Abstract
Os receptores citotóxicas naturais (NCRs) são um conjunto único de proteínas de activação expressa principalmente na superfície das células natural killer ( NK). Os NCRs, que incluem três membros; NKp46, NKp44 e NKp30, são criticamente envolvida na citotoxicidade NK contra alvos diferentes, incluindo uma ampla variedade de células tumorais derivadas de várias origens. Embora os ligandos de tumor dos NCRs ainda não tenham sido identificados, o modo selectivo pelo qual estes receptores alvo células tumorais pode proporcionar uma excelente base para o desenvolvimento de terapias anti-tumorais novos. Para testar a potencial utilização das NCRs como agentes anti-tumorais, foram geradas proteínas de fusão de Ig solúveis NCR em que a região constante da IgG1 humana foi fundido com a porção extracelular do receptor. Nós demonstramos, usando duas linhas de células diferentes humanos cancro da próstata, que o tratamento com NKp30-Ig, inibe drasticamente o crescimento do tumor
in vivo
. macrófagos ativados foram mostrados para mediar uma resposta ADCC contra as linhas de células de próstata revestido NKp30-Ig. Finalmente, as proteínas de fusão de Ig também foram demonstradas para discriminar entre a hiperplasia benigna da próstata e cancro da próstata. Isto pode fornecer uma modalidade de diagnóstico romance na difícil tarefa de diferenciar entre essas condições patológicas altamente comuns
Citation:. Arnon TI, Markel G, Bar-Ilan A, Hanna J, Fima E, Benchetrit F, et al . (2008) Aproveitamento Solúvel NK Cell do assassino receptores para a Geração de Terapia Imune Cancer Novel. PLoS ONE 3 (5): e2150. doi: 10.1371 /journal.pone.0002150
editor: Fu-Sheng Wang, Beijing Institute of Infectious Diseases, China
Recebido: 12 de fevereiro de 2008; Aceito: 01 de abril de 2008; Publicado em: 14 de maio de 2008 |
Direitos de autor: © 2008 Arnon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
mecanismos imunológicos estão pensado para proporcionar proteção essencial do. desenvolvimento de doenças cancerosas. Estudos de doentes humanos e modelos de ratos têm demonstrado que as deficiências de componentes imunológicos importantes levar ao aumento da susceptibilidade ao desenvolvimento de cancro [1] – [3]. As células NK (natural killer) são uma importante subconjunto de linfócitos citotóxicos que pertencem à resposta imune inata e são melhor caracterizadas pela sua capacidade para matar células infectadas com vírus espontaneamente e tumorais [4]. A eficiência através da qual as células NK destruir uma grande variedade de linhas de células sugere um papel importante na vigilância imunológica. Na verdade, acumulando dados clínicos e experimentais demonstram a importância da atividade NK na eliminação do câncer
in vivo
; em ratinhos, a depleção das células NK resulta em um aumento significativo da susceptibilidade para o cancro induzido quimicamente [1], enquanto que em pacientes de leucemia NK reduzida citotoxicidade foi mostrado para correlacionar rigorosamente aumentada progressão da doença [5].
A a activação de células NK é regulada por um conjunto de receptores de superfície que, ou induzem ou inibem a resposta citotóxica [4], [6]. O principal mecanismo que controla a inibição de NK baseia-se no reconhecimento de moléculas MHC classe I por receptores inibitórios NK, tais como os receptores killer-Ig-like (KIR) e o complexo /NKG2A CD94. Este mecanismo assegura que as células NK são continuamente inibida de matar as células saudáveis que expressam níveis normais de MHC de classe I proteínas [7]. No entanto, enquanto a expressão de MHC de classe I é essencial, a fim de inibir a citotoxicidade de NK, sub-regulação não é suficiente para induzir uma resposta, como também são necessários sinais de activação específicas. Estes sinais são fornecidos por um conjunto de receptores que reconhecem MHC de lise não-ligantes classe I, expressas em células-alvo [8]. Assim, as células NK são não só capazes de sentir a ausência de MHC classe I proteínas, mas também são equipados com receptores de superfície que permitem a detecção específica de seus alvos.
O principal NK ativação de receptores envolvidos no reconhecimento e morte de tumores incluem o homodímero NKG2D e os três receptores citotóxicos naturais (NCRs) NKp46, NKp44 e NKp30 [8]. A contribuição relativa de cada um destes receptores a NK citotoxicidade contra tumores difere, indicando a existência de vários ligandos de lise específica [9]. De facto, várias proteínas de stress celulares indutíveis foram identificados como ligandos para o receptor NKG2D:. O MHC de classe I cadeia antigénios relacionados (MICA e MICB) e as proteínas de ligação a UL16 (ULBP1-4) [10]
contrastar para o NKG2D, os ligandos celulares das NCRs são actualmente desconhecidos e os únicos ligandos NCRs identificados até agora são proteínas viralmente derivado [11] – [14]. No entanto, a evidência substancial indica que não existem ligandos celulares para os NCRs e que a sua expressão é crítico para a capacidade das células NK para destruir tumores [9], [15] – [17]. Estas conclusões são apoiadas por estudos clínicos que mostram por vários casos de AML uma correlação entre baixos níveis de ligantes NCRs em pacientes com LMA e um mau prognóstico da doença [18]. Além disso, mostrámos recentemente que a deleção de um único gene NCR, o homólogo de rato NKp46 (NCR1), reduz significativamente a capacidade das células NK para limpar as células tumorais in
in vivo
[19].
na última década, a imunoterapia do cancro estudos têm focado extensivamente na tentativa de explorar a natureza altamente específica da resposta imune adaptativa para o desenvolvimento de novos tratamentos. Esta abordagem conduziu à geração de vários anticorpos humanizados dirigidos contra antigénios específicos de tumores. O sucesso clínico impressionante da terapia baseada em anticorpos abriu o portão para uma intensa busca por marcadores tumorais altamente específicas adicionais e desde 1995 vários anticorpos foram aprovados para uso clínico enquanto mais actualmente estão a ser avaliados em ensaios de oncologia [20], [21] .
para expandir este método, diversas ferramentas foram aplicadas numa tentativa de identificar novos antigénios tumorais que seriam adequados para uma ampla gama de cancros e ainda reter o reconhecimento selectivo. Os NCRs representam um exemplo único de proteínas que tenham adquirido uma especificidade tão ampla e são altamente adaptados para reconhecer as células cancerosas. Para traduzir este potencial para um instrumento terapêutico, que são geradas proteínas de fusão de imunoglobulina (Ig) que contêm a porção extracelular do receptor fundido com a região constante de IgG1 humana. Assim, semelhante à abordagem de terapia de tumor à base de anticorpo, temos a hipótese de as proteínas de fusão de Ig-NCR podem ser usados como «mísseis orientados»; a porção extracelular fornece especificidade do tumor, enquanto a região constante da IgG1 humana (Fc) permite o recrutamento de componentes imunológicos, que aumentam a eliminação específica do tumor. Aqui nós mostramos o potencial uso de tal terapia utilizando modelos de cancros da próstata humanos.
Materiais e Métodos
Células
Nós usamos a linha de células de câncer de próstata humana DU145 e próstata humana cancro da linha celular PC3 /
Luc
, o qual foi preparado tal como descrito antes [14]. Resumidamente, PC3.38, um clone da linha de células de adenocarcinoma da próstata humana, derivada de PC3 (ATCC, CRL-1435), foi infectada com recombinantes rLNC /
Luc
retrovírus (expressando o gene da luciferase a jusante de promotor de CMV) e selecionados por G418 (400 ug /ml) gerando /
Luc
clone PC3. expressão estável de luciferase em cultura de células foi rotineiramente confirmados usando a câmera CCCD.
As proteínas de fusão e citometria de fluxo análise
A produção de NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, NKp46D1-Ig e CD99- Ig foi descrito anteriormente [13]. Controlar proteína IgG1 humana (hIgG1 kappa, PHP010) foi comprado de Serotec (Oxford, Reino Unido).
Imunohistoquímica
tecidos prostáticos, tanto hiperplásicas e malignos, foram fixados em formalina tamponada. O aquecimento por microondas, das secções de tecido embebidas em parafina fixadas com formalina em tampão de citrato foi realizada para recuperar antigénios. As secções foram então coradas pela diferente NCR-Ig ou controlo-Ig (8 ug /ml, concentração final) seguido de-cabra biotinilado anti-humano-Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Para a detecção, o método do complexo avidina-biotina peroxidase foi utilizado com o kit Vectastain (Vector Laboratories, Burlingame, CA). A coloração foi classificada como a percentagem de células positivas prostáticas malignas ou hiperplásicas () a partir de um total de 100 células. Também foi avaliada a intensidade da coloração como 0 = não, 1 = fraco 2 = moderado e 3 = forte. secções coradas foram analisadas por dois patologistas. imunofenotipagem foram considerados positivos sempre que a percentagem de células prostáticas coradas positivamente ultrapassou 50% e a intensidade foi maior que 1.
implantação do tumor e tratamento
Para o modelo DU145 que s.c. injetaram em ratos nu masculina com a linha de tumor da próstata humana DU145 (4 × 10
6). Duas semanas após a injecção, quando os tumores se tornaram visíveis, os ratinhos foram tratados com Ig-NKp30, NKp46D2-Ig, controlar IgG1 humano ou PBS. Os tratamentos foram administrados 5 vezes (dias 2, 7, 15, 25 e 34) e incluiu uma dose maior inicial das proteínas (20 mg /kg), seguido por doses mais baixas (10 mg /kg). a progressão do tumor foi avaliada a cada três dias, medindo o diâmetro dos tumores.
Para o PC3 /
Luc
modelo, ratinhos nus macho (4-8 semanas de idade) foram injectados com 15 × 10
6 PC3 /
Luc
células na sc espaço do flanco esquerdo de cada rato. Três semanas após a implantação do tumor, os ratinhos foram injectados i.p. com 4 ug /kg de NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, controlar IgG1 humano ou PBS a cada dois dias durante um período de 3-4 semanas.
geração de imagens de PC3 tumor /
Luc
xenotransplantes
Todos os ratinhos foram monitorizados quanto a expressão do tumor antes e no final dos procedimentos de tratamento. Apenas os ratos que no prazo de 21 dias a partir da injecção expressos um tamanho detectável de tumor, conforme avaliado pela câmara CCCD, foram escolhidos para mais manipulações. Antes de imagiologia, os ratinhos foram anestesiados com hidrato de cloral a 4% (Fluka-Sigma, Israel). Cinco minutos antes da imagiologia, os ratinhos foram injectados i.p. com 126 mg /kg de peso corporal de uma solução aquosa de besouro lucifering (Promega Corp., Madison, WI). Os ratinhos foram então colocados numa câmara à prova de luz de um sistema de câmara CCCD (Roper Scientific, Princeton Instrumento, Trenton NJ) e fotografada em primeiro lugar com uma luz controlada suplementado de modo a ter um corpo imagem de referência na escala de cinzentos. Os fotões emitidos a partir do ratinho foram então detectados na escuridão total, recolhido e integrada durante um período de 2 min. Uma imagem da cor pseudo representa a intensidade da luz (azul como o menos intenso e vermelho como o mais intenso). As medições são uma integração de a soma total dos sinais detectados, subtraído pelo fundo integrada luz emitida por uma área igual no mesmo mouse.
A análise farmacocinética
in vivo
CB17.SCID ratos fêmeas foram injectados IP com uma dose única (5 mg /kg de peso corporal) de NKp46D2-Ig ou NKp30-Ig. Os níveis de proteínas de fusão no soro foram determinados em diferentes pontos de tempo, incluindo 0 (pré-dose), 0,25, 0,5, 1, 2, 6, 24, 48, 96, 168, 216, 264 e 336 horas após a dose-administração. Em cada ponto de tempo, os ratinhos foram sacrificados 3 amostras de sangue foram colhidas em tubos de separação, que foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos antes da centrifugação (para permitir a coagulação). Após 30 minutos, os tubos foram imediatamente centrifugadas (10 minutos a 10.000 rpm, à temperatura ambiente) e o soro foi recolhido. Os níveis de proteínas de fusão NKp30-Ig ou NKp46D2-Ig no soro foram analisadas utilizando um ensaio ELISA padrão.
A apoptose ensaio
PC3 /
Luc
ou DU145 células (50.000 /ml) foram incubadas com 5, 10 ou 50 ug /ml de NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, NKp46D1-Ig ou PBS durante 2 horas em gelo. anticorpo -linking Cruz (contra a IgG1 humana) foi então adicionado em concentrações finais que igual a 1/10 da quantidade de proteína de fusão adicionado anteriormente (0,5, 1 ou 5 ug /ml). As células foram então incubadas a 37 ° C durante 48 horas e a percentagem de células apoptóticas foi determinada usando uma análise padrão anexina V /PI.
ensaios de morte mediada por macrófagos
como células efectoras foram utilizados macrófagos peritoneais derivadas de ratinhos nus CD1 5 dias após a injecção de tioglicolato. macrófagos foram recuperados do que activado durante 2 h com LPS (1 mg /ml). Rotulado radioactivo PC3 /
Luc
ou DU145 células (1 * 10
4 /poço em placas de 96 poços plana) foram incubadas com os macrófagos activados com LPS nas proporções indicadas E:T. lise específica foi determinada após 48 horas.
Resultados
Reconhecimento de câncer de próstata humano maligno primário por NKp30 e NKp46
NKp46 e NKp30 são constrictively expressa na superfície de descansar como bem como as células NK activadas e são predominantemente envolvidos na morte de várias linhas celulares de tumores
in vitro
. No entanto, uma vez que os ligantes celulares desses receptores são ainda desconhecidos, pouco se sabe sobre o seu padrão de expressão e distribuição em diferentes configurações patológicas.
O câncer de próstata é o tumor sólido mais frequentemente diagnosticado entre os homens nos Estados Unidos ea segunda principal causa de mortes por câncer nos países ocidentais [22]. Infelizmente, não há terapias eficazes actualmente disponíveis para a fase fatal refractário a hormonas da doença. Para testar se os tumores da próstata humanos são reconhecidas pelo NCRs que o coradas PC3 /
Luc
e linhas celulares DU145 com proteínas NKp30 e NKp46 fundido com IgG1 humana. Foi anteriormente mostrado que o local de ligação de NKp46 de vários tumores situa-se no domínio proximal da membrana e da região do vapor do receptor (D2) e que a expressão de D2 fundido com IgG humana (NKp46D2-Ig) permite um melhor reconhecimento do alvo células [13]. Tal como mostrado na figura 1a e b, dois PC3 /
Luc células
e DU145 foram corados especificamente pela NKp30-Ig e NKp46D2-Ig, mas não pelas controlo CD99-Ig (histogramas a cinzento), indicando, assim, a expressão de ligandos para estes dois receptores de activação NK em linhas de células de tumor da próstata.
(a, b) NKp30-Ig e NKp46D2-Ig se ligarem especificamente a linhas celulares da próstata humana. PC3 /
Luc
(a) e DU145 (b) linhas de células foram coradas com Ig-NKp30, NKp46D2-Ig ou controlar a CD99-Ig, seguidas por um anticorpo IgG1 anti-humano de ratinho conjugado com PE. histogramas cinzentas representam a coloração de fundo pela proteína de fusão CD99-Ig de controlo e os histogramas vazios pretas representam a coloração por qualquer NKp30-Ig ou NKp46D2-Ig, tal como indicado no topo de cada histograma. Este valor representa um experimento em cada três executada. (C) A coloração por imuno-histoquímica de adenocarcinoma da próstata humano primário e hiperplasia benigna da próstata (HBP) por NKp30-Ig e Ig-NKp46D2. Cortes de fixado em formol e adenocarcinoma da próstata humana parafinado (painel superior) e BPH (painel inferior) foram antígeno-recuperado por tratamento por microondas-citrato. As lâminas foram então coradas com Ig-NKp30, controlo negativo CD99-Ig ou NKp46D2-Ig, seguidas pelo complexo HRP-biotinilado de cabra-anti-humano-Fc e avidina-biotina. Substrato para HRP foi AEC (cor vermelha) e lâminas foram contra-coradas com hematoxilina. Figura mostra uma coloração representante no X400 ampliação. Seta no NKp30-Ig coloração de adenocarcinoma (painel superior esquerdo) aponta para uma coloração da membrana representativa. intensidade de coloração para os melhores painéis esquerdo e direito superior é considerado como 2 (ver Métodos). (D) A expressão de ligantes NKp30 e NKp46 é abundante em tumores da próstata malignas. Cortes de diferentes pacientes que sofrem de benigna (
n
= 8) ou malignos (
n
= 9) tumores da próstata foram preparadas e coradas como acima. A coloração foi realizada em triplicado. Análise de intensidade da coloração (0-3) e a percentagem de células de tumor coradas foi realizada por dois patologistas. A coloração positiva foi definida quando a intensidade da coloração foi acima de 1 e englobados pelo menos 50% das células, conforme descrito em ‘materiais e métodos’.
Para atenuar as nossas observações, foi analisada a expressão de ligandos de NKp30 e NKp46 em adenocarcinoma prostático primário e hiperplasia benigna da próstata (HBP) derivada a partir de pacientes humanos. cancros da próstata embebidos em parafina fixadas em formalina foram coradas com NKp30-Ig, NKp46D2-Ig ou as proteínas de fusão de controle (tais como CD99-Ig). A Figura 1c mostra exemplos representativos de tecidos manchados e Figura 1D resume os resultados obtidos a partir de 9 de adenocarcinoma e 8 tecidos de cancro da próstata benigna. Como mostrado, 7/9 e 5/9 adenocarcinomas da próstata foram positivamente coradas pela NKp30-Ig e Ig-NKp46D2, respectivamente, indicando a existência de ligandos para NKp30 e NKp46 sobre as células malignas. A expressão destes antigénios englobados 50-95% das células tumorais com diferentes graus de intensidades e mostrou tanto a distribuição intracelular e membranar (Figura 1C, seta na parte superior pontos painel da esquerda para coloração da membrana). Em contraste, todas as secções da HBP testados foram coradas negativamente por NKp30-Ig ou NKp46D2-Ig, como na maioria dos casos menos do que 10% das células foram coradas e a intensidade era abaixo 1. Mais importante, nem os adenocarcinomas nem as secções foram coradas BPH por a proteína de fusão de Ig de controlo CD99-Ig (e outras proteínas de controlo, dados não mostrados). Estes resultados demonstram que de forma semelhante às linhas de células de cancro da próstata cultivadas em cultura, tumores primários derivados expressar selectivamente ligandos para os receptores de lise NK e NKp30 NKp46D2. Além disso, a expressão desses ligantes desconhecidos é induzida somente em fases mais avançadas da doença em que o adenocarcinoma já evoluiu.
NKp30-Ig inibe o crescimento da linha de células de câncer de próstata DU145
in vivo
proteínas de fusão de Ig foram anteriormente utilizados como agentes terapêuticos eficazes na prática clínica [23]. Aqui demonstramos que tanto NKp30-Ig e Ig NKp46D2-se ligam especificamente tecidos humanos derivados de pacientes com cancro da próstata, indicando a presença de específica (embora desconhecido) ligandos (Figura 1B e C).
Para determinar se e NKp30 NKp46D2 fundido com IgG1 humano poderia mediar a resposta eficaz tumor anti
in vivo
, que injetaram em ratos nu com a linha de tumor da próstata humana DU145. Duas semanas após a injecção, quando os tumores se tornaram visíveis, (definido como o dia 1 na Figura 2) os ratos foram tratados com NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, controlar IgG1 humano ou PBS (nota legenda da Figura 2 para curso de tratamento e avaliação do crescimento) . Em ambos os grupos de controlo que receberam IgG1 humana (
N
= 10) ou PBS (
N
= 10), os animais demonstraram um rápido crescimento dos tumores (Figura 2). Da mesma forma, o NKp46D2-Ig de ratos tratados (
N
= 9) mostrou um aumento gradual no tamanho de tumores, indicando nenhum efeito terapêutico. Em contraste, o tratamento com NKp30-Ig (
N
= 10) resultou numa supressão notável de desenvolvimento do tumor; a partir da segunda administração de NKp30-Ig (no dia 7), o tamanho do tumor permaneceu constante durante três semanas, e apenas uma progressão moderada foi detectada nos dias seguintes (figura 2). Além disso, em 5 dos 10 ratinhos que foram injectados com NKp30-Ig, os tumores desapareceu depois da segunda injecção (dia 7) e não reapareceu mesmo até dois meses após a última injecção.
ratinhos nus macho injectados com a linha de tumor da próstata humano DU145 (4 × 10
6), foram tratados com NKp30-Ig (
N
= 10), NKp46D2-Ig (
N
= 9) , controlar IgG1 humana (
n
= 10) ou PBS (
n
= 10). Dia 1 é definida no pós-injeção duas semanas quando os tumores se tornaram visíveis. Os tratamentos foram administrados 5 vezes (dias 1, 7, 15, 25 e 34, assinaladas com setas) e incluiu uma dose maior inicial das proteínas (20 mg /kg), seguido por doses mais baixas (10 mg /kg). a progressão do tumor foi avaliada a cada três dias, medindo o diâmetro dos tumores. Os gráficos mostram o diâmetro médio (mm) dos tumores em cada grupo medidos em dias 1-45.
O tratamento com NKp30-Ig reduz PC3 /
Luc
crescimento do tumor
in-vivo
Estudar um processo biológico complexo, como o crescimento do tumor e do impacto da terapia
in-vivo
exige um modelo que seja sensível e preciso o suficiente para detectar desenvolvimentos ainda que sutis. Recentemente, uma nova tecnologia de imagem de bioluminescência base que permite a detecção não invasiva de células tumorais
in-vivo
foi relatada [14], [24]. Esta estratégia baseia-se no enxerto de cancros humanos que expressam de forma estável um gene repórter, como
luciferase
(
Luc
), em ratinhos. Expressão da luciferase permite
in vivo
monitorização do tamanho e distribuição dos tumores relativo e, portanto, pode também detectar o desenvolvimento metastático. Além disso, este sistema é altamente sensível e fiável para a detecção de tumores secundários que são difíceis ou mesmo impossíveis de detectar em outros métodos, tais como medições do tamanho do tumor directos ou análise de FACS de extractos de tumores [24]. Por este motivo, utilizou-se a linha celular de cancro da próstata PC3 humana marcado por expressão estável do gene da luciferase (PC3 /
Luc
) que foi previamente aplicado no outro semelhante
in vivo
modelos [14 ].
Para acompanhar o efeito das proteínas de fusão NKp30-Ig e NKp46D2-Ig na progressão da PC3 /
luc
linha de células de cancro da próstata
in-vivo
, nós camundongos nu masculina injectados com PC3 /
luc
células. Três semanas após a injecção (designado como “ponto de início”), o crescimento do tumor foi avaliado pela câmara CCCD e aqueles ratinhos que expressam tumores que eram suficientemente grandes para a transmissão de uma intensidade de sinal integrado de 100 contagens de fotões e acima, foram escolhidos para posterior tratamento com NKp30 -Ig (
n
= 16), NKp46D2-Ig (
n
= 9) ou com PBS como controle (
n
= 8). O tratamento incluiu uma injecção i.p. injecção de PBS ou de 4 mg /kg de peso corporal da proteína de fusão relevante, dado todos os dias durante um mês. No final do período de tratamento (designado como “ponto final”), o tamanho do tumor foi avaliada de novo na câmara CCCD.
Tal como mostrado na Figura 3A e resumido na figura 4b, o tratamento de ratinhos com Ig-NKp30 teve um efeito dramático no crescimento do tumor. Enquanto no grupo de controlo (Figura 3C e 4), rápido aumento no tamanho do tumor foi observada em quase todos os animais (87,5%), NKp30-Ig-treatement conduziu a uma redução substancial na progressão do tumor; em 50% dos ratinhos tratados com NKp30-Ig do tumor foi drasticamente reduzido para 20% ou abaixo do seu tamanho original (considerado como “tratamento eficaz”), 25% mostraram efeito parcial enquanto que 25% não responderam e desenvolveram tumores progressivos. Além disso, nesses ratinhos em que foi obtido um tratamento eficaz, sem recidiva foi observada mesmo três meses após a última administração NKp30-Ig. Importante, NKp30-Ig efeito terapêutico não foi dependente do tamanho original do tumor, como a capacidade de resposta ou não resposta não se correlacionou com o sinal inicial detectado a partir do tumor, tal como medido no “ponto de início” (indicado em números acima de cada coluna) .
ratinhos nus machos foram injectados com PC3 /
luc
células tumorais (15 × 10
6) nos flancos deixou SC. Três semanas após a implantação do tumor, os ratinhos foram injectados (ip) a cada segundo dia ao longo de um período de um mês, com 4 mg /kg de NKp30-Ig (
N
= 16) (a), NKp46D2-Ig (
n
= 9) (b) ou PBS (
N
= 8) (C). a progressão do tumor foi monitorizado medindo a emissão de luz a partir de cada ratinho individual na iniciação ( “ponto de início”) e no final ( “ponto final”) do período de tratamento. Eixos Y representam os relativos (em percentagem) as mudanças no tamanho do tumor após o tratamento, tal como calculado a partir da emissão de luz integrada medido em cada ponto de tempo (indicado acima números de colunas). O encolhimento do tumor em 20% ou abaixo do seu tamanho original foi referido como “tratamento eficaz”. Este valor é um resumo de dois experimentos e inclui todos os ratos que foram testados. Tratamento
NKp30-Ig suprimiu significativamente o crescimento de ambos DU145 e PC3 /
Luc
, mas com um efeito mais proeminente na PC3 /
Luc
(figuras 2-4). Isso não poderia ser atribuída a diferenças na expressão do ligando (Figura 1A) e pode refletir o crescimento progressivo melhorada do DU145 comparação com PC3 /
Luc
. Em contraste com NKp30-Ig e de acordo com os resultados apresentados acima (figura 2), o tratamento NKp46D2-Ig tiveram apenas um efeito marginal (figura 3b e 4); 66,6% dos camundongos tratados com NKp46D2-Ig mostrou o crescimento do tumor progressiva, enquanto 22,2% e 11,1% foram parcialmente curado ou eficazmente tratados, respectivamente.
(a) Visualização de progressão e distribuição
in vivo tumor
. A figura mostra uma visualização de imagens de um animal representativo de cada tratamento. A escala do lado direito de cada figura descreve o mapa de cores da contagem de fótons. A emissão de luz integrado ( “I”) está indicado no lado esquerdo de cada fotografia. (B) Síntese do efeito do tratamento. A Tabela descreve o efeito global de tratamentos, como se mostra em detalhes na Figura 3.
A Figura 4a mostra uma ilustração de um rato representativo de cada grupo de tratamento. Na maioria dos casos não foram observadas metástases. As medições de tumor descritas acima (Figura 3) representam toda a massa tumoral detectada em cada animal.
Estes resultados demonstram claramente o potencial terapêutico da proteína de fusão de Ig-NKp30 para o tratamento do cancro da próstata humano
In vivo
.
Farmacocinética de NKp30-Ig e NKp46D2-Ig
em conjunto, nossos resultados indicam que NKp30-Ig, mas não NKp46D2-Ig, pode suprimir o crescimento tumoral
in vivo
. Este efeito seletivo foi surpreendente uma vez que ambos NKp30-Ig e NKp46D2-Ig ligar de forma semelhante ao PC3 /
Luc
, DU145 (Figura 1A e B) e humanos espécimes de cancro da próstata
in vitro
(Figura 1C ). Assim, as diferenças entre o potencial terapêutico de NKp46D2-Ig e Ig-NKp30 deve resultar de outras características das proteínas que influenciam a eficiência do tratamento.
Um dos factores mais importantes na terapia do cancro é o t
1/2 do agente terapêutico. A fim de mediar um efeito anti-tumoral significativa as proteínas de fusão deve ser capaz de alcançar o soro e permanecer estável durante várias horas
.
Para estimar a estabilidade relativa das proteínas de fusão
in vivo
, os ratos receberam uma dose única (5 mg /kg de peso corporal), quer de NKp30-Ig ou NKp46D2-Ig e então monitoradas para os níveis de proteínas específicas no soro a cada poucas horas durante 14 dias. O nível máximo de proteínas medidos no soro foi semelhante para ambos NKp46D2-Ig e NKp30-Ig (figura 5a e b). No entanto, foram observadas diferenças claras na cinética e a estabilidade das duas proteínas de fusão; elevados níveis de NKp46D2-Ig foram identificados no soro depois de 1 hora a partir da injecção, embora diminuiu rapidamente no sangue e no prazo de 2 horas, cerca de 50% da proteína degradou-se. Além disso, após 24 horas, apenas pequenas vestígios de NKp46D2-Ig foram observados (Figura 5b). Em contraste, os níveis mais elevados de NKp30-Ig foram detectados no soro já 30 minutos após a injecção e foram mantidas durante cerca de dois dias, para diminuir apenas depois de 120 horas (Figura 1A). Estas observações demonstram a estabilidade relativa de NKp30-Ig
In vivo
e pode explicar, pelo menos parcialmente, a falha de NKp46D2-Ig para produzir um efeito terapêutico.
i.p. Os ratos foram injectados com uma dose (5 mg /kg) de NKp30-Ig (a) ou NKp46D2-Ig (b). Amostra de soro foram recolhidas (a 0, 0,5, 1, 2, 6, 25, 48, 120, 168, 264 e 312 horas após a injecção) e os níveis de NKp30-Ig ou NKp46D2-Ig foram determinadas num ensaio de ELISA padrão. A figura mostra o valor médio de proteínas de fusão detectados no soro de três ratinhos, medir em cada ponto de tempo. As barras de erro representam a média ± sd de triplicados.
NKp30-Ig aumenta a citotoxicidade macrófagos mediada contra células tumorais
in vitro
Vários mecanismos têm sido propostos para o capacidade de anticorpos tumor para mediar o seu efeito
in vivo
. Uma maneira possível por que tais anticorpos podem inibir o crescimento tumoral é por ligação a receptores que estão envolvidos na regulação do ciclo celular [25] superfície. Por isso, primeiro testado se a ligação de NKp30-Ig aos seus ligandos desconhecidos tumorais podem induzir a apoptose directa ou paragem do crescimento de células tumorais em cultura. PC3 /
Luc
e células DU145 foram incubadas com concentrações crescentes de NKp30-Ig, NKp46D2-Ig ou controlar a proteína de fusão de Ig durante 48 horas na presença de um anticorpo de ligação cruzada. Após o tratamento, a percentagem de células apoptóticas foi determinada por Anexina V e iodeto de propídio coloração (PI). A incubação de ambos os PC3 /
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ou células DU145 com as várias proteínas de fusão não teve efeito sobre as taxas de apoptose (figura 6a e b) como a apoptose espontânea média de PC3 /
luc Comprar e DU145 as células (cerca de 25% e 8%, respectivamente) permaneceu semelhante e não foi afectado por qualquer um dos tratamentos. Além disso, não foi observada a paragem do ciclo celular, tal como avaliado através de ensaios de incorporação de timidina (dados não mostrados). Resultados semelhantes foram obtidos após incubação durante 24 h ou 72 h (dados não mostrados).
(a, b) a apoptose NKp30-Ig não induz nas células tumorais. PC3 /
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(a) ou DU145 (b) As células foram incubadas com concentrações crescentes de NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, Ig de controlo ou PBS na presença de um anticorpo de ligação cruzada. Após 48 horas, a percentagem de células apoptóticas foi determinada por coloração de anexina V e PI. A figura mostra uma de três experiências realizadas. (C, d) NKp30-Ig pode mediar opsonização do tumor por macrófagos. Rotulado radioactivo PC3 /
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células DU145 (d) (C) ou foram incubadas com macrófagos activados com LPS nas proporções indicadas E:T. A lise específica foi determinada após 48 horas. As barras de erro representam D.P. ± média de triplicados. Figura representa um em cada três experimentos realizados. (E) A infiltração de macrófagos para o tecido tumoral. tumores da próstata humano (DU145) cultivados em ratinhos nus foram fixados em formalina a 10% tamponada. secções embebidas em parafina foram coradas em Hematoxilina e Eosina. As setas indicam tumorais associated- macrófagos (X380). Este valor representa um em cada cinco seções testado.
Uma vez que as células tumorais não demonstraram sensibilidade intrínseca à NKp30-Ig
in vitro
, nós próxima testada a capacidade de NKp30- Ig para induzir a morte mediada por efector de células tumorais. Os macrófagos foram previamente implicado como principais intervenientes no controle dependente de anticorpos tumor
in vivo
[26], [27]. Para avaliar a capacidade de NKp30-Ig para melhorar a lise de células tumorais mediada por macrófagos, os ratinhos foram injectados primeiro (i.p.) com tioglicolato de modo a causar uma inflamação não patogénico local e recrutar um grande número de macrófagos na cavidade do peritoneu. Cinco dias mais tarde, os ratinhos foram sacrificados e os macrófagos foram isolados.