente investigados em células-tronco do câncer.

Estudos recentes mostraram que as interações entre diversas vias, incluindo the Hedgehog [16], Wnt [17] – [19], MAPK [20], PI3K [21], e vias Hipopótamo [22] – [24], foram envolvidos em pluripotência de células-tronco e regular carcinogênese. Knockdown dos componentes centrais da via Hipopótamo afetados homeostase do tecido no verme

macrostomum Lignano

e causou a hiper-proliferação de células-tronco [12]. LATS2, uma quinase supressor de tumor da via Hippo, pós-transcricionalmente reprime a reprogramação de células humanas [25]. YAP é funcionalmente importante para os efeitos supressores de tumor em LKB1, um supressor de cancro a montante na via de MAPK [26].

Neste estudo, que as esferas de células estaminais isolados com sucesso a partir de xenoenxertos de tumor de rato que foram derivados a partir de ovário humano células cancerosas. Estas células formadoras de esfera foram altamente tumorigénicas e pode propagar em série com os seus fenótipos tumor original. Com base nesta reforçada, tumorigenicidade reproduzível, nós designado estas células formadoras de esfera células cancerosas iniciar ovarianos (OCICs), de acordo com a terminologia anteriormente aceites. Esta sub-população de células cancerosas, também tinha melhorado stemness e drogas resistência dos OCICs através YAP /TEAD regulação da expressão de genes específicos. Estes resultados suportado observações recentes, incluindo a nossa, que YAP-Teads determinados níveis de malignidade do câncer de ovário e proporcionou uma visão mecanicista adicionais sobre os papéis de YAP e Teads em câncer de ovário.

Materiais e Métodos

cancro do ovário iniciar cela de isolamento (OCIC) e cultura

Para obter células OCICs, que injectados subcutaneamente da linha celular do cancro do ovário A2780 em ratinhos nus (2 × 10

6 células por rato). Depois de um diâmetro do tumor atingiu cerca de 1,5 cm (normalmente em quatro semanas após a injecção), removeu-se a tecido do tumor, cortá-lo em pedaços pequenos, e digerida com colagenase para preparar suspensões de células únicas. Em seguida, as células individuais recolhidos foram cultivadas em livre de soro de DMEM-F12 (Invitrogen) suplementado com 5 ug /ml de insulina (Sigma), 20 ng /ml de factor de crescimento epidérmico humano recombinante (EGF; Invitrogen), 10 ng /mL de factor de crescimento de fibroblasto básico (b-FGF; Invitrogen), e 0,4% de albumina de soro bovino (BSA; Sigma) em placas de fixação Ultra Low (Corning). OCICs e as células de controlo foram todos separados de outras células utilizando centrifugação em gradiente de densidade contínuo. As células de controlo foram também obtidos através da injecção de células A2780 em ratinhos nus e os métodos de separação foram semelhantes aos utilizados para OCICs. Elas foram cultivadas em placas de fixação ultrabaixo (Corning) e o meio foi semelhante com OCICs excepto que o meio de cultura incluídos 10% de soro fetal de bovino (FBS). Todos os meios incluem a penicilina (10 unidades /ml) e estreptomicina (10 ng /ml) e as células foram cultivadas numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO

2. Meio foi trocado a cada 3 dias.

rato Nude modelo de xenotransplante

Os ratos foram tratados de acordo com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Zhejiang. Os ratos foram alojados em uma sala com temperatura controlada com ciclos de escuridão-luz adequados, alimentados com uma dieta regular, e mantidos sob os cuidados da Unidade de Laboratório Animal, Universidade de Zhejiang, na China. Os ratos nus transplantados de células de câncer de ovário foram injetados 2 × 10

6 células e examinados diariamente por cerca de três semanas. Depois de o diâmetro do tumor atingiu 1,5 cm, os murganhos foram sacrificados utilizando CO

2 Método de inalação antes de serem sacrificados. Para avaliar a capacidade tumorigénica OCIC

In vivo

, esferóides foram contadas, ressuspensas em 100 ul de PBS, e em seguida injectado por via subcutânea nos flancos esquerdo de ratinhos nus fêmea de 4 semanas de idade. As concentrações celulares utilizadas variaram de 10

4 a 10

5 em OCIC e grupos de controle e os ratos foram divididos em dois grupos e quatro ratos em cada subgrupo. A partir de uma semana após a injecção, os ratinhos enxertados foram observados diariamente para massas tumorais e volume. Um rato foi humanamente sacrificados quando um diâmetro do tumor atingiu 1,5 cm. tumores de xenoenxertos foram dissecados, fixados em paraformaldeído a 4%, embebidos em parafina, seccionados e com um micrótomo rotativo Leica (5 um de espessura). As secções foram utilizadas para a H . E coloração, imuno-histoquímica, e as avaliações histológicas

Imunofluorescência coloração

OCIC esferóides foram colhidas e colocadas em lâminas de vidro, fixadas em paraformaldeído (4 ° C, 30 min) , permeabilizadas com PBS que continha 0,3% de Triton X-100 (PBST), e incubou-se com tampão de bloqueio (PBST contendo 5% de albumina de soro bovino). Os esferóides foram sequencialmente sondada com os anticorpos primários e Alexa Fluor 594- 488 ou anticorpos secundários conjugados (Molecular Probes). As lâminas foram montadas com Vectashield com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, Vector Laboratories). As imagens digitais foram obtidas utilizando um microscópio de epifluorescência (Nikon Eclipse 80i) com 4-100X objetivos.

Imunohistoquímica

xenotransplantes tumorais foram fixados durante a noite em 10% PBS tamponada paraformaldeído a 4%, e depois incorporado em parafina. As secções foram cortadas com um micrótomo Leica RM2235 a 5 mm de espessura e corados com os anticorpos primários indicados para imuno-histoquímica usando um kit Vector ABC (Vector Laboratories). Resumidamente, os cortes foram desparafinados, re-hidratados, e incubados em 0,3% de H

2O

2. Após recuperação de antigénio usando citrato de sódio 10 mM (pH 6,0), as secções foram incubadas em soro de cabra normal. Estas amostras foram então sondadas com anticorpos primários. Após lavagem com PBS que continha Tween-20 (PBS-T), 0,05%, as amostras foram incubadas com um anticorpo secundário e lava-se novamente com PBS-T antes da incubação com solução ABC. A cor foi desenvolvida com diaminobenzidina (DAB) substrato (Kit DAB Substrato, Vector Laboratories). As secções foram lavadas, contrastadas, desidratados, e montadas com meio de montagem permanente Vectamount (Vector Laboratories). Os cortes foram observados sob uma Nikon Eclipse 80i Microscope (Nikon Corporation). O controlo negativo foi substituído o anticorpo primário, com PBS incubação.

Lentivirus shRNA infecção e formação de clones ensaio

Lentivírus que codificava para

Yap

e

Tead1 /3 /4

RNAs curtos hairpin (shRNA) ou oligonucleotídeos não-alvo como um controle foram de GenePharma (Xangai, China). Curto ARN interferentes para

Yap

e

Tead1 /3/4

seleccionado a partir de diferentes sequências alvo foram inseridos em vectores de /GFP + Puro 3-LV. As células em esferas foram infectadas com o

Yap

e /ou

Tead1 /3/4

shRNA lentivírus para 48 h.

Yap

shRNAs espec�icos foram: 5′-CCCAGTTAAATGTTCACCAAT-3 ‘(shYAP # 1) e 5′-GCCACCAAGCTAGATAAAGAA-3’ (shYAP # 2). Dois shRNAs foram usadas para direcionar

Tead1

,

Tead3

, e

Tead4

juntos: 5′-ATGATCAACTTCATCCACAAG-3 ‘e 5′-GATCAACTTCATCCACAAGCT-3’. eficiência interferência foi verificada por meio de RT-PCR e transferência de Western. Lentivírus OCICs infectadas foram plaqueadas em triplicado em placas de 12 poços (1.000 células /poço) durante 14 dias. O meio foi substituído a cada 48 horas e as colónias visíveis foram contadas por microscopia de luz.

avaliação de diferenciação esferoidal

esferas de células foram cultivadas sob condições padrão de diferenciação (DMEM /F12 suplementado com FBS a 10%) e em placas Ultra Low anexo (Corning). Após 14 dias em cultura, a morfologia das células foi avaliada usando um microscópio invertido Zeiss Axiovert 40 com software axio-Vision. marcadores de superfície celular (CD44 e CD117) foram detectados por imunofluorescência. Um epitélio diferenciação marcador, citoqueratina-7 (CK-7), e cancro do ovário antigénio-125 (CA125) foram usadas para a coloração de imunof luorescência, seguido por incubação com um anti-murganho de cabra marcado com FITC ou anti-IgG de coelho. Os núcleos foram contrastadas com 4, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; Santa Cruz).

quimioterapia ensaios de sensibilidade agente

esferóides de células foram dissociadas e semeadas a 4000 células /poço em placas de 96 bem placa Ultra Low Anexo (Corning) e cultivadas com sem soro DMEM /F12 suplementado com fatores de crescimento. OCICs controlar e células de cancro do ovário foram tratados com cisplatina (20 a 60? M), taxol (2-20 uM), ou bleomicina (20 uM a 100 uM) durante 48 h. Após cultura durante 48 horas, a viabilidade celular foi avaliada utilizando um kit de contagem de células-8 (Dojndo, Japão), de acordo com as instruções do fabricante. as taxas de sobrevivência celular foram definidos como a percentagem de células sobreviventes tratados com droga dividido por células de controlo não tratadas. Todos os experimentos foram realizados em triplicado.

microarrays análise quantitativa PCR e em tempo real RT-PCR

Human Drug Resistance Cancer RT

2 Profiler matriz PCR (QIAGEN # 330231) foi usado para determinar os perfis de 84 genes envolvidos na regulação de expressão de quimioterapia. Primers para 84 genes de teste e 5 genes housekeeping (

B2M

,

Hprt1

,

Rpl13a

,

GAPDH

, e

ACTB

) foram incluídos em cada placa de 96 poços. Um kit First Strand (QIAGEN # 330401) e SYBR Green qPCR Mastermix (QIAGEN # 330500) eram de SABiosciences. qPCR foi realizado de acordo com as instruções do fabricante (SABiosciences RT

2 Disposição do Sistema de PCR) usando um dispositivo Bio-Rad CFX96TM PCR em Tempo Real. A análise dos dados foi realizada por meio da análise on-line de dados de matriz SABiosciences PCR, conforme descrito no protocolo do fabricante.

células Spheroid, células diferenciadas esferóides, ou células tumorais primárias foram colocadas em microtubos RNAase-livres. extracção total de ARN e a transcrição reversa foram realizadas com RNAiso Plus e um kit de transcrição reversa Mistura (Takala), de acordo com as instruções do fabricante. O ARN total (0,5 mg) foi revertida transcrita utilizando um kit de síntese de ADNc (Bio-Rad). As reacções de PCR em tempo real foram realizadas usando um sistema de detecção por PCR em Tempo Real CFX96 (Bio-Rad). Cada uma das amostras de cDNA foi testado em triplicado. Para quantificar as mudanças de expressão gênica, o método △△ Ct foi utilizado para calcular dobrável mudanças relativas após a normalização para

ACTB

(β-actina) níveis de mRNA. As sequências dos iniciadores de RT-PCR específicos do gene são mostrados na Tabela S1. As células

Proteína de extracção e análise de transferência de Western

foram lisadas com tampão de lise celular (Beyotime) que incluía um volume apropriado de um cocktail inibidor de protease (Roche). As proteínas totais foram separadas por SDS-PAGE e depois transferidos para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (Millipore, EUA). Os locais de ligação não específicos foram bloqueados com 5% de leite desnatado em TBST à temperatura ambiente durante 1 h. Após a sondagem com anticorpos primários, as membranas foram incubadas com anticorpos anti-coelho ligados a peroxidase de rábano (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) e depois lavadas. Os anticorpos ligados foram visualizados utilizando um kit de detecção de quimioluminescência aumentada (Amersham). Os anticorpos primários foram: anti-YAP, anti-Oct-4, anti-Notch-1, anti-actina, os quais foram de Cell Signaling Technology. Um anti-TEAD1 (1:1000; 5178-1) anticorpo foi de Epitomics. Anti-TEAD2 (1:1000; LS-C119063) e anti-TEAD3 (1:1000; LS-C30406) anticorpos eram da Longevidade Biosciences. Anti-TEAD4 (1:1000; ab97460) anticorpo foi de Abcam. As proteínas foram visualizadas utilizando um substrato Dura Super Signal (Millipore, EUA).

A análise estatística

Todos os ensaios foram feitos em triplicado. software GraphPad Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA) foi utilizado para comparar os resultados do grupo de testes de qui-quadrado ou ANOVA, conforme o caso. As diferenças foram consideradas significativas para p . 0,05

Resultados

câncer iniciado esferas ovarianos têm propriedades de células-tronco do câncer

células de cancro do ovário primárias foram dissociadas e colocados em frascos de cultura de não-revestidos meio isento de soro suplementado com EGF, b-FGF, a insulina, e BSA. Após uma semana de cultura, aglomerados esféricas não aderentes de células foram observadas na parte inferior destes frascos. Em um mês depois, esferas com maiores tamanhos foram claramente observado (Fig. 1A). Normalmente 5 × 10

6~1 × 10

7 digerido células xenoenxerto foram colocados em cultura, e cerca de 2-4% deles foram convertidos para OCICs nas condições privadas de soro. Em tempo real de RT-PCR e resultados de transferência de Western mostrou que os marcadores de células estaminais oct-4, SOX-2, nestina, Notch-1, e Nanog foram todos altamente expressos por estas células em esferas (Fig. 1B).

A: Imagens de grupos de células esféricas não aderentes derivadas de células de cancro do ovário primárias cultivadas. Barras de escala = 100 pm. B: transferência Western e em tempo real de RT-PCR resultados mostrando a expressão aumentada dos genes indicados em OCICs. Os níveis de ARNm relativos foram determinados por normalização de níveis endógenos de ARNm de p-actina (utilizado como um controlo interno) usando o Microsoft Excel. Para cada gene indicado, o nível de transcrição relativa do (barra do lado esquerdo de cada gráfico) amostra de controlo foi fixado em 1. Os níveis de transcrição relativos de outras amostras foram comparados com o controlo, e dobra-alterações são mostrados no gráfico. C-D: Representante resultados de coloração de imunofluorescência para a expressão CA125, CK7, CD44, e CD117 em OCICs diferenciadas e indiferenciadas. Os núcleos foram corados com DAPI. Barra de escala = 100 M para todos os painéis.

Em seguida, investigou-se estas células esfera tinha independente de ancoragem de auto-renovação. Nós cultivadas esferóides por 14 dias sob condições de diferenciação (fatores de crescimento retirados e médias que continham 10% FBS). As células esferóides alterados a partir de células flutuante para aderente células, adquiriu uma morfologia epitelial, e formou CA125 e CK-7-positivo colônias simétricas (Fig. 1C). (CA125 e CK-7 estão bem estabelecidos marcadores de superfície celular de células de cancro do ovário epiteliais diferenciadas.) Além disso, os marcadores de superfície celular previamente relatados de células estaminais epiteliais do ovário, CD44 e CD117, foram expressas em níveis muito elevados em células esfera do que na células planas diferenciadas (Fig.1d).

células Sphere-formação são fortemente tumorigênico

foi examinado se essas células formadoras de esfera identificados foram tão fortemente tumorigênico como outras células que iniciam com câncer epitelial relatados. um número comparável de células de esfera e as células de controlo foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos nus. Às duas semanas mais tarde, os tumores foram encontrados em três de quatro ratinhos nus atímicos, que tinham sido injectados com 10

4 células esfera. No entanto, os tumores não foram encontrados em ratinhos que tinham sido injectados com células de tumor dos ovários diferenciadas, mesmo a 10

5 células por enxerto (Fig. 2A). A concentração celular mostrado na Fig. 2A é 10

4 por ratos e outros resultados concentrações não foram mostrados

A:. Imagens de ratos pelados mostrando a formação do tumor de ovário xenotransplante depois de injetar esferas OCIC. concentrações de células usado 10

4 em cada grupo. B: H E os resultados da coloração mostram a histologia de tumores derivados de transplantadas subcutaneamente esferóides OCIC. C: resultados Representante IHC para CA125 e expressão YAP em tumores de xenoenxertos humanos derivados de OCICs. a expressão da proteína específica é indicado pela cor marrom e núcleos (azul) foram contrastadas com DAPI. D: Os resultados representativos de IHC para a expressão dos marcadores de pluripotência OCT4, SOX2 e NANOG em tumores de ovário xenoenxerto derivados de esferóides OCIC. E: Os resultados representativos de IHC para AKT fosforilada e pMAPK (/2 ERK1) expressão nos tumores de xenoenxerto derivados de OCICs. Barra de escala = 200 uM para os painéis BE

H .. E os resultados da coloração revelou que os tumores derivados das células formadoras de esfera injectado um histológica semelhante à de células de tumores injectadas A2780 (Fig 2B ). Estes tecidos de tumor expressa níveis elevados do Yap e foram positivas para o CA-125, um marcador de adenocarcinoma de ovário (Fig. 2C). Estes resultados mostraram que as células formadoras de esfera tínhamos identificados foram altamente tumorigénico e pode se propagar em série para seu fenótipo tumor original. Com base nesta reforçada, tumorigenicidade reproduzível, nós designado estas células formadoras de esfera células cancerosas iniciar ovarianos (OCICs), de acordo com a terminologia anteriormente aceites. Além disso, também detectados os marcadores de células estaminais (OCT4, SOX2, e Nanog) Expressão e níveis de fosforilação de AKT /MAPK nestes tecidos tumorais, com origem diferente de células (Fig. 2D-E). Os resultados também mostraram que esses genes têm níveis de expressão mais elevados do que nos controles.

São obrigados

YAP e TEAD para manter OCIC pluripotência

Um relatório anterior mostrou que YAP estava envolvido em células iPS manutenção em condições indiferenciadas [14]. Assim, postulou que YAP também poderia manter a pluripotência de células-tronco do câncer de ovário. membros da família YAP e DAET, excepto para TEAD2, foram todos expressos em níveis significativamente mais elevados do que por OCICs por células de cancro do ovário diferenciados (Fig. 3A-C). Além disso, os níveis de mRNA de genes conhecidos alvo YAP /DAET, incluindo

Runx2,

Itgb2

, e

ErbB4

, foram todos significativamente aumentados em células OCIC, sugerindo que YAP /DAET actividade era alta em destas células (Fig. 3D). Estes resultados foram consistentes com aqueles em um relatório anterior [27]

AC:. Em tempo real RT-PCR (A), imunofluorescência (B), e Western blot (C) resultados para YAP e TEAD1- 4 níveis de expressão em células primárias do cancro do ovário (controle) e OCICs. Os núcleos foram corados com DAPI. D: em tempo real os resultados de RT-PCR para níveis de mRNA de genes conhecidos alvo YAP /TEAD, incluindo

Runx2,

Itgb2

, e

ErbB4

, no cancro do ovário primário células (controle) e células OCIC. EF:. Resultados em tempo real RT-PCR para as eficiências de depleção de RNAi de YAP, TEAD1, TEAD3 e TEAD4, depois de usar dois shRNAs diferentes para cada gene

Para investigar se YAP e tead membros da família estavam envolvidos na manutenção da pluripotência OCIC, nós knocked-down

Yap

e

Tead1 /3/4

expressão em OCICs usando shRNAs. Os resultados de RT-PCR confirmou que as eficiências de knock-down do shRNAs indicado (Fig. 3E-F). Os resultados da coloração de imunofluorescência mostrou que Oct-4 expressão era mais fraca na shYAP e shTEAD OCICs tratadas que em células de controlo (Fig. 4A). Além Oct-4, a expressão de outros marcadores de células estaminais ‘também foi diminuída, tal como determinado por RT-PCR e transferência de Western (Fig. 4B-C). Em um ensaio de formação de Clony, quando as células formadoras de esfera foram tratados com

Yap

shRNA, os esferóides foram menores (Fig. 4D). alterações morfológicas semelhantes foram também observados para SH

Tead1 /3/4

OCICs tenha sido tratada com (dados não mostrados). Estes resultados mostraram que a /TEAD co-ativador YAP foi necessário para manter pluripotência OCIC

A:. Representativos resultados de coloração de imunofluorescência para OCT-4 expressão em

Yap viajantes – e

Tead1 /3/4

-silenced OCICs. BC: Real-time RT-PCR (B) e borrar resultados ocidentais (C) mostrando que os genes indicados foram regulados negativamente em OCICs após a depleção RNAi de

Yap

e

Tead1 /3/4

. D: Imagens de aglomerados esféricos OCIC sem (painéis superiores) e com (painéis inferiores) sh

Yap

-tratamento por 200 vezes de ampliação

YAP-TEAD confere resistência aos medicamentos quimioterápicos para. OCICs

Uma propriedade de células-tronco do câncer é a sua resistência a agentes de quimioterapia convencionais. Assim, determinou-se a sensibilidade dos OCICs a cisplatina, taxol, e tratamentos bleomicina. células tumorais primárias exibiram sensibilidade a esses fármacos quimioterapêuticos de um modo dependente da dose (Fig. 5A). Em comparação com as células de tumor primárias, OCICs exibiram resistência à cisplatina, taxol, e bleomicina (Fig. 5A) reforçada. No entanto, OCICs com

Yap Comprar e

Tead1 /3/4

knockdown tinha diminuído as taxas de sobrevivência (Fig. 5B). Estes resultados suportam a hipótese de que YAP-DAET melhorada a resistência a drogas de células-tronco como no cancro do ovário.

. As taxas de sobrevivência de células primárias do cancro do ovário (controlo) e OCICs após o tratamento com cisplatina (CDDP), taxol, ou bleomicina nas concentrações indicadas. OCICs e as células de controlo foram tratadas com fármacos durante 48 h. *, P 0,01, comparado com o grupo de controlo correspondente. **, P 0,001, comparado com o grupo de controlo correspondente. B. taxas de sobrevivência de OCICs com ou sem

Yap

e

Tead1 /3/4

knockdown após o tratamento com CDDP, o taxol, ou bleomicina nas concentrações indicadas, durante 48 h. ns, não significativo; *, P 0,01; **, P 0,001. C-D: resultados em tempo real de RT-PCR que mostram que os genes indicados foram expressos em OCICs em níveis mais elevados do que em células de cancro do ovário primários (C). Os níveis de expressão ‘genes indicados em OCICs foram significativamente regulada com

Yap

e

Tead1 /3/4

RNAi (D). *, P 0,01; **, P 0,001. E. transferência de Western resultados para os níveis de AKT e PAKT em OCICs com ou sem

Yap /Tead1 /3/4

shRNA tratamento.

YAP up-regula GSK3A e expressão ABCB1 para melhorar a resistência dos OCICs droga

para determinar os genes resistentes aos medicamentos envolvidos na regulação OCICs foi utilizado a análise microarray gene resistente aos medicamentos para OCICs e múltiplos genes relacionados com chemoresistance putativos identificados que foram altamente expressos em OCICs. Uma sinopse tabular de seus resultados de microarray com as respectivas alterações de dobra foi fornecido na Tabela S1. A genes ABCB1 relacionada com a droga-resistência, ABCC1 GSK3A, tinham níveis de expressão significativamente mais elevados em OCICs do que em células de cancro do ovário primárias (Fig. 5C). Nós investigado se esses genes foram regulados pelo au-Teads em OCICs. Entre estes genes, ABCB1 e GSK3A foram significativamente regulada em

Yap /Tead

-depleted OCICs, enquanto a expressão ABCC1 não foi significativamente afetada (Fig. 5D).

Além disso,

Gsk3a

,

GSK3B,

e

expressão da p53

gene também foi detectado em OCICs (Fig. 5C). Entre estes,

Gsk3a

e

p53

foram extremamente regulada para baixo em

Yap /Tead

-depleted OCICs e

GSK3B

mudou pouco (Fig. 5D ). Estes resultados sugeriram que YAP e Teads maior resistência à droga ‘OCICs por

A via de sinalização de PI3K é conhecida a cooperar com a via Hipopótamo para regular célula para cima e para baixo-regula os genes envolvidos no metabolismo de drogas e a sobrevivência das células. crescimento e proliferação [28]. níveis AKT fosforilada foram elevados em OCICs e diminuiu com a

Yap Comprar e ou

Tead1 /3/4

esgotamento /. Interessantemente, os níveis totais de AKT, também foram regulados negativamente em

Yap Tead1 //3/4

OCICs co-empobrecido. Estes resultados também demonstraram que YAP /Teads foram necessários para manter a actividade via PI3K /AKT em OCICs (Fig. 5E).

genes da via de MAPK estão envolvidos na YAP mantida OCIC pluripotência

Os resultados qPCR análise de microarray (Tabela S2) mostrou que vários genes envolvidos em vias de MAPK, incluindo

c-Fos

,

Egfr

, e

IGF2R

, tinham maiores níveis de expressão em OCICs do que em células primárias do cancro do ovário (Fig. 6A). Sua expressão foi regulada para baixo depois de

Yap

e

Tead1 /3/4

shRNA tratamento (Fig. 6B). Porque C-JUN e FOS C-formar o complexo e função de AP-1 em conjunto, examinámos

c-Jun

a expressão do gene em amostras e estas encontraram resultados semelhantes (Fig. 6A-B). O

Egfr

e

IGF2R

genes codificam para o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) eo receptor do factor de crescimento tipo insulina 2 (IGF2R), respectivamente. Estes são receptores de membrana celular importantes que transmitem sinais extracelulares chave para o núcleo, activando cascatas de MAP quinase. MAP-cinases fosforiladas e activadas translocar desde o citoplasma para o núcleo para mediar C-fos e a activação de transcrição C-junho Alguns estudos mostraram que os genes regulados YAP DAET para regular o

Areg

gene, que interage com o receptor /TGF-alfa de EGF para promover o crescimento de células epiteliais normais [29], [30]. Assim, nossos resultados sugerem que estes genes em vias de MAPK podem estar envolvidos na YAP mantida pluripotência OCIC.

A. resultados em tempo real de RT-PCR que mostram que os genes indicados foram expressos em OCICs em níveis mais elevados do que em células de cancro do ovário primárias (controlo). B. em tempo real os resultados de RT-PCR mostrando que os níveis de expressão dos genes indicados foram significativamente regulada em OCICs com

Yap

/

Tead1 /3/4

RNAi.

Discussão

ocorrência e progressão tumoral estão intimamente relacionados com o desenvolvimento de células somáticas anormal e diferenciação. Há um pequeno número de células específicas ou os chamados células-tronco no nosso organismo incluído tecido do ovário que são capazes de auto-renovação e diferenciação direccional [31] – [33]. Como parte dessas células, as células-tronco cancerosas têm atraído atenção recentemente. Um estudo anterior mostrou que uma população de células-tronco cancerosas muito menores, de fato existia em alguns tecidos de câncer, que iniciou o desenvolvimento de células cancerosas e foi relacionado para conter a manutenção das células propriedade, tumorigênese, metástase maligna, e recorrência [34]. células-tronco cancerosas têm várias características importantes, incluída a capacidade de clone formação, a expressão de marcadores de células-tronco e marcadores da superfície celular específicos, diferenciação celular e identificação morfológica e forte capacidade tumorigénica.

Neste estudo, foram isoladas com sucesso ovário cancerosas células estaminais do tipo de ratinhos portadores de tumor e demonstrou que estas células tinham as características de células estaminais cancro descrito acima. Após cerca de um mês em cultura, OCICs formados grupos que continham numerosas células e tinham diâmetros de até 500 mm. OCICs não só tinha marcadores de células-tronco do câncer forte capacidade clonogênica mas também expresso em níveis elevados. resultados de diferenciação celular mostrou que os esferóides nós isolados na verdade tinha as características de câncer epitelial de ovário. As taxas tumorigénicas destes OCICs foram significativamente mais elevados do que aqueles das células de cancro do ovário primários e estes dados não foi mostrado na Figura 2.

Muitas vias de sinalização, tais como o Wnt, PI3K, vias de sinalização MAPK, tenham sido relatado para ser intimamente associada com células-tronco e da via Hippo [18], [19]. A via Hippo também tem recebido atenção considerável no que diz respeito a conter mecanismos de regulação celular e tumorigênese [23], [35], [36]. Alguns estudos mostram que o gene regulado YAP reparação epitelial de células estaminais e células estaminais intestinal e função das células-tronco hematopoiéticas [37] – [40]. células e atividade de propagação de tumores contribuiu para a progressão do tumor de pulmão e metástase em dependentes CD24 e Yap /caminhos Taz-dependentes [41]. YAP foi inibida por catenina durante a proliferação de células estaminais epidérmicas e desenvolvimento do cancro da pele através da via de sinal de Wnt [42]. Em contraste, YAP restrito sinais de Wnt durante a regeneração do intestino. No nosso estudo, AKT e MAPK níveis de fosforilação foram dramaticamente maior expressão não apenas em tecidos tumorais, mas também em OCIC OCICs.

a expressão transgénica de YAP reduzida expressão do gene alvo Wnt e resultou na rápida perda de criptas intestinais. Além disso, uma perda de YAP resultou em hiperplasia e a expansão de células estaminais intestinais (ISC) e células de nicho [38].