Abstract

A expressão de gangliosídeos é frequentemente associada com a progressão do câncer. Sialiltransferases têm recebido muita atenção em termos de sua relação com o câncer, porque eles modulam a expressão de gangliosídeos. Nós anteriormente demonstrado que a produção de GD1a foi elevada em linhas celulares de cancro da próstata resistente à castração, PC3 e DU145, principalmente devido à sua elevada expressão de β-galactósido α2,3-sialiltransferase (ST3Gal) II (não ST3Gal I), e a expressão de tanto ST3Gals foi regulamentada pelo NF-kB, principalmente por RelB. No presente documento demonstram que GD1a foi produzida em abundância nas amostras de tecido canceroso de pacientes humanos com cancro da próstata sensível a hormona, bem como cancros da próstata resistente à castração. A expressão de ST3Gal II foi activada constitutivamente em linhas celulares de cancro da próstata resistente à castração, PC3 e DU145, por causa da hipometilação de ilha CpG no seu promotor. No entanto, em células LNCaP empobrecido de androgénio, uma linha celular de cancro da próstata sensível a hormona, a expressão de ST3Gal II foi silenciada devido à hipermetilação da região promotora. A expressão de ST3Gal II em células LNCaP aumentaram com o tratamento com testosterona por causa da desmetilação dos locais de CpG. Esta expressão ST3Gal II dependente de testosterona foi suprimido por siARN RelB, indicando que RelB activado ST3Gal II transcrição no promotor desmetilado induzida por testosterona. Por conseguinte, nos cancros da próstata sensível a hormona, a produção de GD1a pode ser regulada por androgénio. Este é o primeiro relatório que indica que a expressão de uma sialiltransferase é regulado transcricionalmente por desmetilação dependente de androgénios dos locais de CpG na sua promotor do gene

citação:. Hatano K, Y Miyamoto, Mori H, Nimura K, Nakai Y, Nonomura N, et al. (2012) andrógeno-regulamentado de controlo da transcrição de sialiltransferases em células cancerosas da próstata. PLoS ONE 7 (2): e31234. doi: 10.1371 /journal.pone.0031234

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 10 Agosto, 2011; Aceito: 04 de janeiro de 2012; Publicação: 08 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Hatano et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Programa de Promoção de Estudos Fundamentais em Ciências da Saúde do Instituto Nacional de Biomedical Inovação (Project ID: 10-03) e pela Osaka Norte (Saito) Biomedical do Conhecimento Cluster Projeto Criação. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Muitas células cancerosas têm glicanos sialilados aberrantes em sua superfície. Estas moléculas aberrantes podem estar envolvidos na progressão do cancro [1] – [3], mas glicanos sialilados também desempenham diversos papéis em organismos saudáveis ​​e as células não cancerosas, incluindo embriogénese, regulação da resposta imunológica e a ligação do vírus que conduz a infecções [4 ], [5]. glicanos sialilados são sintetizados por sialiltransferases, que adicionam ácidos siálicos para as cadeias de oligossacáridos das glicoproteínas e glicoesfingolípidos (GSL) [5]. Até à data, 20 sialiltransferase genes foram clonados, e as respectivas enzimas foram agrupados em quatro famílias de acordo com as ligações de hidratos de carbono que catalisam: p-galactósido α2,3-sialiltransferases (ST3Gal I-VI), β-galactósido α2,6- sialiltransferases (ST6Gal I e ​​II), GalNAc α2,6-sialiltransferases (ST6GalNAc I-VI), e α2,8-sialiltransferases (ST8Sia I-VI) [6]. Durante a transformação neoplásica e progressão do cancro, a actividade de sialiltransferases é frequentemente alterada, e, consequentemente, as células cancerosas se mais fortemente sialilada glicanos na sua superfície do que as células não cancerosas, [1], [2], [7].

GSL que contêm ácidos siálicos são conhecidos como gangliósidos e são expressos em níveis elevados em várias células de cancro [3]. Os gangliosidos presentes nas células de cancro são utilizados como biomarcadores ou alvos de tratamento, e os gangliósidos enriquecidas diferem entre os tipos de células de cancro [8] – [10]. Temos focado na síntese GD1a em células cancerosas, porque GD1a tem várias ações biológicas que promovem a progressão do câncer. Por exemplo, células de cancro altamente metastáticos têm abundante GD1a, GD1a e está envolvido na adesão celular de cancro de células endoteliais durante a metástase [11]. O GD1a derramado por células tumorais no microambiente tumoral promove a angiogénese e aumenta a sinalização de factor de crescimento, aumentando a dimerização de receptores de factores de crescimento [12] – [15]. Portanto, GD1a pode estar envolvida na proliferação de células cancerosas e metástases. Além disso, este é um gangliósido receptor para o vírus Sendai [16], e partículas de vírus inactivados Sendai [vírus hemaglutinante do Japão envelope (HVJ-E)] induzir a apoptose em várias células de cancro humano com GD1a enriquecida na sua superfície [17]. Portanto, GD1a pode ser uma molécula atraente do ponto de vista da terapia do cancro

GD1a tem sido relatada a ser produzidos abundantemente em células de cancro da próstata resistente à castração [17] -. [20], e que demonstrou anteriormente que a castração células cancerosas da próstata resistentes ao foram efetivamente erradicada pela HVJ-E [17]. GD1a é sintetizado a partir de GM1 por ST3Gal I e ​​II. O valor de Km de ST3Gal II para GM1 é menor do que a ST3Gal I; Assim, ST3Gal II contribui preferencialmente a síntese GD1a [6], [21] – [24]. Recentemente, demonstrou que a produção abundante de GD1a em células de cancro da próstata resistente à castração está correlacionada com os níveis elevados de expressão ST3Gal II [20], e que a expressão ST3Gal II é regulada por NF-kB, principalmente por RelB, no cancro da próstata resistente à castração células [20]. Embora os níveis RelB foram semelhantes em uma linha celular de cancro hormono-sensível da próstata (LNCap) e células de cancro da próstata resistente à castração, e embora ST3Gal I foi expressa em células LNCaP [20], a expressão de ST3Gal II foi silenciada em células LNCaP, e GD1a era muito menos abundante nas células LNCaP [17], [20]

não tem sido até agora não publicado análise dos níveis de gangliósidos em amostras de tecido canceroso de pacientes humanos com cancro da próstata.; no entanto, foi observada uma resposta imunológica endógena para GD1a em pacientes com cancro da próstata hormono-sensível, mas não nos controles saudáveis ​​[19], sugerindo que GD1a é abundantemente produzido em cânceres de próstata hormônio-sensível. O cancro da próstata exibe crescimento dependente de androgénios e progressão [25]; Portanto, androgénios também podem regular a produção GD1a que está relacionado com a progressão do cancro. No entanto, também há estudos publicados que examinaram o controle hormonal da síntese de glicanos sialilados.

O objetivo deste estudo foi determinar se GD1a é produzido em abundância em cânceres de próstata hormônio-sensível em pacientes e analisar o controlo transcricional de sialiltransferases, especialmente ST3Gal II, necessário para a síntese de GD1a em cânceres de próstata hormônio-sensível.

Materiais e Métodos

Ética declaração

consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes para o uso de suas amostras de tecido, eo uso de tais espécimes foi aprovado pela Universidade de Osaka Hospital Institutional Review Board (Osaka, Japão).

cultura celular

a castração as linhas celulares resistentes ao cancro da próstata humanas, PC3 e DU145, e uma linha celular de cancro da próstata humano hormono-sensível, LNCap clone FGC, foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD). Uma célula da próstata humana normal epitelial, PNT2, foi adquirido a partir da Colecção Europeia de Culturas de Células Animais (Porton Down, Reino Unido). células PC3 foram mantidas em meio de Eagle modificado de Dulbecco F12 (Nacalai Tesque, Quioto, Japão), e DU145, LNCap, e PNT2 células foram mantidas em meio RPMI 1640 (Nacalai Tesque, Quioto, Japão). Todos os meios foram suplementados com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2.

Reagentes e anticorpos

Tricostatina A (TSA) e 5-aza 2′-desoxicitidina (5-azadC) foram adquiridos a partir de Wako Puré Chemical Industries (Osaka, Japão). A testosterona foi adquirida a partir de Tokyo Chemical Industry (Tóquio, Japão). Bicalutamida foi comprado de Enzo Life Sciences (Plymouth Meeting, PA). As enzimas de restrição,

Msp

I e

Hpa

II, foram adquiridas da New England Biolabs (Ipswich, MA). Anti-humano RelB (C1E4) foi adquirido a Cell Signaling (Danvers, MA). Anti-humano β-actina (CA-15) foi adquirido a partir de Abcam (Cambridge, Reino Unido).

em tempo real quantitativa de RT-PCR

O ARN total foi isolado utilizando um kit de isolamento de ARN RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). O ADNc foi sintetizado utilizando um High Capacity cDNA de transcrição reversa Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR quantitativo em tempo real foi realizado com um Applied Biosystems 7900 HT rápido sistema de PCR em tempo real de acordo com as seguintes condições: 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. As misturas de sondas e os pares de iniciadores específicos para ST3Gal I humana (Hs00161688_m1), ST3Gal II (Hs00199480_m1), ST3Gal VI (Hs00196086_m1), RelB (Hs00232399_m1), e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (Hs99999905_m1) foram adquiridos de Applied Biosystems . Os níveis de expressão relativos foram calculados a partir de uma curva padrão obtida usando diluições logarítmicas de ADNc contendo o gene de interesse, e os valores foram normalizados para GAPDH, um controlo interno.

Avaliação utilizando um gene repórter

os genes foram usados ​​para transfectar células, juntamente com uma construção repórter de luciferase dirigido por um sítio de ligação de NF-kB, RelA, e RelB (NF-kB do gene repórter de luciferase; BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA), utilizando o reagente de Fugene HD (Roche, Basileia, Suíça). A actividade da luciferase foi medida com o sistema de ensaio de luciferase duplo (Promega, Madison, WI).

análise Western blot

As células foram colhidas e lisadas com tampão de lise RIPA. As amostras de proteína foram separados por electroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida. As proteínas separadas foram transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno, em seguida, as membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% e incubadas durante a noite a 4 ° C com anti-RelB (1:500) ou anti-β-actina (1:2000 anticorpos). As membranas foram lavadas e marcadas com uma diluição 1:2000 de anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) à temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. Detecção por quimioluminescência foi realizada de acordo com o manual do utilizador ECL (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). As imagens foram capturadas com ImageQuant LAS 4000mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido), e quantificação de sinais de Western blot foi realizada por densitometria com software ImageQuant TL (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido).

experimentos de interferência RNA

O seguinte de cadeia dupla discrição pequeno RNA interferente (siRNA) oligonucleótidos de ARN e mexidos foram adquiridos a partir de Invitrogen (Tóquio, Japão): oligonucleótidos de ARNsi contra RelB foram (sentido) 5′-UCUUCAGGGACCCAGCGUUGUAGGG-3 ‘e (anti-sentido) 5 ‘-CCCUACAACGCUGGGUCCCUGAAGA-3’. As transfecções foram realizadas com Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen, Tóquio, Japão), de acordo com as instruções do fabricante.

metilação específicas de PCR (MSP) análise

metilação do DNA foi analisado nas ilhas de CpG por um MSP análise como descrito anteriormente [26]. Para a análise de MSP, o DNA genómico foi extraído de células e purificados utilizando o kit de DNA QIAamp (Qiagen, Valencia, CA). O ADN genómico foi submetido a conversão de bissulfito utilizando um kit EZ Metilação de DNA (Zymo Research, Irvine, CA). Com base na sequência do promotor P1 ST3Gal II e ST3Gal I p1 de promotores, iniciadores específicos metilados e não metilados iniciadores específicos foram concebidos utilizando o programa Primer Metil Software expresso versão 1.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA). iniciadores específicos metilados II-A ST3Gal foram sentido, 5′-TAGGGCGTAGCGGTTTTATC-3 ‘, anti-sentido, 5′-ACTAACCGAAAACGCCTCTC-3′, e os iniciadores específicos II-ST3Gal não metilado foram sentido, 5’-GGTTAGGGTGTAGTGGTTTTATT-3 ‘, e anti-sentido, 5’-CACACTAACCAAAAACACCTCTC-3 ‘. O ST3Gal II região 5 ‘não traduzida a partir de -659 a -495 foi escolhido para a análise MSP. iniciadores específicos metilados I-A foram ST3Gal sentido, 5’-TAGGGTCGGTCGTAGTGTTC-3 ‘, anti-sentido, 5′-ACCGATCCCCTACTAACGAC-3′, e os iniciadores específicos I-ST3Gal não metilado foram sentido, 5’-TTAGGGTTGGTTGTAGTGTTT-3 ‘, e anti-sentido, 5’-AACCAATCCCCTACTAACAAC-3 ‘. O ST3Gal I região 5 ‘não traduzida a partir de -697 a -535 foi escolhido para a análise MSP. iniciadores específicos -methylated O gene de glutationa-S-transferase-π (GSTP1) foram sentido, 5’-AGTTGCGCGGCGATTTC-3 ‘, anti-sentido, 5′-GCCCCAATACTAAATCACGACG-3’, e os iniciadores específicos de GSTP1-sentido não metilado eram, 5 ‘ -GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT-3 ‘, e anti-sentido, 5′-CCACCCCAATACTAAATCACAACA-3’, tal como descrito anteriormente [27]. DNA genómico purificado tratada com bissulfito de sódio foi amplificada por PCR como se segue: 2 min a 95 ° C para desnaturação, 35 ciclos de amplificação (95 ° C durante 30 s, 56 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 30 s) . O DNA genómico humano ou ADN genómico humano enzimaticamente metilado (Chemicon International, Temecula, CA) foi bissulfito-convertido e utilizado como um controlo positivo para os genes metilados ou metilados. A ausência de um molde de ADN serviu como um controlo negativo. Os produtos foram analisados ​​em géis de agarose a 2% corado com brometo de etídio.

Isolamento de GSLs ácidas a partir de tecidos de câncer de próstata

Os pacientes diagnosticados com câncer de próstata foram submetidos a biópsia da próstata ou ressecção de tumores na Universidade de Osaka Hospital (Osaka, Japão). amostras de tecidos cancerosos primários foram congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. A maioria dos procedimentos experimentais foram relatados anteriormente [28]. Em resumo, as amostras foram homogeneizadas em clorofórmio /metanol (02:01, v /v), e incubou-se à temperatura ambiente durante 2 h com 30 segundos de sonicação a cada 30 min. Metanol foi em seguida adicionado às amostras, que foram centrifugados a 1800 x g durante 15 min. As pastilhas foram homogeneizadas em clorofórmio /metanol /água (1:2:0.8, v /v /v), incubado à temperatura ambiente durante 2 h, e em seguida centrifugada a 1800 × g durante 15 min. Ambos os extractos foram combinados e evaporados até à secura num concentrador de vácuo. O resíduo foi dissolvido em clorofórmio /metanol /água (30:60:8) e fraccionou-se por cromatografia em coluna de DEAE-Sephadex A25 para separar GSL neutros de GSL ácidas.

Análise de GSL ácidas

as estruturas dos ácidos GSL foram analisados ​​pela libertação enzimática de porções hidrato de carbono, marcação fluorescente com aminopiridina, e mapeamento bidimensional seguido por espectrometria de massa. A maioria dos procedimentos experimentais foram relatados anteriormente [28]. Em resumo, os GSL ácidas foram extraídas de amostras de tecido de cancro primário ou células cancerosas em cultura e digerido com endoglycoceramidase II recombinante a partir de

Rhodococcus sp. (Takara Bio Inc., Shiga, Japão). Os oligossacáridos libertados foram marcadas com 2-aminopiridina (2-AP) e separadas num sistema de HPLC Shimadzu LC-20A (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão) equipado com um detector de fluorescência Waters 2475. De fase normal HPLC foi realizada num gel de TSK-amida 80 em coluna (0,2 x 25 cm, Tosoh, Tokyo, Japão). O tamanho molecular de cada (PA) -oligosaccharide pyridylaminated é dado em unidades de glucose (GU) com base nos tempos de eluição de PA-isomalto. HPLC de fase reversa foi realizada num gel de TSK ODS-80Ts (0,2 x 15 cm, Tosoh). O tempo de retenção de cada PA-oligossacárido é dado em unidades de glucose com base nos tempos de eluição dos isomalto-PA. Portanto, o comportamento de um dado composto nestas duas colunas fornecem um conjunto único de Gu (amida) e valores de Gu (ODS), que correspondem a coordenadas no mapa 2-D. PA-oligossacáridos foram analisados ​​por LC /ESI /MS. PA-oligossacarídeos padrão, PA-GM1 e PA-GD1a, foram adquiridos da Takara Bio e PA-LST-a e PA-SPG foram isolados como em nosso estudo anterior [28].

Análise estatística

os resultados são relatados como médias ± erro padrão (sE). De Student não pareado bicaudal

t

-test foi utilizado para determinar a significância estatística das diferenças entre os dois grupos. Os valores de probabilidade de P 0,05 foram considerados como sendo estatisticamente significativo. A análise estatística foi realizada utilizando o programa de software StatView 5.0 (SAS Institute, Cary, NC).

Resultados

Análises de gangliosídeos em amostras de tecido canceroso de pacientes com câncer de próstata

que anteriormente se demonstrou que GD1a era abundante em linhas celulares de cancro da próstata resistente à castração (incluindo PC3 e DU145), enquanto que foi dificilmente detectável em uma linha de células de cancro da próstata sensível a hormonas (LNCap) e uma linha de célula epitelial de próstata normal (PNT2) [17]. Foram examinados os níveis de gangliosídeos em amostras de tecido canceroso de oito pacientes com câncer de próstata, incluindo seis pacientes com cancro da próstata hormono-sensível avançado e dois pacientes com câncer de próstata resistente à castração (Tabela 1). Os GSL ácidos extraídos a partir de amostras de tecido canceroso a partir destas pacientes foram analisados ​​utilizando HPLC (Fig. 1). Ambos GM3 GD3 e são gangliósidos comum expresso em ambas as células de cancro da próstata e células epiteliais de próstata normais [18], [19]. GD1a foi produzida nas amostras de tecido canceroso a partir de ambos os pacientes com cancros da próstata sensível a hormonas e aqueles com cancros da próstata resistente à castração (Fig. 1A, 1B). Em todas as amostras de pacientes »(hormona-sensíveis e resistente à castração), a percentagem média do total de GSL ácidos com GD1a foi de 8,1%, e não houve diferença estatisticamente significativa foi observada em comparação com o valor a partir de linhas celulares de cancro da próstata resistente à castração ( PC3 e DU145) (Fig. 1C).

(a) os GSLs ácidas das amostras de tecido canceroso de oito pacientes com câncer de próstata, incluindo seis pacientes com cancro da próstata hormono-sensível avançado e dois pacientes com castration- cancro da próstata resistentes foram separados por tamanho molecular dos oligossacáridos usando HPLC de fase normal. As amostras de um paciente (designado Processo 1) foram obtidos a partir tanto as metástases da próstata e osso para avaliação. (B) Os GSL ácidas nas amostras de tecido canceroso primário foram separados por tamanho molecular dos oligossacáridos usando HPLC. A quantidade de GD1a é apresentada como uma percentagem do total de ácidos com GSL GD1a. (C) Os GSL ácidas em células de cancro da próstata em cultura foram separados por tamanho molecular dos oligossacáridos usando HPLC. O ensaio foi feito em triplicado, e as médias ± D.P. GD1a níveis são apresentados como a proporção em relação ao total GSL ácidas nas linhas celulares. A média ± E.P. nível GD1a também foi apresentada como a razão para o total de ácidos GSL em amostras dos pacientes (SH + CR) indicados na Figura 1B. (HS, hormone-sensível; CR resistente à castração; F, livre glicano)

regulação andrógeno-dependentes de ST3Gal II em células LNCaP

A síntese de. GD1a é regulado, principalmente, por ST3Gal II, e a expressão de ST3Gal II é regulada por NF-kB, principalmente por RelB, em linhas celulares de cancro da próstata resistente à castração [20]. As quantidades de RelB nuclear foram semelhantes em células LNCaP sensíveis a hormonas e células PC3 e DU145 resistente à castração [20], mas a expressão de ST3Gal II foi menor nas células LNCaP do que nas células PC3 e DU145 [20].

O meio de cultura de células é rotineiramente LNCap suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS). Um relatório recente mostrou que um meio suplementado com FBS a 10% contém apenas níveis de castração de testosterona [29]; em contraste, os cânceres de próstata hormônio-sensível de pacientes não tratados costumam crescer em um ambiente de testosterona contendo

in vivo

. Para analisar o controlo transcricional de ST3Gal II em cancros da próstata sensível a hormona, nós examinamos se a expressão de ST3Gal II foi controlada por testosterona em células LNCaP. As células LNCaP foram tratados com testosterona (0-1000 nM), e foram incubadas durante 120 h. O quantitativo em tempo real análises de PCR mostrou que a expressão de ST3Gal II era mais elevada em células LNCaP tratadas com testosterona do que nas células que não eram LNCap (Fig. 2A). Além disso, a indução de ST3Gal II após o tratamento com testosterona foi suprimido por um anti-androgénio, bicalutamida, em células LNCaP (Fig. 2B). Para garantir que não houve andrógenos presentes na mídia, células LNCaP foram incubadas em soro despojado carvão por 48 h. O nível basal de ST3Gal II não foi significativamente diferente entre a FBS- 10% e carvão despojado células suplementado com soro LNCap (Fig. 2C). As células LNCaP foram subsequentemente tratadas com 100 nM de testosterona, e o curso temporal de expressão após tratamento com testosterona foi avaliada. A expressão de ST3Gal II foi aumentada 48 horas após o tratamento com testosterona, e permaneceu elevada durante mais de 120 h nas células LNCaP (Fig. 2C). Para avaliar a actividade de NF-kB após o tratamento com testosterona, as células LNCaP foram transfectadas com um constructo repórter de luciferase de NF-kB e incubou-se durante 120 h com ou sem testosterona. A actividade de NF-kB não foi significativamente diferente nas células LNCaP tratados com testosterona em comparação com células cultivadas sem a testosterona (Figura S1). Em PC3 e PNT2 células, nenhum aumento significativo na expressão de ST3Gal II foi detectado independentemente do facto de as células cultivadas com ou sem testosterona (Fig. 2A). A expressão de ST3Gal II não aumentaram após o tratamento com testosterona em células PC3, a qualquer ponto de tempo até 120 horas (Figura S2). Com base nestas descobertas, que a hipótese de que os meios com níveis de castração de testosterona levou ao silenciamento epigenético de ST3Gal, um gene necessário para a síntese de GD1a, em células LNCaP.

(A) LNCap, PC3, e PNT2 células foram tratadas com ou sem testosterona (0-1000 nM) durante 120 h, por realimentação com meio fresco com ou sem testosterona a 72 h. O quantitativo em tempo real análises por PCR de ARNm ST3Gal II foram realizadas, e os níveis de expressão são relatados como médias ± D.P. (N = 3) a diferença de dobra em ARNm após a normalização dos valores com o nível de expressão de células não tratadas. ** P 0,001. (B) As células LNCaP foram tratadas com ou sem testosterona (0-100 nM) e, simultaneamente, com ou sem 10 uM bicalutamida durante 120 h, por realimentação com meio fresco com ou sem a testosterona e /ou bicalutamida a 72 h. O quantitativo em tempo real para as análises por PCR ST3Gal II foram realizadas, e os níveis de expressão são relatados como médias ± D.P. (N = 3) a diferença de dobra em ARNm após a normalização dos valores com o nível de expressão de células não tratadas. ** P 0,001. (C) As células LNCaP foram incubadas em soro despojado com carvão (CSS) durante 48 h e, em seguida, tratada com 100 nM de testosterona durante os tempos indicados. O quantitativo em tempo real para as análises por PCR ST3Gal II foram realizadas, e os níveis de expressão são relatados como médias ± D.P. (N = 3) a diferença de dobra em ARNm após a normalização dos valores com o nível de expressão de células não tratadas. * P 0,05, ** P . 0.001

Regulação epigenética de ST3Gal II em células LNCaP

Em seguida, examinamos se ST3Gal II foi epigenetically regulamentada em células LNCaP. As células LNCaP foram tratados com um inibidor da metiltransferase de ADN, 5-azadC, e incubou-se durante 120 horas (Fig. 3a). O quantitativo em tempo real análises de PCR mostrou que a expressão de ST3Gal II foi regulado para cima depois de tratamento com 5-azadC. Seguindo este experimento, as células LNCaP foram tratados com um inibidor da histona desacetilase, TSA, e incubadas durante 48 h (Fig. 3B). O quantitativo em tempo real análises de PCR mostrou que a expressão de ST3Gal II foi regulado para cima após o tratamento de TSA. Estes resultados sugerem que a regulação epigenética, incluindo a metilação de ADN e histonas modificações, pode ser envolvida na repressão do gene ST3Gal II em células LNCaP. Em outras experiências, nós focada na metilação do ADN na ilha CpG no promotor ST3Gal II.

(A) As células LNCaP foram tratadas com 5-aza-2′-desoxicitidina (5-azadC) (0-50 ^ M) durante 120 h, por realimentação com meio fresco com ou sem 5-azadC a 72 h. O quantitativo em tempo real para as análises por PCR ST3Gal II foram realizadas, e os níveis de expressão são relatados como médias ± D.P. (N = 3) a diferença de dobra em ARNm após a normalização dos valores com o nível de expressão de células não tratadas. * P 0,05. (B) As células LNCaP foram tratadas com 5 uM de tricostatina A (TSA) durante 48 h. O quantitativo em tempo real para as análises por PCR ST3Gal II foram realizadas, e os níveis de expressão são relatados como médias ± D.P. (N = 3) a diferença de dobra em ARNm após a normalização dos valores com o nível de expressão de células não tratadas. * P . 0,05

Controlo de metilação do DNA na ilha CpG no promotor do gene ST3Gal II em células de cancro da próstata

O gene humano para ST3Gal II foi clonado, e a promotor P1 é supostamente necessária para a transcrição activa deste gene em células de cancro da próstata [30]. As sequências do promotor ST3Gal II estão publicamente disponíveis, e nós identificamos uma ilha CpG no promotor p1 ST3Gal II usando o programa Software Metil Primer Express, versão 1.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) (Fig. 4a). Foi examinada a metilação de CpG no promotor ST3Gal II, utilizando a análise de MSP. O ADN genómico foi isolado a partir de células LNCaP tratadas com ou sem 5-azadC durante 120 horas, que foram em seguida tratados com bissulfito de sódio, e o ADN foi amplificado com os iniciadores específicos para o não metilado ou metilado o promotor ST3Gal II (Fig. 4B). Em células LNCaP, a ilha de CpG no promotor ST3Gal II, que foi originalmente hipermetilado, foi desmetilado por tratamento com 5-azadC. Em seguida, examinou-se o efeito da testosterona sobre a metilação de CpG no promotor ST3Gal II em células LNCaP utilizando uma análise de MSP (Fig. 4C). Nas células PC3 e DU145, a ilha de CpG do promotor ST3Gal II era constitutivamente hypomethylated. Nas células LNCaP, a ilha de CpG do promotor hipermetilado foi ST3Gal II na ausência de testosterona e desmetilado na presença de testosterona. Além disso, a desmetilação na ilha CpG no promotor ST3Gal II após o tratamento com testosterona foi suprimido por um anti-androgénio, bicalutamida, em células LNCaP (Fig. 4D).

(A) A ilha CpG no ST3Gal promotor P1 II e a localização dos iniciadores de MSP. As barras verticais representam locais de CpG e SST representa o local de início da transcrição. (B-D) O MSP análises da ilha CpG de ST3Gal II. O ADN foi isolado a partir de células LNCaP tratadas com 5-azadC (0-50 uM) durante 120 h (B), as linhas celulares de cancro da próstata resistente à castração (PC3 e DU145) ou células LNCaP tratadas com ou sem 100 nM de testosterona durante 120 horas ( C) ou LNCaP tratadas com ou sem 100 nM de testosterona em simultâneo com ou sem 10 uM bicalutamida durante 120 h (D). Em seguida, o ADN foi tratado com bissulfito de sódio, e, finalmente, amplificado com os iniciadores específicos para o não metilado (USP) ou o (MSP) forma metilada da ilha CpG no promotor ST3Gal II (H, controlo metilado; UA, o controlo não metilado A; UB, o controle não metilado B). As análises MSP foram repetidos 3 vezes com os mesmos resultados, e uma imagem representativa é mostrado nas figuras.

Nós também examinou se desmetilação DNA global está sob controle andrógeno-dependentes em células LNCaP. Foram examinados os padrões de restrição geral de

Msp

I- ou DNA genómico

Hpa

II-digerida. Estas enzimas são isoschizomers que reconhecem a sequência-alvo 5′-CCGG-3 ‘, mas a actividade de

Hpa II é inibido por metilação da citosina interior desta sequência. O ADN isolado células LNCaP formulário genômicas tratados com ou sem testosterona foi digerido utilizando

Msp

I ou

Hpa

II (Figura S3A). O tratamento com testosterona não afetou muito o padrão de digestão de ADN genómico tratado II

Hpa

de células LNCaP, indicando que desmetilação DNA global em células LNCaP não estava sob controle de andrógeno-dependentes. Em seguida, examinou a ilha de CpG de GSTP1, que é referido como sendo hipermetilado durante a carcinogénese da próstata e também em células LNCaP [27]. Com base na análise de MSP, o tratamento com testosterona não afectar a metilação de GSTP1 nas células LNCaP (Figura S3B). Assim, o controlo dependente do androgénio da desmetilação de ADN pode ser induzida preferencialmente na ilha CpG no promotor do gene ST3Gal II em células LNCaP.

andrógeno-dependente e de regulação epigenética ST3Gal I em células LNCaP

Embora GD1a é sintetizado a partir de GM1 principalmente por ST3Gal II, ST3Gal I, podem também contribuir para a síntese de GD1a [6], [21] – [24]. Nós relatado anteriormente que ST3Gal I foi expressa em células LNCaP, enquanto a expressão de ST3Gal II foi silenciada [20]. Portanto, a regulação da transcrição ST3Gal I pode ser diferente da de ST3Gal II. Nós depois examinar se a expressão de ST3Gal I, ST3Gal como II, foi controlada por testosterona em células LNCaP. Nesta experiência, as células LNCaP foram tratados com testosterona e incubou-se durante 120 h. O quantitativo em tempo real análises de PCR mostrou que o tratamento com testosterona resultou num aumento da expressão de ST3Gal I em células LNCaP (Fig. 5A), embora a expressão de ST3Gal VI, a sialiltransferase necessário para a síntese de paragloboside sialil, não foi induzida por tratamento com testosterona (Figura S4). Além disso, a indução mediada por testosterona de ST3Gal I em células LNCaP foi suprimida por bicalutamida (Fig. 5B). Para assegurar que não havia andrógenos presente nos meios de cultura de células, as células LNCaP foram incubadas em soro despojado com carvão durante 48 h. O nível basal de ST3Gal I não foi significativamente diferente entre as células LNCaP cultivadas com 10% de FBS e soro despojado com carvão (Fig. 5C). Em seguida, as células LNCaP foram tratadas com 100 nM de testosterona, e o curso temporal das alterações após o tratamento com testosterona foi avaliada. A expressão de ST3Gal I aumentou 72 h após o tratamento com testosterona e permaneceu elevada durante mais de 120 h em células LNCaP (Fig. 5C). Em PC3 e PNT2 células, nenhum aumento significativo na expressão de ST3Gal I foi detectada após o tratamento com testosterona (Figura S5).

células LNCaP (A) foram tratados com ou sem testosterona (0-1000 nM) durante 120