Abstract

expressão aberrante de microRNA-146a (miR-146a) tem sido relatada a ser envolvido no desenvolvimento e progressão de vários tipos de cancros. No entanto, o seu papel no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) não tem sido elucidado. O objetivo deste estudo foi investigar a contribuição de miR-146a para vários aspectos do fenótipo maligno dos CPNPC humanos. Em experimentos funcionais, miR-146a suprimiu o crescimento celular, a apoptose celular induzida e sinalização a jusante EGFR inibida em cinco linhagens de células NSCLC (H358, H1650, H1975, HCC827 e H292). miR-146a inibe também a capacidade migratório destas células NSCLC. Por outro lado, o miR-146a aumentaram a inibição da proliferação de células por drogas que alvejam EGFR, incluindo tanto TKI (gefitinib, erlotinib, e afatinib) e um anticorpo monoclonal (cetuximab). Estes efeitos foram independentes do estado de mutação do EGFR (do tipo selvagem, sensibilizando mutação ou mutação de resistência), mas eram menos potentes em comparação com os efeitos do siARN segmentação do EGFR. Os nossos resultados sugerem que estes efeitos de miR-146a são devidos à sua segmentação de sinalização de EGFR e NF-kB. Encontramos também, em parafina fixado em formalina clínica incorporado amostras (FFPE) de câncer de pulmão, que a baixa expressão de miR-146a foi correlacionada com os estágios TNM clínico avançado e metástases à distância em NSCLC (

P Art 0,05). Os pacientes com alta expressão de miR-146a em seus tumores mostrou maior sobrevida livre de progressão (25,6 semanas em pacientes de alto miR-146a versus 4,8 semanas em pacientes de baixo miR-146a,

P Art 0,05). miR-146a é portanto um candidato biomarcador prognóstico forte em NSCLC. Assim induzir miR-146a pode ser uma estratégia terapêutica para NSCLC

Citation:. Chen G, Umelo IA, Lv S, Teugels E, Fostier K, Kronenberger P, et al. (2013) miR-146a inibe o crescimento celular, migração celular e induz a apoptose em Non-Small Cell Lung Cancer Cells. PLoS ONE 8 (3): e60317. doi: 10.1371 /journal.pone.0060317

editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de outubro de 2012; Aceito: 25 de fevereiro de 2013; Publicação: 26 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi parcialmente financiado pelo fundo da Boehringer Ingelheim GmbH pesquisa. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores receberam financiamento de uma fonte comercial: Boehringer Ingelheim GmbH. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Não-pequenas de câncer de pulmão de células (NSCLC) compreende 75-85% dos recém-diagnosticados cancros do pulmão. Mais de 70% dos pacientes com NSCLC apresentam-se com doença avançada, ea taxa de sobrevida em 5 anos global para NSCLC é de apenas 16%. Para início de carreira ou cancro do pulmão localmente avançado, a cirurgia é o tratamento mais eficaz e combinação de quimioterapia é a abordagem adjuvante padrão. Durante a fase III /IV NSCLC, quimioterapia combinada à base de platina é o padrão atual de tratamento, mas com muito espaço para melhorias [1], [2]. Pulmão carcinogénese é um processo de múltiplos passos, o que resulta da activação de oncogenes e inactivação de genes supressores de tumores. Os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento de NSCLC está ainda mal compreendido. Por conseguinte, uma melhor compreensão destes mecanismos serão úteis para desenvolver novos alvos e estratégias terapêuticas para o tratamento de NSCLC humana [3], [4], [5].

Nos últimos anos, microARNs (miARNs) têm recebido cada vez mais atenção na pesquisa do câncer. Estes ARNs pequenos, não-codificantes podem inibir a expressão de genes alvo ligando-se a região não traduzida 3 ‘do ARNm alvo, resultando em qualquer degradação do mRNA ou a inibição da tradução. MiRNAs desempenham papéis importantes em muitos processos biológicos que envolvem a proliferação de células normais, a diferenciação, a apoptose, e resistência à tensão [6], [7]. No entanto, estudos também mostraram que a expressão aberrante ou miARN mutação está correlacionado com o desenvolvimento e progressão de cancros. Os miRNAs pode ter actividades supressoras oncogênicos ou tumorais, e, assim, miRNAs estão a emergir como alvos para a terapia do cancro [8]. Além disso, miARN pode ser utilizado como biomarcador de diagnóstico e de prognóstico no cancro.

A expressão de miR-146a foi encontrado para ser regulada para cima no carcinoma papilar da tiróide [9], o cancro da tiróide anaplásico [10] e câncer cervical [11], o que sugere miR-146a poderia funcionar como um miRNA “oncogênicos” nestes cancros. No entanto, menor expressão de miR-146a foi relatado no câncer de próstata [12], câncer pancreático [13] e câncer gástrico [14], [15]. Portanto, o papel de miR-146a pode variar em diversos tipos de cancros. Além disso, o nível de miR-146a foi encontrada uma correlação com a progressão metastático nos tumores oral [16]. Funcionalmente, Mir-expressando-146a células mostram bastante prejudicada invasão e capacidade de migração em relação às células de controlo, tanto o câncer de mama [17] e câncer pancreático [13]. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que modulação dos níveis de miR-146a tem potencial terapêutico para suprimir invasões e metástases. No entanto, a nosso conhecimento, nenhum estudo avaliou a associação entre as células NSCLC miR-146a e. Além disso, não há dados disponíveis sobre os efeitos do miR-146a sobre a biologia de células NSCLC. miR-146a pode ter como alvo EGFR, com base no emparelhamento de bases prevista usando análise miRBase [18], que tem sido funcionalmente confirmada no cancro da mama [17], [19] e cancro pancreático [13]. EGFR desempenha um papel crítico em NSCLC e a actividade de inibidores da tirosina-cinase EGFR (TKI) em NSCLC, especialmente na presença de mutações de EGFR de activação [20]. O complexo via de transdução de sinal de EGFR envolve a cascata de Ras /MAPK, fosfatidil-inositol 3-quinase (PI3K), transdutor de sinal e activador de transcrição (STAT), e a jusante proteína quinase C (PKC) [21]. Além disso, EGFR, que activam o NF-kB por fosforilação de IkB [22]. Além disso, o miR-146a desempenha um papel na regulação de NF-kB [13], [17], [19], [23], em diversos tumores malignos, apesar de NF-kB não é um alvo directo de miR-146a. Além disso, a relação entre o miR-146a e sinalização de EGFR ou NF-kB não foi elucidado.

A importância potencial desta determinado miRNA, miR-146a, chegou ao nosso conhecimento em experimentos que realizamos e que precedeu a descoberta do seu papel em outras malignidades ou o seu relacionamento com o ARNm de EGFR. Nestas experiências não publicadas, que perfilada miARN expressão em células Ba /F3 transfectadas com os genes de tipo selvagem e mutantes de EGFR, respectivamente, usando uma matriz líquida à base de grânulo previamente descrito [24]. perfis de miRNA comparativos foram obtidos em condições de linha de base e sob tratamento com EGFR TKI. A plataforma foi uma plataforma proprietária in-house e incluiu 425 miRNAs. miR-146a foi a miARN que mais fortemente correlacionada com o estado mutacional de EGFR, e teve a maior variação em resposta ao tratamento com TKI EGFR mutantes em células NSCLC e células Ba /F3 transfectadas com o EGFR mutante em comparação com as células do tipo selvagem de EGFR. Ao mesmo tempo, a homologia de sequência com o EGFR foi identificado [18].

Estimulados por estes resultados, foi investigada adicionalmente o efeito de miR-146a sobre o crescimento celular, a apoptose e a motilidade de células NSCLC humanas. Além disso, os efeitos de um mímico de miR-146a foi examinado quando combinado com TKI EGFR (gefitinib, erlotinib, e afatinib) e um anticorpo monoclonal (cetuximab) especificamente em linhas celulares de NSCLC, que são resistentes a TKI EGFR. Finalmente, a relação entre a expressão de miR-146a e parâmetros clínicos e prognóstico também foi explorada usando (FFPE) amostras fixadas em formalina e embebidos em parafina de câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e reagentes

as linhas de células NSCLC humanas H358, H1650, H1975, HCC827 e H292 foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (

ATCC, Holanda

) e cultivadas como descrito anteriormente [25], [ ,,,0],26]. O cetuximab anticorpo monoclonal específico para o EGFR (2 mg /ml), EGFR TKI gefitinib e erlotinib, e um inibidor panHER de EGFR, HER2 e HER4 quinases, afatinib (BIBW 2992, Boehringer Ingelheim GmbH), foram preparados como descrito previamente [25] , [26].

re-expressão e inibição de miR-146a em células NSCLC

células NSCLC foram semeadas numa placa de 24 poços (2,5 × 10

4 células por poço ) ou uma placa de 96 poços (2,5 x 10

3 células por poço) e incubou-se a 37 ° C durante 24 horas. As células foram então transfectadas com um mímico de miR-146a, um miARN imitar controlo negativo, um inibidor de miR-146a, ou um controlo negativo inibidor de miARN (

Ambion, Life Technologies Europe BV, Gent, Bélgica

), respectivamente, uma concentração final de 60 nmol /L utilizando Lipofectamina

TM 2000 (

No. Cat. 11668-019, Invitrogen Merelbeke, Belgium

). As células foram transfectadas com o miARN mímica ou inibidor de miARN diária. Após 5 dias de transfecção, as células foram divididas e novamente transfectado diariamente até ao dia 10 [13]. O siARN específica de EGFR foi descrito anteriormente [25], [27] (sequência: GCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTAT). O siRNA específico EGFR foi transfectado em células NSCLC com o mesmo método acima

As amostras de tecido

Foram coletados tecidos de 101 pacientes consecutivos. (Faixa etária de 29 a 83 anos, média de 68,3 anos) que tinham sido submetidos a ressecção cirúrgica ou biópsia para NSCLC nas duas instituições. Uma amostra de tecido pulmonar normal não afectado também foi realizada em 76 pacientes e utilizado como controlo emparelhado. Todas as amostras foram processadas para exame patológico. O protocolo do estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética locais de Primeira Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, China e Universitair Ziekenhuis Brussel (UZ Brussel), Bélgica. consentimentos informados por escrito foram obtidas de todos os pacientes. Os parâmetros clínico estão descritas na Tabela 1.

RT-qPCR

Para

in vitro

experimentos, o isolamento de ARN, a normalização RNA e transcrição reversa foram tão descrito anteriormente [25], [27], [28]. Para o tecido FFPE clínica, os blocos foram seccionados a uma espessura de 10 um (3 secções para isolamento de RNA total). O tecido foi desparafinado por xileno e etanol. O ARN total foi isolado a partir de secções de tumor utilizando o kit miRNeasy FFPE (

QIAGEN, KJ Venlo, Holanda

) de acordo com as instruções do fabricante, com modificações, alterando o tempo de incubação após a mistura com proteinase K a 36 horas a 55 ° C, enquanto isso, a adição de proteinase K a cada 12 horas para manter a sua concentração. Dependendo do tamanho da amostra de tumor, a concentração de ARN variaram de 20 ng /ul a 2 ug /uL detectado por Nanodrop 2000 (

Wilmington, DE 19810 EUA

). Intron-abrangendo os iniciadores de RT-PCR específicos para o EGFR ou ARNm de GAPDH foram descritos anteriormente [25], [28], [29]. Os primers para miR-146a e RNU6B foram incluídos no TaqMan

® MicroRNA Ensaios (

4.427.975-000.468, Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Gent, Bélgica

). Os iniciadores inversos foram também usados ​​no passo de transcrição reversa com TaqMan

® MicroRNA Transcrição Reversa Kit (

4366596, Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Gent, Bélgica

), num volume total de 10 ul . -QPCR em tempo real para o ARNm de EGFR foi realizada na Roche LightCycler

1,5 instrumento de detecção com verde de SYBR e análise de curva de fusão, tal como descrito anteriormente [28] e para miARN, Applied Biosystems PCR7900 foi usado ®. O ARNm alvo ou miARN abundância em cada amostra foi normalizada para a sua referência de GAPDH ou RUN6B como relatado [25], [27], [30].

crescimento celular

O crescimento celular foi avaliado usando um ensaio de tetrazólio colorimétrico (MTS) (

CellTiter96 Aqueous One Solution Proliferação celular ensaio G3580, Promega, Madison, EUA

). A mímica miARN, o inibidor de miARN ou siRNA foram transfectadas por dia, durante 0, 5 e 10 dias. Para os experimentos combinando mímica miR-146a e outros agentes (TKI de EGFR e mAb), o imitador de miR-146a foi inicialmente transfectado para as células, e subsequentemente as células foram cultivadas durante 7 dias. Os outros agentes foram adicionados no dia 7

th dia, e cultura de células foi prolongado por mais 3 dias. O protocolo foi como descrito anteriormente [25].

A viabilidade celular

Para confirmar ainda mais os dados do ensaio de MTS, a viabilidade celular foi detectada por detecção fluorimétrica da resorufina (

CellTiter-Azul Ensaio de viabilidade celular, G8080, Promega, Madison, EUA

) tal como descrito anteriormente [25].

a caspase-3/7 actividade de detecção

a actividade da caspase-3/7 foi medido usando rodamina um substrato sintético marcado de caspase-3/7 realizada imediatamente após a detecção de viabilidade celular nas mesmas cavidades, tal como descrito anteriormente [25].

avaliação microscopia fluorescente de apoptose celular e morfologia

a efeitos de imitador de miR-146a, ou inibidor de EGFR ou siRNA na apoptose e na morfologia nuclear nas células foi avaliada pela Hoechst 33342 e iodeto de propídio (PI) de dupla marcação fluorescente da cromatina, tal como descrito anteriormente [25].

Wound- cura ensaio

As células foram semeadas em poços individuais de uma placa de cultura de 6 poços. A transfecção foi realizada como acima. Antes de transfecção, uma estéril 10 mL ponta da pipeta foi usada para longitudinalmente arranhar uma faixa de diâmetro constante na monocamada confluente. Os detritos de células e meio foi aspirado e substituído por 2 ml de meio fresco. As fotografias foram tiradas em 0, 36, 72 e 108 horas após o ferimento. Para análise estatística, dez campos selecionados aleatoriamente ao longo de cada ferida foram marcados, e a área da ferida foi medida e a média foi calculada como a área da ferida desta ferida. A = área da ferida área de cicatrização da área 0 h-ferida de 36, 72 ou 108 horas, respectivamente, a área de cicatrização de feridas foi comparado primeiro a área da ferida de 0 horas, e, finalmente, em comparação com o controlo simulado.

análise Western blot

Depois de ser tratado para os períodos indicados, as células foram lavadas com PBS e submetidas a lise num tampão contendo Tris /HCl (pH 7,6) 20 mM, NaCl 150 mM (pH 6,85), 1 mM de EDTA (pH 8), Triton-X a 1%, Na-pirofosfato a 2,5 mM, ortovanadato de sódio (Na3VO4) 1 mM, leupeptina 1 ug /mL, cocktail inibidor de protease de um inibidor de fosfatase% e cocktails 1% (

Sigma -Aldrich NV /SA, Bornem, Bélgica

). Os lisados ​​foram centrifugados a 12000 × g durante 10 min a 4 ° C e fervida durante 5 min. A concentração de proteína do ligado foi detectado pelo ensaio de proteína Bio-Rad Bradford (

Nazaré Eke, Bélgica

) e 25 ug de proteína desnaturada foram sujeitos a SDS-PAGE (gel de 10% SDS-acrilamida) com um tampão de carga contendo Tris-HCl 80 (pH 6,8), 5% de SDS, 10% glicerol, 5 mM de EDTA (pH 8), 5% de 2-mercaptoetanol, 0,2% Bromophenolblue e fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, tal como descrito anteriormente [25]. A membrana foi incubada com os seguintes anticorpos primários como indicado: EGFR (

Cell Signaling

), fosfo-EGFR (Tyr1173, clone 9H2,

Upstate

), fosfo-ERK1 /2 (pTpY185 /187,

Invitrogen

), fosfo-AKT /PKB (Ser473,

Invitrogen

), fosfo-STAT3 (Tyr705, 3E2,

Cell Signaling

), fosfo-STAT5 ( Tyr694,

BD Biosciences

), fosfo-IκBα (Ser32 /36, 5A5,

Cell Signaling

), IκBα (L35A5,

Cell Signaling

), fosfo-NF- kB p65 (Ser536,

Cell Signaling

), NF-kB (

Cell Signaling

), fosfo-IRAQUE-1 (Ser376,

Santa Cruz Biotechnology

), IRAK- 1 (

Santa Cruz Biotechnology

) e β-actina (

Sigma-Aldrich NV

.).

a análise estatística

SPSS19.0 foi usado para analise estatistica. Os resultados foram representativos de três experiências independentes, a menos que indicado de outra forma. Os valores foram apresentados como a média ± desvio padrão (SD). Uma forma de Análise de Variância (ANOVA) foi utilizada para analisar a significância entre grupos. O método diferença mínima significativa (LSD) de múltiplas comparações com grupo e controle parental foi aplicado quando a probabilidade de ANOVA foi estatisticamente significativa. A análise de sobrevida foi realizada utilizando o teste de log-rank e Kaplan-Meier abordagem parcelas. A significância estatística foi determinada em um

P Art 0,05. Na análise de aditividade e sinergia, a interacção teórico-zero (exatamente aditivo) curva de dose-resposta para cada combinação de miR-146a mímico + droga foi calculada mediante a aplicação de critérios Bliss independência [31], [32]. A avaliação estatística do efeito aditivo ou sinérgico foi feito comparando cada um mímico de miR-146a + fármaco curva de dose-resposta com a curva de independência Bliss. O sinergismo é concluído quando o miR-146a mímico + fármaco curva de dose-resposta é mais elevado do que os intervalos de confiança de 95% para a respectiva curva independência Bliss, enquanto aditividade é quando o mímico de miR-146a + fármaco curva de dose-resposta é menor do que a de Bliss curva de independência e maior do que a curva de tratamento individual. A análise de aditividade e sinergia foi também avaliado pelo programa Biosoft CalcuSyn (Ferguson, MO, EUA). A combinação de índice (CI) foi utilizada para expressar sinergismo (CI 1), efeito aditivo (IC = 1), ou antagonismo (CI 1). [33]

Resultados

miR -146a inibe o crescimento celular e induz a apoptose de células em células NSCLC

primeiro, a expressão linha de base de miR-146a foi avaliada em todas as linhas celulares estudadas por ensaio em tempo real de RT-qPCR. A eficiência de transfecção do mímico de miR-146a e inibidor também foi primeiro verificada por ensaio de RT-qPCR. O nível de expressão de miR-146a em 5 e 10 dias pós-transfecção foi analisada. Após transfecção com o inibidor de miR-146a, ΔΔCq foi 1,82 (71,68% miR-146a knock-down) para H358, 1,09 (53,02% knock-down) para o H1650, 2.4 (81,05% para baixo knock-) para H1975, 1,92 (73,57 % miR-146a knock-down) para HCC827, e 1.89 (73.02% knock-down) para H292 10 dias após a transfecção. Após transfecção o mímico miR-146a durante 10 dias, os níveis de miR-146a foram muito aumentada, com ΔΔCq -14,69 (26431.0372 dobras) para H358, -10.97 (2005,8528 dobras) para H1650, -12.78 (7032,3681 dobras) para H1975, -13,25 9741.9847 (pregas) para HCC827 e -13,81 (14362.3081 dobras) para H292. Os controlos negativos tinham nenhuma mudança do nível de miR-146a (dados não mostrados). Com o inibidor de miR-146a, a proliferação celular foi ligeiramente reforçada em todas as linhas celulares testadas, mas sem diferença significativa em relação aos controles simulados. Após a transfecção com o imitador de miR-146a, uma redução significativa da proliferação foi observada em 10 a

° dia em todas as cinco linhas de células, apesar de menos do que o que se observa com siRNA alvejando o EGFR (Figura 1, Figura 2). Para verificar estes resultados, o efeito sobre a viabilidade foi avaliada utilizando um ensaio fluorimétrico de viabilidade resorufina (CellTiter azul, Promega, dados não mostrados), e por contagem microscópica de células viáveis ​​(Hoechst 33342 positiva /PI negativos) (Figura 3, Figura 4) . Em ambos os ensaios, os resultados seguem globalmente os resultados do ensaio de tetrazólio MTS. Para verificar se o miR-146a é capaz de induzir a apoptose, o ensaio CellTiter azul foi multiplexados com uma lâmpada fluorescente de caspase 3/7 ensaio (Apo Um, Promega). Os resultados mostram que o inibidor de miR-146a não aumentou a actividade da caspase-3/7. No entanto, o imitador de miR-146a melhorado significativamente a caspase-3/7 actividade em todas as cinco linhas de células NSCLC testados, mas o efeito foi muito menos do que o que é visto com siRNA alvejando o EGFR (Figura 5, Figura 6). O efeito sobre a apoptose foi confirmada microscopicamente pela Hoechst 33342 e PI coloração fluorescente dupla (Figura 3, Figura 7).

células NSCLC (H358, H1650 e H1975) foram incubadas na presença de inibidor de miR-146a, mímica , EGFR siRNA e diferentes controlos, por 0, 5 e 10 dias. O crescimento celular foi medida utilizando o ensaio colorimétrico de tetrazólio (MTS) (CellTiter96 Aqueous One Solution Ensaio de Proliferação celular). controle negativo 1 é inibidor de miRNA controle e negativo controle negativo 2 é miRNA mimetizador de controle negativo. *

P

. 0,05, em comparação com controlo em branco no mesmo ponto do tempo

células NSCLC foram tratados como mencionado na Figura 1. *

P . 0,05 comparado com o controlo em branco, ao mesmo ponto de tempo

células NSCLC foram tratados como indicado na Figura 1, e o efeito sobre a apoptose foi avaliada e comparada com o controlo simulado a 0, 5 e 10 dias após a transfecção com Hoechst 33342 e PI coloração fluorescente dupla.

O efeito do miR-146a no crescimento celular (H358, H1650 e H1975) foi ensaiada com Hoechst 33342 e PI dupla marcação fluorescente. *

P Art 0,05, **

P

. 0,01 em comparação com controlo em branco no mesmo ponto do tempo

células NSCLC foram tratados como mencionado no a Figura 1, e a actividade da caspase-3/7 foi examinado e comparado com os controlos simulados. *

P Art 0,05, **

P

. 0,01 em comparação com controlo em branco no mesmo ponto do tempo

células NSCLC (HCC827 e H292) foram tratados como indicado acima. *

P Art 0,05, **

P

. 0,01 em comparação com controlo em branco no mesmo ponto do tempo

O efeito do miR-146a em apoptose em H358, H1650 e H1975 foi examinado com Hoechst 33342 e PI dupla fluorescente coloração. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 em comparação com controlo em branco no mesmo ponto do tempo

miR-146a inibe a motilidade. células NSCLC

em seguida, avaliou-se o efeito da função de miR-146a sobre a motilidade de três linhagens de células NSCLC H358, H1650 e H1975. Nos controles simulados, as células H358 untransfected preciso mais tempo para curar ( 108 horas). Pelo contrário, as células H1975 curado o mais rápido ( 72 h). O inibidor de miR-146a causou uma taxa de cicatrização acelerada marcada em H358 células, e teve pouco efeito nas células H1650 e H1975. A mímica miR-146a levou a uma moderadamente diminuir a taxa de cicatrização de feridas em células H358 e H1650, respectivamente. No entanto, o mímico miR-146a não teve influência na motilidade celular em H1975 células. O siRNA alvejando EGFR inibiu a taxa de cicatrização de feridas em todas as linhas celulares testadas, com um efeito muito mais forte do que a mímica de miR-146a (Figura 8, Figura 9).

células NSCLC foram incubadas na presença de inibidor de miR-146a, miR-146a mímica, EGFR siRNA e diferentes controles para 0, 36, 72 e 108 horas pós-transfecção. A motilidade foi detectada utilizando o ensaio de cicatrização da ferida. As imagens de um campo de um representante poço de dez campos de visão em um poço são mostradas (× 100). M: controle simulada; C: controle negativo para miRNA imitar; Inhi: inibidor de miR-146a; Mimi: miR-146a mímica; Si: ARNsi específicos do EGFR. A taxa de cicatrização de feridas é expressa relativamente ao controlo simulado.

células NSCLC foram tratadas como nas experiências representados na Figura 8. A velocidade de cicatrização é expressa relativamente ao controlo simulado. A relação média foi calculada a partir de dez campos e as experiências foram repetidas em três poços independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 em comparação com controlo em branco no mesmo ponto do tempo

miR-146a provoca inibição do EGFR. e NF-kB sinalização em células NSCLC

para investigar o papel do miR-146a na regulação da sinalização celular, nós transfectadas células NSCLC com inibidor de miR-146a e mímica, e cultivaram as células por um período de até para 10 dias. Verificou-se que o aumento da expressão de miR-146a, em que as células NSCLC resultou na regulação negativa do EGFR tanto no ARNm (dados não mostrados) e os níveis de proteína (Figura 10). Mais importante, verificou-se que EGFR fosforilado também foi regulada negativamente após o miR-146a transfecção mímico semelhante ao siRNA específico do EGFR em diferentes linhas celulares (Figura 10). Ao mesmo tempo, a sinalização a jusante (AKT, ERK e vias STAT) foi também sub-regulada por mímico miR-146a, com um efeito mais fraco, em comparação com ARNsi específicos do EGFR. Para confirmar os efeitos de miR-146a sobre o EGFR, que as células transfectadas com o inibidor de NSCLC miR-146a e descobriram que a inibição de miR-146a aumentaram os níveis de p-EGFR, EGFR e a sinalização a jusante (Figura 10). Estes resultados suportam os efeitos inibidores de miR-146a sobre a autofosforilação do EGFR e a sinalização a jusante. Uma vez que o miR-146a foi relatado que também regulam a expressão de IRAK-1, o qual pode activar o NF-kB de sinalização [13], [34], [35], foram investigados os efeitos de miR-146a no NF-kB vias de sinalização nas as linhas celulares de NSCLC. miR-146a mímico reduzida fosforilação do NF-kB inibidor IκBα, mas não o total IκBα. Além disso, o nível de fosfo-NF-kB, o total de NF-kB e total de IRAK-1 foram também diminuiu após o miR-146a transfecção mímico (Figura 11, Figura 12), indicando que o miR-146a regula o NF-kB e a IRAK-1 sinalização.

linhagens de células NSCLC foram transfectadas com inibidor de miR-146a, mímica miR-146a, siRNA específico do EGFR e diferentes controles negativos e western blot foi testada 10 dias após a transfecção. Os anticorpos incluídos fosfo-EGFR (p-EGFR), o EGFR, P-ERK1 /2, p-AKT, p-STAT3, STAT5 e p-β-actina. M: controle simulada; C1: Controle negativo para o inibidor miRNA; C2: Controlo negativo para miRNA imitar; Inhi: inibidor de miR-146a; Mimi: miR-146a mímica; Si:. SiRNA específico do EGFR

linhagens de células NSCLC foram tratados como na Figura 4. Os anticorpos incluídos fosfo-IκBα (p-IκBα), IκBα, p-NF-kB, NF-kB e β actina. M: controle simulada; C1: Controle negativo para o inibidor miRNA; C2: Controlo negativo para miRNA imitar; Inhi: inibidor de miR-146a; Mimi: miR-146a mímica; Si:. Específicas do EGFR siRNA

linhagens de células NSCLC foram tratados como na Figura 4. Os anticorpos incluídos fosfo-IRAQUE-1 (S

376), IRAQUE-1 e β-actina. C1: Controle negativo para o inibidor miRNA; C2: Controlo negativo para miRNA imitar; Inhi: inibidor de miR-146a; Mimi: miR-146a mímica; Si:. SiRNA específico do EGFR

miR-146a mímica aumenta o efeito inibidor da proliferação celular de TKI e cetuximab

Em trabalhos anteriores que examinaram os efeitos de pentear EGFR siRNA com EGFR TKI ou cetuximab. Entre todos os agentes testados, afatinib, um inibidor da família ErbB, teve o efeito inibidor do crescimento mais forte [25]. Nós procuramos investigar como isso iria comparar com o efeito de combinar o mímico miR-146a e TKI (gefitinib, erlotinib, afatinib) ou cetuximab, utilizando o ensaio de proliferação formazan MTS colorimétricos. A inibição da proliferação de células era muito mais elevado quando imitam o miR-146a foi combinado com afatinib, em comparação com droga única ou simples imitador miR-146a em todas as linhas celulares testadas, especialmente a baixas, concentrações sub-molares de afatinib. No entanto, não é a curva de crescimento de células inteiras da proliferação foi maior do que a curva de independência Bliss, o que indicou o efeito da combinação foi aditivo (Figura 13). Os efeitos da combinação de miR-146a imitar com outros inibidores da tirosina quinase ou cetuximab foram semelhantes, mas mais fraca do que a de afatinib (dados não mostrados). Assim miR-146a mímico aumenta o efeito inibidor da proliferação celular por inibidores da tirosina quinase e cetuximab. Para verificar o aditivo ou sinérgico da combinação de natureza TKI /cetuximab com o imitador de miR-146a, um IC foi calculada [31], [32]. Isto demonstra inequivocamente que o efeito é aditivo (dados não mostrados).

MTS foi realizado como acima e foi calculada a taxa de inibição de proliferação. *

P Art 0,05, em comparação com somente agente. critério de independência Bliss foi realizada para calcular o efeito aditivo teórico. – – – – -, Êxtase independência curva, o que indica a situação teórica em que o efeito combinado da mímica miR-146a e outro agente é exactamente aditivo. •, drogas + miR-146a imitar. ▾drugs + mímica Controlo negativo. ▪ drogas sozinho. ◊miR-146a mímica sozinho (60 Nm). Os pontos de dados representam valores médios de poços em triplicado, e as barras de erro são SD

exploração inicial do significado clínico de expressão de miR-146a em casos NSCLC

A seguir, examinou o miR-146a expressão em FFPE biópsias de 101 casos de NSCLC. As biópsias foram obtidas antes de qualquer tratamento sistémico. Na série, 76 casos estavam disponíveis com os correspondentes tecidos pulmonares normais adjacentes. A expressão de miR-146a relativa foi em geral significativamente menor em tecidos NSCLC do que nos tecidos pulmonares normais (5,20 vs 14,01,

P

0,001) (Figura 14). Na série de 76 pacientes com uma amostra emparelhada, houve também uma expressão de miR-146a significativamente menor em tecidos de cancro do pulmão em comparação com o normal (5,91 vs 14,01,

P

= 0,005, Figura 14). níveis de miR-146a foram significativamente maiores (

P

= 0,001) nos casos com uma clínicos fases TNM I e II em comparação com estádios III e IV (Tabela 1, Figura 15A). Além disso, a expressão de miR-146a foi significativamente maior (

P

= 0,001) nos casos sem metástases distantes do que aqueles com metástases (Tabela 1, Figura 15B). Além disso, os 32 pacientes com maior expressão de miR-146a (maior do que o nível médio) tiveram uma sobrevida livre de progressão mais do que os pacientes com baixa expressão. tempo de sobrevida global de pacientes com alta expressão de miR-146a foi mais longa do que a de pacientes com baixa expressão (25,6 semanas em pacientes de alto miR-146a versus 4,8 semanas em pacientes de baixo miR-146a,

P

= 0,038, Figura 15C). A expressão de miR-146a não estava relacionado com outros parâmetros clínico, tais como sexo, idade, expressão da proteína EGFR, a amplificação do gene EGFR ou estado de mutação EGFR (Tabela 1).

níveis de miR-146a (normalizados para RNU6B) acessada por RT-qPCR em 101 casos de tecidos de cancro NSCLC e 76 casos de tecidos de pulmão não-cancerosas (painel a). expressão de miR-146a foi comparada nos 7 casos emparelhados. *

P

. 0,05

níveis de miR-146a acessados ​​por RT-qPCR nos estágios I e II vs estádios III e IV (Painel A), sem metástases à distância e com metástases (Painel B). Kaplan-Meier curvas de sobrevida global de acordo com o nível de miR-146a no Painel C.

Discussão

No presente trabalho temos explorado o papel de miR-146a no CPNPC humanos. Em primeiro lugar, identificaram independentemente miARN-146a como o mais forte correlação miARN com estado de activação do EGFR e de inibição de EGFR farmacológico numa tela que envolveu uma vasta gama de 425 miARNs de uma série de linhas de células NSCLC e transfectantes Ba /F3 com vários estados genómico de EGFR (dados não publicados no arquivo). Isto levou a investigação em curso para confirmar estes resultados e continuar a explorar o papel dessa miRNA em NSCLC. Funcionalmente, o miR-146a suprimiu o crescimento celular, migração celular inibida, a apoptose celular induzida e a sinalização a jusante de EGFR inibida em linhas celulares de NSCLC. Além disso, o miR-146a aumentaram a inibição da proliferação celular provocada por drogas que alvejam EGFR, incluindo TKI (gefitinib, erlotinib, e afatinib) e um anticorpo monoclonal (cetuximab). Também encontrado em amostras clínicas FFPE que a baixa expressão de miR-146a foi correlacionada com os estágios TNM clínico avançado e metástases à distância em NSCLC.