Abstract
Fundo
Vários Dados iniciais favorecem implicação do receptor de andrógeno na iniciação do câncer de próstata através do indução de vários programas de activação de genes. O objectivo do estudo foi identificar biomarcadores potenciais para o diagnóstico precoce do cancro da próstata (CaP) entre os genes regulados por andrógenos (ARG), e para avaliar a expressão comparativa destes genes na próstata normal e tecidos sensíveis-andrógenos relacionadas com a próstata normais que não fazer (ou raramente) dão origem ao câncer.
Métodos
ARG foram selecionados em células adultas não-neoplásica humanos próstata epiteliais RWPE-1 expressando estavelmente um receptor andrógeno humano exógeno, usando RNA-microarrays e validação por qRT-PCR. Expressão de genes de 48 pré-seleccionados foi quantificado em amostras de tecido (vesículas seminais, zonas de transição da próstata e cancros da próstata, hipertrofia prostática benigna obtido a partir de amostras cirúrgicas), utilizando TaqMan ® matrizes de baixa densidade. As performances de diagnóstico destes biomarcadores potenciais foram comparados ao de genes conhecidos por estarem associados com PCA (ie PCA3 e Dlx1).
Resultados e Discussão
cruzando estudos de expressão em 26 correspondida APC e amostras de próstata normal de transição de zona, e 35 combinados vesícula seminal e amostras APC, foram identificados 14 genes. Da mesma forma, 9 genes foram sobre-expresso em 15 amostras de hipertrofia benigna da próstata, em comparação com amostras de APC. No geral, foram selecionados 8 genes de interesse para avaliar as suas performances de diagnóstico em comparação com a de PCA3 e Dlx1. Entre eles, 3 genes: CRYAB, KCNMA1 e SDPR, foram sobre-expressos em todos os três tecidos de referência não-cancerosas. As áreas sob as curvas ROC destes genes atingiu os de PCA3 (0,91) e Dlx1 (0,94).
Conclusões
Foram identificados ARG com expressão reduzida em APC e com valores de diagnóstico significativas para discriminar entre tecidos prostáticos cancerosas e não cancerosas, semelhante a de PCA3. Dado o seu padrão de expressão, eles poderiam ser consideradas como potencialmente protetor contra o câncer de próstata. Além disso, eles poderiam ser complementares a genes conhecidos sobre-expressos em APC e incluídos junto com eles nas ferramentas de diagnóstico multiplex
Citation:. Altintas DM, Allioli N, Decaussin M, de Bernard S, Ruffion A, Samarut J, et ai. (2013) genes diferencialmente expressos andrógeno-reguladas em tecidos andrógeno-sensíveis revelar potenciais biomarcadores de câncer de próstata precoce. PLoS ONE 8 (6): e66278. doi: 10.1371 /journal.pone.0066278
editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Itália |
Recebido: 14 de fevereiro de 2013; Aceito: 03 de maio de 2013; Publicação: 28 de junho de 2013
Direitos de autor: © 2013 Altintas et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Liga Francesa contra o cancro no âmbito do programa “Equipe Labellisée”, pelo Instituto Nacional do Câncer (INCA) eo Nacional e Programas Regional Cancer. DA era um beneficiário de uma bolsa de doutoramento do Ministério francês da Educação Nacional, Investigação e Tecnologia (MENRT Grant). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Fundo
o câncer de próstata (PCA) é em homens o câncer mais prevalente e a segunda principal causa de morte [1]. diagnóstico atual é baseada no exame histológico da próstata biópsias de agulha-core. O aumento de PSA no soro (antigénio específico da próstata) é amplamente utilizado por médicos, embora não específico, para decidir as biópsias da próstata e a detecção do cancro da próstata [2]. Na verdade, a hipertrofia benigna da próstata (HBP) e de outras condições da próstata não-cancerosas, tais como a prostatite aguda ou crónica, pode aumentar os níveis de PSA. Isto leva a biópsias de próstata desnecessárias já que mais de 60% das biópsias sugeridas pelo teste de PSA em última análise, transformar-se negativo. Além disso, teste de PSA não diferencia clinicamente significativa de tumores indolentes, resultando em excesso de diagnósticos e às vezes overtreatment. Consequentemente, há uma necessidade de novos biomarcadores que ajudam tomada de decisão clínica sobre biópsia e tratamento inicial.
A estratégia usual para a descoberta de biomarcadores de câncer é comparar o cancro da próstata com o tecido benigno da próstata. Assim foi identificado o biomarcador PCA3 promissor (gene do cancro da próstata 3) pelo câncer comparando apresentação diferencial com amostras normais e de hiperplasia benigna da próstata [3]. tecnologias de alta capacidade, tais como análise de microarray e espectrometria de massa, têm impulsionado o campo de descoberta de biomarcadores de câncer de próstata. Desde as primeiras publicações no final dos anos 90 s e início dos 2000 s, muitos biomarcadores ou perfis “assinatura” específicas para cada estado patológico, por exemplo, normal,
contra
câncer, têm sido propostos para diagnóstico de câncer de próstata (revue em [4], [5]). Se estes novos e potenciais biomarcadores são todos clinicamente permanece relevante, no entanto, incertas uma vez que nenhum alcançar a fase de desenvolvimento do PCA3 [6].
próstata é um dos tecidos andrógeno-sensíveis. Mais especificamente, tanto no desenvolvimento embrionário de próstata e da próstata manter na idade adulta são dependentes de uma impregnação de tecido normal por androgénios. Os androgénios actuar através de um receptor específico, AR (receptor de androgénio), que pertence à superfamília de receptores nucleares. AR está envolvido no crescimento CaP [7], [8], mas também na sua iniciação [9], através da indução de vários genes [10], [11], [12], [13]. Se estes genes podem ser consideradas como potenciais marcadores para o diagnóstico precoce do cancro da próstata merece ser avaliada. Por isso, propôs uma estratégia de dois passos com a finalidade de diagnóstico do cancro da próstata descoberta biomarcador. Em primeiro lugar, a hipótese de que os potenciais biomarcadores para o diagnóstico precoce do câncer de próstata pode ser identificada entre os genes regulados por andrógenos (args). Foram selecionados ARGs em células epiteliais da próstata imortalizadas RWPE-1 expressando estavelmente AR [14], utilizando microarrays de RNA e validação por qRT-PCR. Em segundo lugar, nós avaliamos a expressão comparativa destes ARGs na próstata normal e tecidos andrógeno-sensíveis relacionadas com a próstata normais que não (ou raramente) dão origem ao câncer. Usamos amostras de vesículas seminais, zonas de transição de próstata e câncer de próstata de pacientes operados por prostatectomia radical e validadas as suas performances de diagnóstico, demonstrando a sua capacidade de discriminar entre tecidos normais da próstata, hiperplasia prostática benigna e câncer, e comparando-a com a de biomarcadores conhecidos de correspondência cancros da próstata (PCA3, Dlx1).
Métodos
análise de Transcriptoma em células RWPE-1-AR estimulada por R1881
Nós usamos a linha de células estável RWPE-1-AR que expressa constitutivamente um AR exógena, tal como descrito noutro local [14]. As células foram mantidas em meio de crescimento de queratinócitos (Invitrogen 17005-042) suplementado com RegF (factor de crescimento epitelial recombinante) e BPE (bovina extracto de pituitária) (Invitrogen 37000015), antibióticos e antimicóticos. células-AR RWPE-1 foram estimuladas com o androgénio não metabolizável, R1881 (10-9 M), no meio de crescimento privadas de BPE. Três experiências de cultura de células independentes para cada condição de tratamento (veículo ou R1881 durante 3 h e 24 h) foram realizadas por análise de microarray. O ARN total foi extraído utilizando o kit de mini-RNeasy® (74104, Qiagen). A concentração de RNA foi medida por leitura OD usando um espectrofotómetro Nanodrop.
Para verificar a resposta ao R1881 nas células estimuladas, a expressão de um painel de genes conhecidos AR alvo foi analisado por reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para cada condição. O cDNA obtido a partir de 1 ug de ARN retrostranscribed (Promega M1701) foi amplificado utilizando o estojo de PCR verde QuantiTect SYBR ® (Qiagen 204145). Primers fornecidos a partir de Qiagen:. Hs_KLK3 /PSA (QT00027713), MME (QT00048755), Hs_TMPRSS2 (QT00058156), Hs_MMP2 (QT00088396), Hs_MCM10 (QT00030338) e Hs_TPB (QT00000721) como gene housekeeping
A qualidade do RNA extraído foi avaliada usando um Bioanalyzer 2100 (tecnologias de Agilent). número de integridade do RNA de todas as amostras eram 10. A transcrição reversa, rotulagem e hibridação em Affymetrix Human 133 mais 2,0 Arrays foram realizadas pelo serviço de ProfileXpert (Bron, França) de acordo com protocolos Affymetrix ™ (Expression manual de análise técnica, de 2008, Affymetrix). Um? G de ARN total foi utilizado para a preparação de cRNA biotinilado e 15 ug de ARNc foram hibridadas. O Fluidics Station 450 Affymetrix foi usada para a lavagem e coloração. Arrays foram escaneados usando o Scanner GeneChip 3000 (Affymetrix). arquivos Affymetrix CEL foram analisados em R usando o conjunto Bioconductor de pacotes. sinais da sonda matérias eram de fundo corrigida, normalizado e resumido usando o procedimento de RMA. modelos lineares foram aplicados usando o pacote limma, a fim de identificar genes potencialmente com mudança significativa na expressão em resposta ao efeito do tempo de tratamento ou R1881 em cada duração (modelo fórmula: ~ + Duração Duração: R1881). O método Bayes empírico foi utilizado para calcular valores p moderados que foram, então, corrigido para comparações múltiplas, utilizando o procedimento de controle de Benjamini e Hochberg taxa de descoberta de falsas (FDR). Os dados de microarray foram depositados e descrito, de acordo com as directrizes Miame, em Gene Expression Omnibus sob o número de acesso GSE29232 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE29232 ).
Para avaliar se os níveis de expressão relativos de ARN de 14-regulados transcritos foram consistentes com os dados de microarray, RT-qPCR foi realizado em triplicado a partir da mesma como ARN em experimentos de microarranjos utilizando o kit de PCR verde QuantiTect SYBR® (Qiagen 204145). Os iniciadores fornecidos de Qiagen: Hs_EGFR (QT00085701), SOX2 (QT00237601), Hs_NDRG1 (QT02290232), Hs_MME (QT00048755), Hs_TFPI2 (QT00062804), Hs_CDK5R1 (QT00231644), Hs_SCNN1G (QT00063217), Hs_RHOB (QT00227409), Hs_PRDM1 (QT00060494), Hs_IL7R (QT00053634), Hs_SERPINB2 (QT00077497), Hs_PAX9 (QT00023317), Hs_FST (QT01665853), Hs_ADAMTS1 (QT00098588) e Hs_TPB (QT00000721) como gene de manutenção para normalizar os dados brutos. Correlações entre microarray e os resultados qPCR foram realizadas por meio do teste de Spearman e análise de regressão linear
Identificação de genes biomarcadores candidatos
genes candidatos potenciais foram selecionados os seguintes critérios:. 1) andrógeno-regulamentado: considerando log2 dobre-a mudança cortado valor para 1,2 eo FDR (taxa de detecção falsa) com
P Art 0,05; 2) expressos a níveis significativamente mais elevados após o tratamento (3 h e /ou 24 h de duração); 3) categorias Gene ontogenia e vias relevantes usando software Ingenuity Pathway Analysis (IPA®) (Ingenuity Systems). Um total de 36 genes alvos foram escolhidos para confirmação de expressão (diferencial) em amostras de pacientes.
Os espécimes de tecido
declaração de Ética. Protocolo de pesquisa biomédica
Não-intervencionista para o tecido amostras de conservação depois de uma cirurgia de próstata tem sido set-up no Centre Hospitalier Lyon-Sud e Comitê de Ética em Lyon (CPP Sud-Est 2) aprovado especificamente para este estudo. Assim, os doentes internados no departamento de urologia no Centre Hospitalier Lyon-Sud foram informados e deu, consentimento voluntário assinado informado antes de qualquer medida de conservação amostra de tecido e para fins de pesquisa.
As amostras de tecido.
O câncer de próstata (PCA), zona de transição da próstata (PTZ) e vesícula seminal (SV) tecidos congelados foram obtidos a partir prostatectomies radicais. A pontuação de Gleason (GS) é usada para a classificação do tecido câncer de próstata. O estadiamento do tumor patológico pTN foi determinada de acordo com a classificação UICC TNM de 2002 (6
th edição). tecidos congelados provenientes de doentes com HBP foram obtidos a partir de ressecção transuretral da próstata. A ausência de cancro em amostras BPH foi avaliada por um patologista experimentado na área das doenças da próstata. As características patológicas do cancro pacientes incluídos no estudo encontram-se resumidos na Tabela 1.
Para estudos de expressão comparativos em APC, SV e PTZ combinados amostras de tecido, que é obtido a partir dos mesmos espécimes cirúrgicos, o ausência de células de cancro em SV e PTZ foi verificado por exame histológico rigoroso dos tecidos adjacentes a essas peças reservados para extracção de ARN e congelado. Para fins de diagnóstico, foram utilizados 50 CaP amostras de tecido: GS 6 (
n = 1 |), GS 7 (3 + 4) (
n = 12
), GS 7 (4 + 3 ) (
n = 24
), GS 8 (
n = 6
) e GS 9 (
n = 7
).
extração de RNA e transcrição reversa
tecidos congelados foram armazenados em azoto líquido até extração de RNA o RNA total foi extraído a partir de tecidos homogeneizados por Trizol® (Invitrogen) e foi avaliado quanto à integridade utilizando o Bioanalyzer® 2100 (Agilent). 1 ug de ARN total foi convertido em cDNA usando a primeira cadeia de síntese de ADNc kit® (Invitrogen). O cDNA resultante foi usado imediatamente em tempo real qPCR
TLDA em tempo real qPCR
A tecnologia Applied Biosystems TaqMan (TaqMan ® matrizes de baixa densidade: TLDAs). É utilizado para a análise quantitativa da expressão do gene. O princípio do sistema de alto rendimento qPCR em tempo real baseia-se no cartão de microfluidos de 384 poços (8 portas de carga distintas, cada uma com 48 poços separadas) [15]. Cada poço 2-ul contém primers específicos, definidos pelo usuário e sondas, capazes de detectar especificamente um único gene. Cada amostra de ADNc (100 ng de cDNA equivalentes) foi adicionada a um volume igual de 2 × TaqMan Gene. Expressão mestre Mix® (Applied Biosystems) para um total de 100 ul por porta. Após mistura suave e centrifugação, a mistura foi transferida para uma porta de carregamento no cartão de TLDA. A matriz foi centrifugado duas vezes durante 1 min, cada a 1200 rpm, para distribuir as amostras a partir da porta de carga a cada poço. A placa foi então selado e a amplificação por PCR realizada utilizando um 7900HT Fast-PCR em tempo real System® (Applied Biosystems) seguindo o protocolo descrito pelo fabricante.
Neste estudo, os níveis de mRNA de 48 genes foram medidos. Cada placa tinha primer específico-18S /sonda como um controle endógeno. Além disso, HMBS, RPL13A, ACTB, TBP, e UBB foram medidos como potenciais genes de limpeza. Dois duplicatas técnicas foram realizadas para cada amostra diferente.
A análise estatística
dados em tempo real.
O ciclo limiar (Ct) foi dado automaticamente pelo SDS2.2® pacote de software (Applied Biosystems). quantidades relativas (RQ) foram determinados usando a equação: QR = 2-ΔΔCt. Todos os dados foram gerados em duplicado para cada expressão do gene por amostra. Os TaqMan de dados Cartões de matriz foram simultaneamente analisadas para expressão diferencial usando o pacote Integromics RealTime StatMiner 4.0® que integra software BioConductor R. As diferentes etapas do processo de fluxo de trabalho de análise de dados de PCR: controlo de qualidade, seleccionando o controlo endógena mais estável, normalização dos dados e quantificação relativa, foram obtidos com esta ferramenta bioinformática. Como controlos para a presença de células da próstata em amostras prostáticas, dois marcadores específicos da próstata, os membros da família da calicreína, isto é KLK2 e KLK3 /PSA, foram utilizadas para a normalização. Fold alterações na expressão de genes foram apresentados por Log10RQ (Log10RQ = 0 se não houver mudança de expressão; Log10RQ = 1, se a amostra de teste é expressa 10 vezes maior do que na amostra de calibrador; Log10RG = -1 Se a amostra de teste é expressa 10 vezes menos do que na amostra de calibrador). teste t pareado de Student foi utilizado para comparações entre amostras pareadas. O teste não paramétrico de Wilcoxon foi utilizado para comparações entre amostras não correspondido. O Benjamini e Hochberg Falso taxa de detecção foi tomado como nível de significância. A significância foi considerada como
P
. 0,01
Avaliação do desempenho diagnóstico
Receiver-operacional curvas características (ROC) foram calculados a fim de avaliar o poder diagnóstico. cada variável separada univariada pela área sob a curva (AUC) da curva ROC. Os valores para as curvas ROC foram -ΔCt normalizados utilizando a média geométrica de TBP, KLK2 e KLK3. O intervalo de confiança de 95% (95% IC) dos valores da AUC foram calculados como descrito (13). Para este estudo expressão, potenciais biomarcadores foram consideradas valiosas se AUC ≥0.9 (13). Todos esses cálculos estatísticos foram realizados usando o software STATA®11.0 (College Station, Texas).
Resultados e Discussão
andrógeno-regulados perfis de genes de expressão e identificação de potenciais biomarcadores de mRNA
Nós teve como objetivo identificar programas de activação de genes dependente de andrógeno potencialmente envolvidos nos estágios iniciais da carcinogênese de próstata. Por isso, decidiu usar um modelo de célula tão próximo quanto possível para as células da próstata normais em vez de linhas de células de câncer de próstata, nos quais eventos moleculares são susceptíveis de representar estágios finais de desenvolvimento de câncer de próstata. Utilizou-se células não-cancerosas RWPE-1 previamente obtidos por imortalização de células epiteliais prostáticas humanas adultas não neoplásico com o vírus do papiloma humano 18 [16]. Apesar de imortalização, estas células mostrou-se comportam como células da próstata quase normais: conservação do cromossomo Y, expressão normal de citoqueratinas e E-caderina, estimulação do crescimento, bem como PSA e AR expressão em resposta aos andrógenos [17], [18]. Eles também reteve a capacidade de desenvolver, particularmente em culturas de Matrigel 3D, esferóides ocos bem polarizados sofrer e, eventualmente, acinar diferenciação como resposta a factores de crescimento e como um resultado das interacções com a matriz extra-celular [17], [18], [ ,,,0],19].
Para reforçar programas de activação do gene andrógeno-dependentes, usamos estavelmente transfectadas células RWPE-1 com o gene AR do tipo selvagem [14]. As células RWPE-I-AR resultou foram fortemente andrógeno-sensível como verificado por ensaios de proliferação. Estas células foram tratadas pela não metabolizável androgénio sintético R1881 durante 3 h e 24 h. Androgénio estimulação induzida foi primeiro verificado por RT-PCR quantitativo de um painel de genes alvo AR conhecidos, incluindo KLK3 /PSA, MME (metaloelastase de macrófagos), e TMPRSS2 (dados não mostrados). cDNAs extraído de células tratadas ou não com R1881 foram então hibridizados em Affymetrix Human 133 acrescido de 2,0 matrizes.
profiling Transcriptoma identificados, usando um log2 fold-change cortado valor de 1,2, 75 genes exibindo-se-regulação e 33 genes que exibem a regulação negativa em células RWPE-1-AR tratados com R1881 durante 3 h em relação aos controles (tratada veículo), considerando o FDR (taxa de detecção falsa) com
P Art 0,05. profiling transcriptomic identificados 208 genes exibindo up-regulação e 116 genes que exibem a regulação negativa em células RWPE-1-AR tratados com R1881 durante 24 h em relação aos controles, considerando o FDR com
P
. 0,05
experiências de validação foram realizados para confirmar a precisão das medições de expressão de genes matriz em transcrições selecionados diferencialmente expressos em 3 h e /ou 24 h duração do tratamento R1881 (7-regulada e 7 regulada para baixo) usando LightCycler em tempo real qPCR : EGFR, SOX2, NDRG1, MME, TFPI2, CDK5R1, SCNN1G, RHOB, PRDM1, IL7R, SERPINB2, PAX9, FST e ADAMTS1. Os resultados confirmaram que os níveis de expressão de ARN relativos foram consistentes com os dados de microarray (Tabela S1).
Para identificar e dar prioridade entre os biomarcadores candidatos genes que se encontram a ser expresso diferencialmente após 3 h e /ou 24 h de tratamento R1881, baseamos
in silico
análises sobre características biológicas considerada a mais relevante tanto em pesquisa bibliográfica e Ingenuity Pathway Analysis (IPA®). As análises com este software retornou as seguintes informações: 1 /as funções relevantes associados com o conjunto de dados e 2 de sinalização /afetada e vias metabólicas associadas com o conjunto de dados. Além da alta fold-change no conjunto de dados microarray às 3 h e /ou 24 h de R1881 exposição, genes foram concebidos como de interesse se eles têm pelo menos uma dessas anotações funcionais ou associações de doenças no banco de dados Ingenuity Conhecimento: possibilidade de detecção na urina , bem conhecida expressão de tecido e, em particular, a expressão diferencial em linhas celulares de cancro da próstata, em tecidos da próstata benigna e /ou no cancro da próstata, e /ou forte associação com os processos carcinogênicas. Nós também favoreceu genes regulados positivamente para os sub-regulada em uma tentativa de facilitar o uso potencial futuro na prática clínica. Trinta e seis genes combinados estes critérios (Tabela 2) e foram utilizados para um estudo mais aprofundado.
RT-PCR quantitativo análise dos tecidos da próstata combinados cancerosos e não cancerosos humanos
Para investigar mais os níveis de andrógeno genes regulados identificados por análise de microarray de expressão, a análise quantitativa de RT-PCR foi realizada nos alvos seleccionados utilizando zona CaP humano e da próstata transição (PTZ) tecidos correspondentes. PTZ foi escolhido porque é sabido raramente para dar origem a cancro da próstata [20]. Nosso objetivo foi identificar biomarcadores que podem distinguir entre tecidos prostáticos cancerosos e não cancerosos. Nós escolhemos grande escala RT-PCR quantificação RNA em arrays de baixa densidade TaqMan ® (TLDAs; Applied Biosystems) que permitem, por exemplo, análises simultâneas de até 48 alvos em cartões personalizados. RT-PCR quantitativa foi escolhido como uma base para comparação porque ele permite a quantificação de ARNm, um processo anteriormente utilizado para avaliar a expressão tecidual [21], [22], [23], [24], [25], [26] e urinário montantes [22] de PCA3 (gene do cancro da próstata 3), um gene que tencionava utilizar como um gene de controlo positivo. PCA3 está de facto agora reconhecida como um valioso marcador biológico de cancro da próstata (revista em [27], [28]) e tem sido mostrado para ser expresso especificamente em até 95% de CaP [3], [29]. PCA3 foi, portanto, utilizada como um controlo positivo, reflectindo painel expressão específica PCa-. TMPRSS2 [30] e Dlx1 [31], [32] são também potenciais biomarcadores APC, como revelado pelo exame dos dados de microarray utilizando a base de dados Oncomine, e a sua expressão foi avaliada de forma semelhante como controlos positivos. Além disso, avaliou-se a expressão de genes de manutenção 6 potenciais: 18S, ACTB, HMBS, RPL13A, TBP, e UBB, bem como 2 genes considerados como genes específicos da próstata: KLK2 e KLK3 /PSA. Como um marcador global dos tecidos andrógeno-sensíveis (próstata e vesículas seminais), que também selecionou gene AR para análise (Tabela 2).
Se APC e PTZ tecidos expressam quantidades de ARN semelhantes é desconhecida. A normalização por um gene housekeeping foi, portanto, justifica. Relatórios recentes indicam que os genes de limpeza pode, de facto, apresentam sérias diferenças entre tecidos, linhas celulares ou amostras clínicas [33]. Por isso, primeiro tentaram determinar quais genes housekeeping potencial foram expressos de forma estável sob as condições diferentes entre os 6 nós escolhemos. TBP foi encontrado como o controlo endógena mais estável utilizando o algoritmo NormFinder do pacote StatMiner® e foi utilizado como o gene de normalização nas seguintes partes do estudo. Os genes específicos da próstata e KLK2 KLK3 /PSA também divulgados estabilidade clara expressão e foram utilizadas em conjunto com TBP como controle endógeno (média geométrica).
em comparação expressão de todos os genes selecionados em 26 combinado PTZ próstata normais e tecidos APC, obtido a partir de amostras de prostatectomia radical. Por conseguinte, 26 genes foram consideradas significativamente (
P
0,01) sobre-expresso na zona de transição da próstata normal em comparação com CaP (Figura 1A e Figura S1). Ingenuity Pathway Analysis mostrou que 17 e 21 desses 26 genes pertencem a 2 funções biológicas significativamente representados: movimento celular (migração de células, em particular) e câncer (carcinoma epitelial, em particular), respectivamente. Por outro lado, apenas genes de PCA3 e Dlx1 foram determinados a ter um nível mais elevado (mais de 50 e 60 vezes, respectivamente), em tecidos de CaP em comparação com os tecidos normais correspondentes (PTZ
P
0,01) (figura 1A). Vale a pena notar que ACTB (codificação de beta-actina), geralmente considerado como um potencial gene de manutenção, também foi encontrado para ser sobre-expresso em PTZ. Na verdade, ACTB é regulado por andrógeno [34], [35] e tem relatado anteriormente a ser diferencialmente expressos entre os tecidos cancerosos e não cancerosos da próstata [36]
Eixo Y:. Log10 de RQ (relativo quantidades); Eixo X: genes cuja expressão foi estatisticamente significativamente diferente entre:. A) 26 correspondida normais zona de transição da próstata e amostras de câncer de próstata B) amostras de câncer de 27 de próstata e 15 amostras de hiperplasia prostática benigna C) 35 amostras de vesícula e câncer de próstata seminais combinados
hipertrofia benigna da próstata (HBP) é um modelo interessante para o qual a comparação com PCA é pertinente. Estas duas condições patológicas, de fato compartilhar vários pontos, incluindo o ambiente específica local (abastecimento de mesmo sangue e exposição a mitógenos), andrógeno-sensibilidade e proliferação celular descontrolada. Em contraste com CaP, HBP tem origem a partir de PTZ e pensa-se não ser a fonte de transformação maligna. Expressão dos genes seleccionados foi, por conseguinte, em comparação nas 26 amostras de CaP previamente testados e em 15 amostras BPH não relacionados, em que a ausência de células cancerosas foi verificado por um perito no campo patologista prostática patologia. Foram utilizados os mesmos 3 genes de normalização (TBP, KLK2 e KLK3 /PSA), que provou ser estável de acordo com algoritmo NormFinder. Deste modo, foram identificados genes significativamente 9 (
P
0,01) sobre-expresso em HPB, em comparação com CaP (Figura 1B e Figura S2): AR, AUTS2, CDK5R1, CRYAB, Foxa2, KCNMA1, MME, SCEL, e SDPR. CDK5R1 (e somente este gene) também foi encontrada para ser sobre-expresso em tecidos de BPH quando comparando a sua expressão em próstata normal de PTZ. Ele codifica o chamado proteína p35, o qual actua como um activador essencial de CDK5, uma forte regulador de migração neuronal. p35 A proteína é fracamente expressa em amostras de tecido APC e provou estar envolvido em apoptose de células de próstata [37]. Para o melhor de nosso conhecimento, expressão específica no BPH nunca foi relatado. Cinco genes que foram identificados como sendo sobre-expresso em CaP em comparação com HBP: ALCAM, CLDN7, Dlx1, PCA3 e RASD1 (Figura 1B). O gene de PCA3, altamente específico para as células de cancro da próstata, tem sido relatada a ser superexpresso 66-100 vezes no cancro da próstata
relação
próstata normal e 140 vezes no cancro da próstata
relação
BPH [ ,,,0],3], [21]. Em nosso estudo, observou-se uma sobre-expressão forte em CaP 50-210 vezes, em comparação com o de próstata normal e BPH, respectivamente. Dlx1 mostrou o mesmo padrão de expressão, como anteriormente observado [31]. ALCAM CLDN7 e ambos codificam proteínas localizada nas junções intercelulares de epitélios diverso e têm sido sugeridas como e sobre-expresso em CaP [38], [39] regulada por androgénio. RasD1 foi inicialmente descrita como uma proteína relacionadas com ras dexametasona-indutível e potencial ator na prevenção do crescimento celular aberrante em diversas linhas de células [40]. De acordo com Ingenuity Pathway Analysis®, entre os 14 genes, assim, encontrados a ser diferencialmente expressos em câncer BPH e próstata, todos estavam envolvidos em uma representados significativamente rede funcional – o crescimento e proliferação celular – exceto PCA3 (pouco se sabe sobre sua função, mas PCA3 no controlo de sobrevivência celular de APC, em parte através de modular a sinalização de AR [41]) e CDK5R1 (em vez envolvido, juntamente com 8 outros genes, em uma função biológica significativamente representado:. a morte celular e sobrevivência)
quantitativa análise de RT-PCR de próstata cancerosa humana e vesículas seminais combinado tecidos
Os estudos de expressão comparativa acima permitiu identificar genes sobre-expressos em tecidos da próstata não canceroso em comparação com câncer de próstata. Apesar do seu potencial valor de diagnóstico, esses genes podem também ser de importância como marcadores putativos de processos de protecção contra a transformação do cancro. Sua expressão elevada em BPH e PTZ normal poderia estar relacionada com a incidência fraca ou nula de câncer nestes tecidos, enquanto a sua fraca expressão na próstata pode permitir a iniciação do câncer com grande frequência. Tal mecanismo foi recentemente sugerido noutro tecido relacionada com a próstata: vesícula seminal [42]. Os autores utilizaram uma estratégia 2-step, seleccionando primeiro genes com níveis de expressão significativamente mais elevados em vesículas seminais, em vez de na próstata normal e, por outro, atravessando esta lista com genes identificados em outros lugares, porque sua expressão foi silenciado em CaP por metilação do DNA promotor. Por conseguinte, foram identificados oito genes de interesse [42]. O presente estudo é consistente com este publicada uma em que também usou uma estratégia 2-passo que nos permitiu selecionar com sucesso genes regulados por andrógenos candidatos cuja expressão foi medida em amostras de APC e em comparação com referência tecidos da próstata conhecidos para dar raramente ou nunca ascensão ao câncer, apesar de sua origem embriológica comum e exposição cancerígeno. Da mesma forma, sabe-se que, apesar de recursos partilhados em comum pela próstata e as vesículas seminais, incluindo o crescimento e função especialmente andrógeno-dependente, a incidência de cancro das vesículas seminais e glândulas da próstata é notavelmente diferente [42]. Importante, a base de esta disparidade pode ser relacionada com os mecanismos subjacentes a carcinogénese da próstata [42]. Adição de tecidos de vesículas seminais normais foi considerado no presente estudo, para reforçar a expressão de comparações entre o câncer de próstata e um tecido benigno de referência, altamente protegido contra a transformação câncer.
Nós expressão do gene, portanto, avaliada em 35 correspondida vesícula seminal e CaP tecidos que utilizam os mesmos genes seleccionados (Tabela 2). A falta de envolvimento vesícula seminal por câncer de próstata foi cuidadosamente patologicamente verificada antes da sua utilização no estudo. TBP foi encontrado como o controlo endógena mais estável utilizando o algoritmo NormFinder do pacote StatMiner® e foi utilizado como o gene de normalização. Como esperado, os genes KLK2 e KLK3 específicos da próstata foram underexpressed na vesícula seminal, em comparação com o tecido da próstata (
P
0,01). Dez outros genes também foram significativamente sobre-expresso em CaP em comparação com a vesícula seminal: ALCAM, LOX, BNIP3, CLDN8, AQP3, Foxa2, e NDRG1, bem como o esperado TMPRSS2, Dlx1 e PCA3 (Figura 1C e Figura S3). Em contraste, 18 genes foram encontrados para ser significativamente sobre-expressos em vesícula seminal em comparação com PCA: CRYAB, KCNMA1, AKR1C1 /2, TFP12, SDPR, CD24L4, SERPINB1, FLRT3, DACT1, SCNN1G, FST, RHOB, SGK1, LAMA3, AKR1C3 , SEPP1, RGS2 e ACTB (
P Art 0,01).