Abstract

hormona libertadora de gonadotropina receptores (GnRH) são expressos em câncer de próstata, especificamente na a fase mais agressivo do tumor (cancro da próstata resistente à castração, CRPC) para os quais o tratamento padrão, a quimioterapia baseada em docetaxel, só pode melhorar o tempo médio de sobrevivência por alguns meses. Nós anteriormente mostraram que os agonistas de GnRH exercem uma actividade anti-tumoral em células CRPC; no entanto, uma ligação entre os receptores da GnRH e da maquinaria apoptótica continua a ser definida. Objetivo deste estudo foi avaliar se, em células CRPC, agonistas GnRH pode afetar a expressão /atividade de proteínas relacionadas à apoptose e pode sensibilizar ou resensitize, células cancerosas para quimioterápicos. Foi demonstrado que, em células DU145 p53-positiva, agonistas de GnRH: a) aumentar a expressão da proteína Bax proapoptótica; este efeito é mediado pela fosforilação (activação) de p53, desencadeada pelo p38 MAPK; b) potenciar a actividade anti-proliferativa /pró-apoptótica de docetaxel; c) docetaxel resensitize células resistentes para a actividade anti-tumoral do fármaco citotóxico. Estes dados indicam que os agonistas de GnRH sensibilizar e, mais importante ainda, resensitize células DU145 CRPC à quimioterapia de um modo dependente da p53. Para confirmar o papel crucial da p53 na actividade de agonistas de GnRH, os experimentos foram realizados em células PC3 p53-null. Verificou-se que os agonistas de GnRH não conseguem aumentar a expressão do Bax e não potenciar a actividade citotóxica de docetaxel. Estes resultados podem fornecer uma base racional para as estratégias de tratamento nova combinação, especialmente para pacientes CRPC docetaxel resistentes que expressam uma proteína p53 funcional

Citation:. Moretti RM, Marelli MM, Taylor DM, Martini PGV, Marzagalli M, Limonta P (2014) Hormônio Liberador de Gonadotropina agonistas Sensibilizar e resensitize, células cancerosas da próstata para Docetaxel em um Manner p53-dependente. PLoS ONE 9 (4): e93713. doi: 10.1371 /journal.pone.0093713

editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Itália |

Recebido: 14 Outubro, 2013; Aceito: 05 de março de 2014; Publicação: 10 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Moretti et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Università degli Studi di Milano, programa de PUR (subvenções n. 12-1-95 e 12-1-104). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o câncer mais comumente diagnosticado em homens ea segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer entre os homens nos países ocidentais [1]. A maioria dos cancros da próstata são dependentes da presença de androgénios para o crescimento e sobrevivência, e a terapia a ablação de androgénio, destinados a bloquear a secreção de androgénio /actividade, representa o tratamento inicial mais eficaz [2], [3]. Esta terapia inclui a castração cirúrgica ou química, alcançado através de: administração de hormona libertadora de gonadotropina (GnRH) análogos; o bloqueio da ligação dos androgénios ao seu receptor por anti-androgénios; inibição das enzimas esteroidogénicas. Infelizmente, apesar de uma excelente resposta inicial, em cerca de 2 a 3 anos, a maioria dos cânceres de próstata irão progredir para o câncer de próstata (CRPC) fase resistente à castração com o aumento da proliferação e malignidade [4], [5]. Para pacientes CRPC, a quimioterapia baseada em taxano representa o tratamento de escolha [6], [7]. Docetaxel actua ligando-se à tubulina para promover a polimerização e despolimerização de microtúbulos impede que, na ausência de trifosfato de guanosina. Também tem sido mostrado para induzir a morte de células tumorais por afectar a expressão /actividade de vários alvos específicos de cancro, incluindo a regulação negativa da proteína anti-apoptótica de Bcl-2 e sobre-regulação da proteína pró-apoptótica Bax [8], [9]. No entanto, apesar da primeira demonstração de uma melhor sobrevivência com quimioterapia baseada em docetaxel, a melhoria foi encontrada para ser apenas uma sobrevivência livre de progressão de alguns meses, [6], [10]. Assim, o tratamento de pacientes com CRPC que progride após quimioterapia baseada em docetaxel continua a ser um desafio clínico significativo. A identificação de novas estratégias destinadas a superar a resistência docetaxel provavelmente vai melhorar as opções terapêuticas para estes pacientes.

GnRH foi identificado pela primeira vez como o regulador chave hipotalâmico das funções reprodutivas. Ao ligar-se a receptores específicos (GnRH-R) na pituitária gonadotrofos GnRH activa o eixo pituitário-gonadal. agonistas de GnRH, quando administrado continuamente e em doses elevadas, pituitária dessensibilizar a GnRH-I, assim suprimindo a secreção de esteróides gonadais; com base na sua actividade, estes compostos representam o tratamento médico mais amplamente utilizado e com sucesso para o cancro da próstata sensível androgénio-[2], [11].

é agora bem estabelecido que os receptores de GnRH são expressos na próstata células de cancro, especificamente em células e tecidos CRPC [12] – [15]

Estes receptores (bem como os receptores de GnRH em células cancerosas da mama e ginecológicas e tecidos) foram caracterizados em primeiro lugar em termos de afinidade de ligação.. No entanto, os resultados contrastantes foram relatados: uma classe de sítios de ligação de baixa afinidade [12], [13], [16] – [18]; dois tipos de receptores (um com alta afinidade e um com baixa afinidade) [19] – [21]; uma única classe de afinidade elevada GnRH sítios de ligação [22] – [25]. Em particular, relataram a presença de receptores de GnRH baixa afinidade em células de câncer de próstata [12], [13]. A razão para esta discrepância é ainda uma questão de debate; no entanto, pode ser devido às diferentes condições experimentais adotadas (diferentes linhas celulares de cancro e ligantes, avaliação da afinidade de ligação em células cancerosas /tecidos que expressam os locais de ligação

vs

. células manipuladas para superexpressão dos receptores, celular modificações pós-tradução espec�icos do receptor,

etc.

).

Estas observações iniciais contrastantes estimulou a caracterização de receptores de cancro da GnRH, a nível molecular. Especificamente, relatado que tanto o ARNm que codifica para o receptor humano de GnRH pituitário e a correspondente proteína são expressos em células de cancro da próstata, ou seja resistente à castração [26] dependente de androgénio. Além disso, a sequência de nucleótidos do cDNA que codifica para os receptores de tumor tem sido demonstrado que correspondem ao anteriormente descrito para os receptores da pituitária [27], [28].

mostrou ainda que os agonistas de GnRH através da activação de receptores GnRH expressos localmente, exercem um forte efeito anti-proliferativo em células de câncer de próstata, tanto

in vitro

e

in vivo

[12], [29], [30]; esta actividade anti-tumoral é específica, uma vez que é completamente abolida após o silenciamento do receptor de GnRH através de um siRNA específica [31].

Em adição à proliferação celular reduzida, a apoptose tem sido sugerido para ser envolvido no antitumoral actividade de análogos de GnRH. No entanto, os dados até agora disponíveis sobre esta questão ainda são controversos [30], [32] – [35]

Aqui, nós confirmamos nossa observação anterior de que os agonistas GnRH não, por si só, induzir a apoptose em. células CRPC. No entanto, em células de cancro da próstata DU145-expressando p53, eles aumentam a expressão da proteína Bax pró-apoptótica, por meio de fosforilação na Ser-15 (

ie

., Activação) de p53, o principal regulador da via apoptótica intrínseca ; activação desta sinalização apoptótica p53-Bax é desencadeada por fosforilação de p38 MAPK. Mostramos também que os agonistas GnRH sensibilizar células DU145 à atividade antimitotic de docetaxel. Mais importante ainda, os agonistas de GnRH resensitize células DU145 docetaxel resistentes à actividade indutora de morte do agente quimioterapêutico. Estes dados indicam que, em células de cancro da próstata de p53-positivos, tendo como alvo receptores de GnRH expressos localmente por meio de agonistas de GnRH e sensibiliza resensitizes células cancerosas à quimioterapia, de um modo dependente da p53. O papel crucial desempenhado por p53 é ainda demonstrada pela observação de que os agonistas GnRH não afetam expressão Bax e deixar de potenciar a actividade apoptótica de docetaxel em células de câncer de próstata PC3 p53. Tomados em conjunto, estes resultados representam a justificativa para as estratégias de tratamento para pacientes combinação CRPC docetaxel-resistente, que expressa uma proteína p53 funcional.

Materiais e Métodos

Cell Cultures

O humano linhas celulares de cancro da próstata resistente à castração DU145 (p53-positiva) e PC3 (p53-null) foram adquiridos a partir da American Tissue Culture Collection. Ambas as células PC3 e DU145 representam o modelo mais apropriado e amplamente utilizada da CRPC na literatura [36] – [40]. As células foram rotineiramente cultivadas em Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) meio Roswell Park suplementado com 5% de Soro Fetal Bovino (FBS), glutamina (1 mmol /L) e antibióticos (100 IU /ml de penicilina G sódio e 100 ug /mL sulfato de estreptomicina), em atmosfera humidificada de 5% de CO

2/95% de ar a 37 ° C.

Materiais e anticorpos

O acetato de goserelina agonista de GnRH [D-Ser (tBu )

6Aza-Gli

10-GnRH, Zoladex, GnRH-A] foi gentilmente cedido pela AstraZeneca Pharmaceuticals. O antagonista de GnRH Antide (Ant) e docetaxel (DOC) foram adquiridos da Sigma-Aldrich.

Em todas as experiências, o agonista de GnRH foi utilizada na dose de 10

-6 mol /L, com base em estudos anteriores, a partir de laboratório dos autores, bem como dos outros, com o objectivo de investigar os aspectos moleculares da actividade antitumoral de análogos de GnRH em células CRPC [29], [41] – [46]. A mesma gama de doses, também foram utilizados para investigar a actividade anti-tumoral de agonistas de GnRH em vários modelos experimentais de células cancerosas que sobre-expressam o receptor de GnRH [16], [47] – [49].

Pifithrin-ct, a inibidor específico da actividade de transcrição de p53, e SB203580, o inibidor de p38 MAPK específico, foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology e a partir de Sigma-Aldrich, respectivamente

os anticorpos utilizados nas experiências de transferência de Western:. Bax de coelho anti-humana (1 :500; # 2772), de coelho anti-humano p38 MAPK (1:1,000 ;. # 9212) e coelho MAPK p-p38 anti-humana (1:1,000; # 9211) a partir de Cell Signaling Technology; monoclonal anti-humano Bcl-2 (1:250; # Sc-7382), rato monoclonal anti-p53 humana (1:1,000; # Sc-53394), de coelho anti-humano p-p53 (Ser-15; 1: 1000; # SC-101762) e de cabra anti-humana actina 1-19 (1:1,000.; # Sc-1616) a partir de Santa Cruz Biotechnology

Análise Microarray

células cancerosas da próstata foram DU145 semeada (5 × 10

5 células /prato) em 10 cm placas de cultura de tecidos; Após 48 horas, as células foram tratadas com GnRH-a (10

-6 mol /L) durante 24 horas e o ARN total foi preparado com a utilização de o RNeasy Mini Kit (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Depois de controle de qualidade usando um Bioanalyzer (Agilent 2100), RNAs foram rotulados de acordo com o protocolo Affymetrix usando um Kit Labeling Ciclo (Affymetrix). 15 ug de ARNc resultantes foram hibridizadas em todo U133 genoma de microarray mais 2,0. Após a hibridização em Affymetrix HG-U133 mais 2,0 fichas, valores de expressão gênica foram estimadas para cada conjunto de sonda usando pacotes na suite Bioconductor [50]. Genes foram normalizados e analisados ​​com o método robusto Análise Multichip (RMA) dentro do pacote affy [51] eo pacote GCRMA [52]. As diferenças nos níveis de expressão de log, tanto para dados normalizados GCRMA RMA e foram avaliados pelo teste t de duas caudas como implementado no pacote limma [53]. Genes com

P

-Valores 0,05 e a expressão absoluta dobra alterar superior a 1,5 foram considerados significativamente expressos diferencialmente (DE) entre as células tratadas e não tratadas. Uma lista gene foi gerado tomando a sobreposição de genes geradas pela DE limma de ambos os métodos de normalização e RMA GCRMA.

Análise Western Blot

No final das experiências, as células foram lavadas com PBS e lisadas em tampão RIPA (0,05 mol /L Tris-HCl pH 7,7, 0,15 mol /L de NaCl, 0,8% de SDS, 10 mmol /L de EDTA, 100 umol /L NaVO4, 50 mmol /L, NaF, 0,3 mmol /L de PMSF , 5 mmol /L de ácido iodoacético) contendo leupeptina (50 ng /ml), aprotinina (5 ul /ml) e pepstatina (50 ug /mL). A concentração de proteína foi determinada utilizando o método BCA. Os extractos de proteína (30 ug) foram ressuspensas em tampão de amostra (0,5 mol /L Tris-HCl pH 6,8, 20% de glicerol, 10% de SDS, 0,2% 2β-mercaptoetanol, 0,05% de azul de bromofenol) e aqueceu-se a 95 ° C durante 5 minutos . A seguir à separação electroforética por SDS-PAGE, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas em leite seco não gordo a 3%, antes da incubação à temperatura ambiente durante 2 horas com os anticorpos primários específicos nas diluições adequadas. A detecção foi realizada utilizando um anticorpo secundário-peroxidase de rábano conjugado reagentes e quimioluminescência aumentada (Supersignal sistema de detecção de quimioluminescência). Em cada experiência de expressão mancha Ocidental actina foi avaliada como um controlo de carga. Para cada análise de proteínas, três experimentos diferentes foram feitos; a análise densitométrica relatados nas figuras foi realizada sobre os resultados obtidos com as três experiências diferentes.

proliferação celular e viabilidade celular Estudos

DU145 e PC3 células foram semeadas (1 × 10

4 células por prato) em placas de 6 cm. Após 2 dias, as células foram tratadas com GnRH-a (10

-6 mol /L) durante 24 horas, quer isoladamente ou na presença do antagonista de GnRH Antide (formiga, 10

-6 mol /L) , seguido por docetaxel (10 nmol /L) durante 48-72 horas. As células tratadas com cada um dos dois medicamentos isoladamente ou sem qualquer tratamento serviram como controlos. No final dos tratamentos, as células foram colhidas e contadas por hemocitómetro. Para os estudos de viabilidade, as células DU145 e PC3 foram tratadas como descrito e a viabilidade celular foi medida por ensaio de exclusão de azul de tripano. O número de células mortas foi medida por contagem de células de coloração com Trypan Blue.

A caspase-3 Actividade da Enzima de Ensaio

a actividade da caspase-3-como foi avaliada utilizando o estojo de ensaio colorimétrico CaspACE (Promega). células DU145 foram semeadas (2 × 10

5 células /placa) em placas de 10 cm. Após 2 dias, as células foram pré-tratadas com GnRH-a (10

-6 mol /L) durante 24 horas e, em seguida, tratada com docetaxel (10 nmol /L) durante 72 horas. No final dos tratamentos, as células aderentes (tanto independente) e foram lisadas em tampão de lise contido no kit, seguido por centrifugação (15.000 x

g

durante 10 minutos a 4 ° C). a actividade da caspase-3 foi avaliada semelhante, seguindo a clivagem proteolítica do substrato colorimétrico Ac-DEVD-pNA. As amostras foram lidas a 405 nm num espectrofotómetro com 100 uL QUARZ cuvete. O inibidor pan-caspase z-VAD-fmk foi usado para confirmar a especificidade do ensaio.

Formação de Colónias Ensaio

Para o desenvolvimento de células de docetaxel-resistente (DU145-R), as células DU145 semeadas em placas de 10 cm de altura foram tratadas com docetaxel em série (10 nmol /L, uma vez por semana), até que desenvolveu a capacidade de crescer e dividir-se na presença do fármaco (8 semanas). Para investigar se o agonista de GnRH pode resensitize células DU145-R para a actividade de docetaxel, foi realizado um ensaio clonogénico padrão. células DU145-R foram semeadas a 1000 células /poço em placas de seis poços e deixadas a aderir durante 24 horas. As células foram então tratadas com GnRH-a (10

-6 mol /L) durante 24 horas, seguido de docetaxel (10 nmol /L) durante 72 horas. No final do tratamento, as células foram lavadas e foi adicionado meio fresco. As células foram cultivadas durante 14 dias em 5% de FBS contendo meio e, em seguida, fixadas e coradas com violeta de cristal. Imagens de colónias coradas foram capturados por um Photocamera Nikon.

Análise Estatística

Quando for o caso, os dados foram analisados ​​pelo teste de Bonferroni, após a análise de uma via de variância.

P

valores . 0,05 foram considerados significativos

Resultados

GnRH agonistas Aumentar Bax expressão em células DU145

Nós relatado anteriormente que os agonistas GnRH exercer uma antiproliferativa efeito sobre as células cancerosas da próstata DU145. No entanto, ainda não está claro se a apoptose também pode estar envolvido na actividade anti-tumor destes compostos [30], [32] – [35]. A família BCL-2 de reguladores de morte celular (tanto pró-apoptóticos e prosurvival) representa um ponto crítico de controlo na via intrínseca da apoptose. O balanço destas duas classes de proteínas determina o destino da célula. A proteína pró-apoptótica Bax, através de oligomerização com Bak, transloca do citoplasma para a mitocôndria para aumentar a permeabilização mitocondrial externa da membrana, provocando citocromo

c

liberação e caspase-3 atividade [54]. Aqui, nós investigamos se agonistas de GnRH pode afectar a expressão de genes envolvidos na via apoptótica. células DU145 foram tratadas com GnRH-a durante 24 horas e alterações no perfil de expressão do gene foi avaliada por análise do transcriptoma de todo o genoma. Entre os genes cuja expressão foi alterada pelo tratamento nos concentramos nossa atenção na expressão de

Bax

.

Bax

expressão foi significativamente aumentada em 1,67 vezes (Tabela 1); Este aumento foi confirmado ao nível da proteína por transferência de Western (Fig. 1A). foi encontrado o efeito estimulador da GnRH-a sobre a expressão da Bax para ser específico, uma vez que foi anulada pelo co-tratamento das células com o antagonista de GnRH Antide (Fig. 1B). Por outro lado, o agonista de GnRH não afecta a expressão da proteína anti-apoptótica de Bcl-2 (Fig. 1C).

(A) As células DU145 foram tratadas com GnRH-a (10

-6 mol /L) durante 24 ou 48 horas. Western blotting foi realizado com extractos de células inteiras usando um anticorpo anti-Bax. Como esperado, a GnRH-Um tratamento aumenta a expressão da proteína Bax às 24 horas de tratamento. (B) As células DU145 foram tratadas com GnRH-a (10

-6 mol /L) e com o antagonista de GnRH Antide (formiga, 10

-6 mol /L), quer isoladamente ou em combinação, por 24 horas. Western blot foi realizada tal como descrito em A). Ant, administrado sozinho, não afecta a expressão da Bax, ao passo que a GnRH-A, como esperado, aumenta a expressão do Bax. Este efeito estimulador da GnRH-A é específica, uma vez que é revogada pelo co-tratamento das células com o antagonista de GnRH. (C) O tratamento de células DU145 com GnRH-a (10

-6 mol /L) durante 24 ou 48 horas, não afecta a expressão de Bcl-2, tal como avaliado por Western blotting. Para tanto Bax e Bcl-2 Análise da expressão de proteína uma representativos de três experiências diferentes é mostrado. Os dados representam médias ± SEM. *

P Art 0,05

contra

C (controles não tratados); **

P Art 0,05

contra

células GnRH-tratados-A

Em células DU145 Expressão GnRH agonistas upregulate Bax através da sinalização p53. caminho

o papel fundamental da p53 na via apoptótica intrínseca está bem estabelecida [55]. Depois de ser activada através de fosforilação de Ser-15, p53 transloca-se para o núcleo para regular a expressão de genes pró-apoptóticos tais como,

Bax

[56]. Além disso, a fosforilação da p53 foi relatado para ser dependente da actividade da MAPK p38 [57]. Por análise de Western blot verificou-se que, em células DU145, GnRH-a tratamento (1-48 horas) não afecta a expressão de p53; No entanto, os níveis da serina-15 fosforilada (

i.e.

., activa) forma da proteína foram significativamente aumentados após 1 e 5 horas de tratamento (Fig. 2A). Quando as células foram pré-tratadas (2 horas) com pifithrin-α (o inibidor de p53) o efeito estimulador da GnRH-A (24 horas) sobre a expressão do Bax foi completamente abolida (Fig. 2B). Nós também descobrimos que o tratamento das células com GnRH-a (5-15 minutos) não afectou o nível de expressão de p38 MAPK; no entanto, aumentou significativamente os níveis da forma fosforilada da MAPK, em intervalos de tempo 5 e 10 minutos (Fig. 3a). O pré-tratamento (30 minutos) das células com SB203580 (1 pmol /L), o inibidor de p38 específico, reduziu significativamente os efeitos estimuladores da GnRH-a sobre a fosforilação de p53 (1 e 5 horas) (Fig. 3B). Assim, em células DU145 agonistas GnRH regular positivamente a expressão da proteína Bax pró-apoptótica através de fosforilação da p53; p38 MAPK é um activador a montante desta via de sinalização de p53-Bax.

(A) As células DU145 foram tratadas com GnRH-a (10

-6 mol /L) durante intervalos de tempo diferentes (1-48 horas). A análise de transferência de Western foi realizada em extractos de células inteiras por utilização de anticorpos de p53 ou p53 (p-Ser-15). O tratamento com GnRH-a não afecta a expressão de p53 em quaisquer intervalos de tempo considerados; No entanto, os níveis da forma fosforilada serina-15 da proteína são significativamente aumentados após 1 e 5 horas de tratamento. (B) As células DU145 foram tratadas com GnRH-a (10

-6 mol /L), quer isoladamente ou depois de um pré-tratamento com pifithrin-α (PIF, 30 mmol /L, durante 2 horas), o inibidor de p53 específico. A análise de transferência de Western foi realizada em extractos de células inteiras usando antiobody Bax. Os resultados obtidos mostram que pifitrhin-α, quando administrada isoladamente, não afecta a expressão do Bax. Como esperado, a GnRH-A aumenta a expressão do Bax; este efeito é completamente abolida quando as células são pré-tratadas com pifithrin-α. Uma representativos de três experiências diferentes, para cada uma das análises realizadas, é mostrada. Os dados representam médias ± SEM. *

P Art 0,05

contra

C (controles não tratados); **

P

. 0,05

contra

células tratadas-A GnRH

células DU145 (A) foram tratados com GnRH-A (10

-6 mol /L) durante intervalos de tempo diferentes (5-15 minutos). A análise de transferência de Western foi realizada em extractos de células inteiras por utilização de anticorpos de p38 e p-p38. O tratamento com GnRH-a não afecta a expressão de p38 em qualquer intervalo de tempo considerado. Por outro lado, a GnRH-A aumenta significativamente os níveis da forma fosforilada de p38 (p-p38) aos 5 e 10 minutos de tratamento. (B) Como se esperava, a GnRH-A aumenta os níveis de p-p53 de expressão, confirmando resultados anteriores; a análise densitométrica dos dados demonstram que este efeito é significativamente reduzida quando as células são pré-tratadas com o inibidor de p38 específico SB203580 (SB, 1 umol /L, durante 30 minutos). Uma representativos de três experiências diferentes, para cada uma das análises realizadas, é mostrada. Os dados representam médias ± SEM. *

P Art 0,05

contra

C (controles não tratados); **

P

. 0,05

contra

células GnRH-tratados-A

GnRH agonistas sensibilizar células DU145 p53 positivo para a atividade citotóxica de Docetaxel

a perturbação no equilíbrio entre fatores pró e anti-apoptóticos é um passo crucial na decisão de células a apoptose ou a sobrevivência. Com base no efeito estimulador de agonistas de GnRH sobre a expressão da Bax, mediada pela activação do p53, foi investigado se os agonistas de GnRH pode induzir a apoptose em células DU145. Por análise de FACS que não podia observar qualquer efeito pró-apoptótica de GnRH-a sobre estas células (dados não apresentados). Estas observações não foram inesperados, uma vez que foi anteriormente relatado que, em células CRPC, agonistas de GnRH reduzem a proliferação celular sem induzir apoptose [30], [32], [35]. A razão pela qual, em células DU145, agonistas GnRH aumentar os níveis de Bax sem disparar o evento apoptótica é intrigante. No entanto, é bem conhecido que as células DU145 sobre-expressar a proteína anti-apoptótica de Bcl-2, e os níveis desta proteína não são afectadas pelo tratamento de GnRH-A (ver Fig. 1C). Assim, é possível que, nestas células, o aumento da expressão do Bax induzida por GnRH-a não é suficiente para aumentar eficazmente a proporção de Bax /Bcl-2 para activar a apoptose. Com base nestas considerações, que argumentaram que os agonistas de GnRH, por meio de sobre-regulação dos factores pró-apoptóticos, pode sensibilizar células de cancro da próstata para a actividade de fármacos citotóxicos conhecidos, para actuar aumentando a expressão de factores pró-apoptóticos, enquanto diminui a de proteínas anti-apoptóticas. Nós concentramos nossa atenção sobre docetaxel uma vez: a) representa o tratamento de escolha para CRPC [4], [5]; b) tem sido demonstrado para induzir a morte de células tumorais através de regulação positiva da proteína Bax pró-apoptótica e a regulação negativa da proteína anti-apoptótica de Bcl-2 [8], [9]. Em primeiro lugar, por transferência de Western, constatou-se que o docetaxel (48 horas) diminui significativamente a expressão de Bcl-2, enquanto que o aumento da Bax (Fig. 4A). Então, nós avaliamos se agonistas GnRH pode potenciar a actividade antitumoral do docetaxel. Em primeiro lugar, verificaram que, quando administrada isoladamente, a GnRH-A (24 horas) não afecta a proliferação de células DU145. Isto não era inesperado, uma vez que já anteriormente relatado que, em células CRPC, agonistas de GnRH podem exercer um efeito antiproliferativo significativo apenas quando são realizados os tratamentos para intervalos de tempo mais longos (4-7 dias) [29]. Dados semelhantes foram relatados por outros tipos de tumores [58], [59]. Em seguida, foi demonstrado que o tratamento prévio de células DU145 com GnRH-a (24 horas) melhora significativamente os efeitos antiproliferativos de docetaxel (48-72 horas) a todos os intervalos de tempo (Fig. 4B). Além disso, podemos mostrar que o efeito sensibilizador de GnRH-a para o docetaxel foi específica uma vez que foi totalmente anulada pela co-tratamento das células com o antagonista de GnRH Antide (Fig. 4C). Nas mesmas condições experimentais, a avaliação da viabilidade das células foi realizada por ensaio de exclusão de azul de tripano. GnRH-a, quando administrada isoladamente, não afectou a viabilidade celular (Fig. 4D). Como esperado, o docetaxel aumentou significativamente o número de células coradas de azul tripano positivos (células mortas). Este efeito foi significativamente potenciada pelo pré-tratamento das células com GnRH-a em todos os intervalos de tempo (Fig. 4D). Para confirmar que o pré-tratamento com agonistas de GnRH sensibiliza células CRPC para a actividade antitumoral do docetaxel, células DU145 foram tratadas com GnRH-a (24 horas) e depois com o medicamento citotóxico durante 72 horas. a actividade da caspase-3 foi depois avaliada como um marcador da morte celular por apoptose. GnRH-A, administrado sozinho, não afectou a actividade da caspase-3; como esperado, o aumento da actividade enzimática de docetaxel. O pré-tratamento das células com GnRH-a potenciou significativamente o efeito proapototic do agente quimioterapêutico. O efeito é específica uma vez que foi neutralizado por tratamento simultâneo de células com o inibidor da pan-caspase z-VAD-fmk (Fig. 4E).

(A) análise de transferência de Western foi realizada para confirmar que o actividade citotóxica de docetaxel (DOC) é mediada por uma perturbação das proteínas pró-a-anti-apoptótico de relação. células DU145 foram tratadas com docetaxel (10 nmol /L) durante 48 horas. Como esperado, o docetaxel diminui a expressão da proteína anti-apoptótica de Bcl-2, enquanto o aumento da expressão do Bax. Uma representativos de três experiências diferentes é mostrado. (B) As células DU145 foram pré-tratadas com GnRH-a (10

-6 mol /L) durante 24 e, em seguida, com docetaxel (10 nmol /L) durante intervalos de tempo diferentes (48-72 horas). No final dos tratamentos, as células foram contadas por hemocitómetro. O pré-tratamento das células com GnRH-a aumenta significativamente o efeito anti-proliferativo de docetaxel em todos os intervalos de tempo considerados. (C) As células DU145 foram pré-tratadas com GnRH-a (10

-6 mol /L) e com o antagonista de GnRH Antide (formiga, 10

-6 mol /L), quer isoladamente ou em combinação, por 24 horas, e, em seguida, com docetaxel (10 nmol /L) durante 60 horas. No final dos tratamentos, as células foram contadas por hemocitómetro. O pré-tratamento das células com GnRH-a aumenta significativamente o efeito anti-proliferativo de docetaxel; este efeito é específico, uma vez que é completamente abolida pela co-tratamento das células com Ant. (D) No final dos tratamentos (efectuadas tal como descrito em B), a viabilidade celular foi medida por ensaio de exclusão de azul de tripano. O número de células mortas foi medida por contagem de células de coloração com Trypan Blue. Os dados são expressos como percentagem de células coradas células /total. Docetaxel aumenta significativamente o número de células mortas; em todos os intervalos de tempo, este efeito é significativamente potenciado pelo pré-tratamento das células com GnRH-a. células DU145 (E) foram pré-tratadas com GnRH-a durante 24 horas e, em seguida, tratada com docetaxel durante 72 horas. No final do tratamento a actividade da caspase-3 como foi avaliada utilizando o estojo de ensaio colorimétrico CaspACE. O pré-tratamento das células com GnRH-a potencia significativamente o efeito proapototic de docetaxel em termos de actividade da caspase-3. O efeito é específico, uma vez que é contrariado pelo tratamento simultâneo com o inibidor da pan-caspase z-VAD-fmk. No B-E cada grupo experimental consistiu de seis repetições e cada experimento foi repetido três vezes. Os dados representam médias ± SEM. *

P Art 0,05

contra

C (controles não tratados); **

P

. 0,05

contra

células tratadas com docetaxel

Estes resultados indicam que, em células de câncer de próstata DU145 p53-positivas agonistas GnRH especificamente sensibilizar as células à actividade citotóxica de docetaxel; este efeito é provavelmente a consequência da activação GnRH-induzida-A do p38 /p53 /Bax apoptose via de sinalização.

GnRH agonistas resensitize células DU145 p53 positivo para a atividade citotóxica de Docetaxel

para obter células de docetaxel-resistente (DU145-R), as células DU145 foram tratadas com docetaxel em série (uma vez por semana durante 8 semanas) até que desenvolveu a capacidade de crescer na presença do fármaco. Nestas células, a resistência ao composto citotóxico foi associada com uma diminuição significativa dos níveis de Bax, sem qualquer alteração no nível de expressão de Bcl-2 (Fig. 5A), confirmando observações anteriores que pouco consenso entre taxano-resistência e a sobre-expressão de Bcl-2 [60]. Por outro lado, os nossos dados indicam claramente que as células DU145 pode contrastar e superar a actividade anti-tumoral de drogas quimioterapêuticas através do aumento da razão entre proteínas anti-e pró-apoptóticas. Por ensaio clonogênica, então, nós investigamos se agonistas GnRH pode resensitize células cancerosas da próstata docetaxel resistente à atividade pró-apoptótica do medicamento quimioterápico. O tratamento de células DU145-R com GnRH-a (24 horas) por si só não afectou a capacidade das células para formarem colónias (Fig. 5B). Como esperado, as células DU145-R formado colónias na presença de docetaxel (72 horas), o que confirma a sua aquisição de resistência ao fármaco. No entanto, o tratamento de combinação (GnRH-A durante 24 horas, seguido de docetaxel por 72 horas) aboliu completamente a capacidade de formação de colónias de células DU145-R (Fig. 5B). Estes resultados indicam que os agonistas de GnRH podem resensitize células de cancro da próstata docetaxel resistentes à actividade anti-tumoral do fármaco quimioterapêutico.

próstata DU145 células cancerosas foram feitos resistentes ao docetaxel (DOC) após o tratamento com a droga quimioterapêutica (10 nmol /L), uma vez por semana durante 8 ciclos. (A) análise de transferência de Western de Bcl-2 e Bax em células docetaxel-resistente (DU145-R).