Sumário

A inflamação desempenha um papel direto no câncer colorretal (CRC) de progressão; No entanto, os mecanismos moleculares responsáveis ​​para este efeito não são claros. A inflamação induzida por ciclo-oxigenase 2 (COX-2) da enzima necessária para a produção de prostaglandina E2 (PGE

2), pode promover o cancro colo-rectal, diminuindo a expressão do gene supressor de tumor Programmed Cell Death 4 (PDCD4). Como PDCD4 também é um alvo directo do oncogene microARN-21 (miR-21) foi investigada a relação entre o inibidor de COX-2 e miR-21 vias na progressão do cancro colo-rectal. Gene perfil de expressão no tumor e mucosa normal emparelhado a partir de 45 pacientes de CRC demonstraram que a sobre-regulação de tecido em tumor de COX-2 e miR-21 correlaciona-se com a fase pior Dukes ‘. Em estudos in vitro em células de adenocarcinoma do cólon revelou que o tratamento com inibidores selectivos da COX-2 inibidor NS398 diminuiu significativamente o miR-21 níveis (p = 0,0067) e o aumento dos níveis de proteína PDCD4 (p 0,001), enquanto o tratamento com PGE

2 para cima regulada miR-21 de expressão (p = 0,019) e a proteína regulada negativamente PDCD4 (p 0,05). Estes resultados indicam que o miR-21 é uma componente da via de inflamação de COX-2 e que esta via promove agravamento da fase da doença no cancro colo-rectal através da indução de acumulação de PGE

2 e a expressão crescente de miR-21 com a consequente regulação negativa da tumor gene supressor PDCD4

Citation:. Peacock O, Lee AC, Cameron F, Tarbox R, Vafadar-Isfahani N, Tufarelli C, et al. (2014) Inflamação e miR-21 Pathways Funcionalmente Interact de regular negativamente PDCD4 no câncer colorretal. PLoS ONE 9 (10): e110267. doi: 10.1371 /journal.pone.0110267

editor: Kalpana Ghoshal, The Ohio State University, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de julho de 2014; Aceito: 10 de setembro de 2014; Publicação: 13 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Peacock et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e suas Informações de Apoio

Financiamento:. O trabalho foi apoiado por uma doação do Fundo de Câncer Colorretal Derby. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal é a terceira causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. Aproximadamente metade de todos os pacientes diagnosticados com câncer colorretal por fim a morte da condição [2]. A taxa de sobrevivência de cinco anos aumentou para cerca de 50-55%, o que é atribuído principalmente a um diagnóstico precoce e melhor adaptação dos tratamentos [3]. A morte por cancro colo-rectal pode ser prevenida pela detecção de doença fase inicial, mas, infelizmente, é frequentemente detectada em fase avançada quando é pior prognóstico [4]. O prognóstico em pacientes com câncer colorretal está associada com o estágio da doença no momento do diagnóstico.

O “gatilho” exata para o desenvolvimento de cancro colorectal é ainda desconhecido. Em 1990, foi proposta uma série de etapas morfológicas conhecidas como a sequência normal mucosa-adenoma-adenocarcinoma no cancro colorectal devido a alterações genéticas [5]. No entanto, muitos acontecimentos genéticos levar ao desenvolvimento de cancro colorectal esporádica; nenhum evento ocorre em todos os tipos de câncer e, portanto, sem um padrão único é aplicável a cada tumor [6]. Portanto, a compreensão eventos genéticos específicos que ocorrem em carcinogênese colorretal pode ter implicações significativas para diagnóstico, prognóstico e potencial terapia genética no futuro.

Tem havido um recente ressurgimento do interesse no nexo de causalidade entre a inflamação e câncer. Estudos epidemiológicos mostraram que a inflamação crónica predispõe indivíduos para vários tipos de cancro [7]. Estima-se que 15% a 20% de todas as mortes por cancro em todo o mundo estão ligados com infecções crónicas subjacentes e as respostas inflamatórias dentro de tais indivíduos [7]. Há evidências de estudos com animais e observações em seres humanos que uma aspirina por dia pode ser eficaz na prevenção de vários cancros comuns [8], [9]. Isto foi confirmado recentemente em estudos de acompanhamento de pacientes recrutados originalmente para estudos randomizados de aspirina diariamente versus controle na prevenção de eventos vasculares [10] – [12]. Nestes ensaios, a alocação à aspirina resultou em uma redução de 40% nas mortes por câncer a partir de 5 anos em diante [11] e uma redução sustentada da morte relacionada ao câncer em 20 anos de acompanhamento [10], [12]. Os estudos de observação, também têm demonstrado que o uso de aspirina está associado com a redução da metástase distante e recorrência em adenocarcinomas comuns [13] -. [15], sugerindo que a inflamação pode desempenhar um papel na progressão, assim como no desenvolvimento de cancro

uma das possíveis razões para os efeitos preventivos da aspirina quimio observados no cancro colo-rectal é a sua capacidade para reduzir o desenvolvimento do tumor por inibição da ciclooxigenase 2 (COX-2) [16]. Existem evidências crescentes de ligando a enzima pró-inflamatória da COX-2 com o desenvolvimento e progressão do cancro colo-rectal. A COX-2 é induzida no epitélio do cólon em doença activa inflamatória do intestino (IBD) [17] e os seus resultados sobre-regulação dos níveis elevados de prostaglandina (PG), em particular, a PGE

2 que é um mediador a jusante da COX-2 e promove muitas vias cancerígenos, incluindo a proliferação celular, inibição da apoptose e da angiogénese [18]. Isso contribui para o processo inflamatório crônico orquestrar um microambiente-sustentável tumor, ligando mais inflamação com a carcinogênese.

A ligação mecânica entre inflamação e câncer ainda não é totalmente clara. A evidência crescente sugere que as micro-ARN (miARNs) estão envolvidos na regulação de processos inflamatórios e são desreguladas em condições inflamatórias [19], incluindo a colite ulcerativa [20]. Portanto miARNs desregulação representa um mecanismo molecular potencial de vias inflamatórias para mediar o desenvolvimento e progressão de cancro [21]. Em particular, os níveis de expressão de miR-21 estão aumentadas em inflamação activa na colite ulcerosa, o que pode ser associada com o risco aumentado de desenvolvimento do cancro com esta condição [22]. -Regulação de miR-21 também foi relatado em outros estados inflamadas incluindo inflamação alérgica das vias aéreas [23], as condições inflamatórias da pele [19] e câncer gástrico

Helicobacter pylori

associados [24]. miR-21 foi recentemente demonstrado ser um oncogene genuíno no linfoma de células pré-B [25] e verificou-se ser sobre-expresso na maioria dos tipos de tumores [26]. miR-21 é um estimulador potente do tecido e invasão vascular no cancro colo-rectal e estes efeitos parecem em parte mediada pela sua capacidade para evitar a tradução de um dos genes alvo de miR-21, a morte celular programada 4 (PDCD4) [27]. Mais recentemente, um estudo mostrou também significativa a sub-regulação de PDCD4 na DII activa em comparação com inactiva DII, que também se correlacionou com a sobre-regulação de miR-21 [28], apoiando ainda mais a ligação entre a inflamação, o miR-21 e carcinogénese.

o nosso objectivo foi o de investigar se uma interacção funcional existe entre a COX-2 (enzima pró-inflamatória com um aumento da expressão em CRC) e miR-21 (mIR oncogénica sobre-expresso em CRC) vias que levam à regulação negativa do tumor supressor PDCD4 no câncer colorretal não associadas com doença inflamatória crónica anterior.

Materiais e Métodos

os tecidos humanos

Este estudo recebeu aprovação ética do Comitê de Ética em Pesquisa da Derbyshire para a recolha de tecidos e cancro colorectal combinado mucosa normal de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica de câncer colorretal entre agosto e dezembro de 2010, no Derby Hospital Real, Derby, Reino Unido.

Todos os pacientes diagnosticados com câncer colorretal foram discutidas no Derby Hospital Real colorectal Reunião da Equipa Multidisciplinar após estadiamento radiológico, e aqueles considerados adequados para ressecção com intenção curativa foram elegíveis para inclusão. consentimento informado por escrito foi tomada e pacientes incapazes ou não dispostos a fornecer o consentimento informado foram excluídos do estudo, assim como aqueles a retirada do consentimento em qualquer fase.

Cultura de Células

A linha de células HCA-7 foi obtido a partir da coleção de Protecção da Saúde Agência Cultura (HPACC, Porton Down, UK). As células foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Meios (DMEM) (GIBCO, Paisley, UK) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido), L-glutamina 2mM (Sigma-Aldrich, Poole, UK), penicilina ( 50 unidades /ml) e estreptomicina (50 ug /mL) (Sigma-Aldrich). As células foram cultivadas em 75cm

3 frascos ventilados (TSZ científicos, Framingham, MA, EUA) em incubadoras humidificadas a 37 ° C com 5% de CO

2 (Sanyo, Osaka, Japão).

Linha celular e transfecções tratamentos

As células foram semeadas a 500000 células /cavidade em uma placa de 6 poços e incubadas a 37 ° C com 5% de CO

2 até atingirem 70% de confluência.

Para estudos de miR-21 de inibição, as células foram transfectadas com o miR-21 inibidor (100 nM) ou um negativo mexidos controlo (100 nM) (miRIDIAN, Dharmacon Lafayette, CO, EUA), utilizando Dharmafect 2 lípido reagente de transfecção (Dharmacon Lafayette, CO, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

para a inibição de COX-2, as células foram tratadas com meio isento de soro que contém o controlo (0,1% de DMSO) ou 100 uM NS398 (inibidor selectivo de Cox-2, Cayman Chemical, Michigan , EUA) durante 72 horas. Por Prostaglandina E tratamento

2 (PGE

2), as células foram cultivadas 24 horas com meio isento de soro contendo veículo de DMSO por si só ou 1 uM de PGE

2, de modo que a concentração final de DMSO em ambas as condições foi a mesma (0,1%). Para combinada miR-21 e inibição de PGE

2 tratamento, PGE

2 foi adicionado à cultura de 48 horas após a transfecção o miR-21 inibidor e as células foram cultivadas durante mais 24 horas.

análises de ARN

extracção de RNA total foi realizada utilizando o Reagente TRI seguindo o protocolo do fabricante (Sigma-Aldrich) e quantificado usando um espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, dE, EUA).

Para o miR -21 estudos, um total de 6 ng de ARN total foi usada para realizar a transcrição reversa miR-21 e controlo RNU44 em cDNA, seguindo o protocolo de miARN TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), utilizando iniciadores hairpin dirigidos para miR-21 e RNU44 como controlo num termociclador (GeneAmp PCR 9700 Sistema, Applied Biosystems) durante 30 min a 16 ° C, 30 min a 42 ° C, 5 min a 85 ° C. reacção quantitativa de polimerase em cadeia em tempo real foi então realizada utilizando miARNs ensaios TaqMan sonda específica (miR-21, ID 000397; RNU44, ID 001094; Applied Biosystems) num termociclador Chromo4 (Bio-Rad Laboratories Ltd, Hemel Hempstead, UK). miR-21 níveis de expressão foram normalizados para RNU44 e calculada utilizando a 2

-ΔΔCt método [29] usando RNA de cólon normal, disponível comercialmente como um calibrador.

Para

COX-2 Comprar e

PDCD4

analisa, 30 ng de ARN total foi convertido em ADNc com hexâmeros aleatórios utilizando o ADNc de alta capacidade TaqMan protocolo de transcrição inversa (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). PCRs em tempo real foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante em um Chromo4 cycler tempo real (Bio-Rad Laboratories Ltd) usando comercialmente disponíveis 20x ensaios TaqMan (Applied Biosystems) para

PDCD4

(Hs00377253_m1) e

COX 2

(PTGS2 – Hs00153133_m1), juntamente com os genes de controle

GAPDH

(Hs02258991_g1),

PGK1

(Hs00943178_g1) e

HPRT

(Hs01003267_m1). Para os experimentos em linhas celulares, a quantificação foi realizada de acordo com as diretrizes MIQE (Informações mínima para Publicação de experiências quantitativas Real-Time PCR) [30] relativamente à média geométrica dos genes de referência

GAPDH

,

PGK1

,

HPRT

usando o software Genex (Análise MultiD; Göteborg, Suécia). Devido à quantidade da amostra limitada, na expressão de tecidos humanos foi quantificado relativamente a

sozinho GAPDH

como descrito acima para miR-21 análises.

Protein analisa

extracções de proteínas e quantificação foram realizados como previamente descrito [31]. Western blot foi realizada utilizando o anticorpo anti-actina beta controlo de carga (1:1000 diluição; Abcam, Cambridge, Reino Unido) em combinação com PDCD4 anti-anticorpo (diluição 1:500; Sigma-Aldrich) ou anti-COX-2 (1 :1000 diluição; Abcam). anticorpo anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina foi usado como anticorpo secundário (diluição 1:30,000; DAKO, Ely, RU) para a detecção da ligação do anticorpo primário. Os imunocomplexos foram visualizados por quimioluminescência melhorada usando o kit ECL (Bio-Rad) de acordo com o protocolo do fabricante. O sistema chemidoc foi usado para capturar imagens e quantidade Um software (Bio-Rad) foi utilizado para a quantificação de intensidades das bandas.

Análise Elisa

PGE

2 níveis foram medidos no meios de HCA-7 células tratadas e não tratadas utilizando o kit de detecção de PGE

2 ELISA (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan USA) de acordo com as instruções do fabricante. As placas foram lidas com um photocytometer placa a 450 nm (Wallac 1420 Victor; Perkin-Elmer, Waltham, MA, EUA).

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada utilizando GraphPad Prism versão 5.03 ( GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). O teste de Kolmogorov-Smirnov demonstrou todos os dados da amostra de tecido a ser não-paramétrico e todos os dados da linha celular a ser paramétrico. Assim, os dados do paciente é expressa na forma de mediana e gama, enquanto que dados de linha de células é expressa como a média e o erro padrão da média. O Wilcoxon signed-rank (dados pareados); o teste de Mann-Whitney U (não emparelhado) e o teste de Kruskall-Wallis foram utilizados para uma análise comparativa dos dados do doente. O teste t pareado (dados pareados); o t-teste (não pareado) e do teste de ANOVA foram utilizados para a análise comparativa dos dados da linha celular.

A significância estatística foi determinada a p≤0.05 para os dados tanto da linha de células do paciente e.

Resultados

aumento de miR-21 refere-se diretamente ao aumento dos níveis de COX-2 mRNA em pacientes CRC

Realizamos nosso estudo sobre o tecido de câncer colorretal primário e mucosa normal emparelhado coletados entre agosto e dezembro de 2010 a partir de 45 pacientes eletivos com casos esporádicos de CRC. Um banco de dados prospectivamente mantida foi preenchida com dados demográficos do paciente, terapias neoadjuvante e características do tumor. A histopatologia do tumor foi classificado de acordo com o conjunto de dados mínimo nacional para o cancro colorectal desenhado pelo Royal College of Pathologists, Reino Unido [32]. Nenhum paciente foi excluído ou se tinha retirado do estudo e nenhum tinha doença benigna. A idade média foi de 69 (intervalo 51-88) anos e a maioria eram pacientes do sexo masculino. Quatro pacientes com câncer retal que receberam quimio-radioterapia neo-adjuvante também foram incluídos com base em estudos anteriores que demonstram que a expressão de miR-21 é equivalente entre o tecido irradiado e não irradiado [33]. Todos os pacientes tiveram uma ressecção completa e histologia confirmou todos os tumores eram adenocarcinomas. (Tabela S1 e S2 em S1 Arquivo)

Usando por real time RT-PCR, estudamos a expressão de

COX-2 Comprar e miR-21 em tecidos tumorais, em comparação com mucosa normal em nossa coorte de pacientes de CRC. A expressão relativa de miR-21 foi significativamente regulada para cima no tecido CRC em comparação com a mucosa normal combinado (p 0,0001, Wilcoxon pareados por pares assinados teste de classificação; A Fig. 1A). Além disso, os níveis de expressão de miR-21 estavam correlacionados com as características clínico-patológicos comummente utilizados para CRC (Tabela 1). maior expressão de miR-21 em tecidos de tumor significativamente correlacionada com a fase de um Dukes pior ‘(p 0,0001, teste de Kruskall-Wallis; A Fig. 1B), metástase de nódulo linfático (P 0,0001, teste de Mann-Whitney U; A Fig. 1C) , e profundidade de invasão tumoral (fase pt; p 0,0001, teste de Mann-Whitney U; A Fig. 1D). Estes resultados estão de acordo com os relatórios anteriores [34], [35], e confirmar que miR-21 é regulada para cima no CRC, com o aumento dos níveis de expressão correlacionando-se com o aumento da gravidade da doença.

gráficos de barras indicam Coluna a mediana e suiças demonstrar a IQR de miR-21 de expressão. Note-se que aumento significativo na expressão de miR-21 é observada em tumores, e isso aumenta ainda mais com o agravamento etapa, o envolvimento do linfonodo e profundidade de invasão. A significância estatística foi calculada utilizando o ensaio assinado-rank de Wilcoxon em A, o teste de Kruskall-Wallis em B, e o teste de Mann-Whitney U em C e D.

A expressão relativa de

PDCD4

foi significativamente regulada para baixo em tecidos CRC comparação com mucosa normal combinado (p 0,0001, Wilcoxon-correspondida pares assinado teste de classificação; a Fig. 2A). No entanto, não houve correlação entre o

expressão PDCD4

em tecidos tumorais e estágio dos Duques, com expressão no palco Dukes’A sendo já diminuiu significativamente em comparação com o tecido normal e nenhuma outra diminuição observada em estágios mais avançados ( A Fig. 2B). É pouco provável que a regulação negativa observada de

PDCD4

ao nível de ARN é causada por miR-21, dado que esta micro-ARN actua para prevenir a tradução do mRNA PDCD4 em vez de induzir a sua degradação ou repressão da transcrição [27]. Dado que todos os pacientes estudados tumores malignos realizada com uma fase Dukes afectadas », os dados sugerem que, durante a progressão da malignidade quantidades aumento de miR-21 conduzir à inibição da tradução do já diminuição dos níveis de

PDCD4

ARNm. restrições de Ética nos impediu de analisar os níveis de proteína PDCD4 nestes pacientes para confirmar esta hipótese e nós recorreu a

in vitro

estudos para obter insights mecanicistas (ver secção seguinte).

expressão relativa combinada de PDCD4 e COX-2 foi analisado no tumor primário contra combinados mucosa normal adjacente (n = 45; a e C, respectivamente) tecidos, e em condições normais (N) e de tumor (T) a partir de Dukes a (n = 9), B (n = 23) e C (n = 13) as fases (B e D, respectivamente). O gráfico de barras coluna indica a mediana e os bigodes demonstrar a IQR da expressão de mRNA. A significância estatística foi calculada utilizando o ensaio assinado-rank de Wilcoxon em A e C; o teste de Kruskall-Wallis em B e D. Note-se que

PDCD4

é regulada negativamente em relação tumor normal, mas não há diferenças são vistos na expressão restante em tumores de diferentes fases Dukes ‘. Em contraste

COX-2

níveis aumentam no tumor e com o estágio da doença.

Curiosamente, a expressão relativa de

COX-2

mRNA foi significativamente regulada para cima no tecidos de tumor em comparação com a sua mucosa combinado normal (p 0,0001, Wilcoxon pareados por pares Signed Rank teste; a Fig. 2C). Além disso, à semelhança do que foi observado com miR-21, a expressão relativa de

COX-2

mRNA em tecidos tumorais significativamente correlacionados com o estágio de Dukes pior “(p 0,0001, teste de Kruskall-Wallis; A Fig. 2D) . Dado que miR-21 e inflamação ambos foram mostrados para diminuir os níveis de proteína PDCD4 [27], [36], uma possível interpretação destes resultados é que o aumento no miR-21 e

COX-2

pode ser funcionalmente relacionados e que poderia levar a regulação negativa da PDCD4 através de uma via comum.

HCA-7 células são um sistema adequado para analisar a relação entre miR-21 e COX-2 superexpressão no CRC

para investigar ainda mais o potencial de uma relação funcional entre COX-2 e miR-21 na regulação negativa dos PDCD4 no CRC que recorreram a um

in vitro

sistema de cultura celular. Nós escolhemos a linha de células de adenocarcinoma do cólon humano HCA-7 isolado do tumor B um Dukes ‘[37], pois tem altos níveis endógenos de COX-2 [38] e após o tratamento com o inibidor de COX-2 NS398 aumenta a expressão de

PDCD4

[39]. A fim de determinar se HCA-7 células são de um bom sistema para estudar a relação funcional entre o miR-21 e COX-2 vias, primeiro necessários para determinar se o miR-21 é expresso e é responsável pela

PDCD4

downregulation nestas células. Para atingir estes nós utilizado RT-PCR para estudar os níveis de miR-21 em HCA-7 células não tratadas ou nas células tratadas com 100 nM de um inibidor ou precipitação controlo miR-21 com base no trabalho publicado que mostra que esta concentração não é citotóxico e eficaz em estudos inibitórios [40]

Descobrimos que o miR-21 é expressa a níveis elevados em HCA-7 células e estes níveis não são afectados pelo tratamento com embaralhamentos pequenos RNAs mas são significativamente reduzida (p . 0.0001 teste-t não emparelhado), após 72 horas de tratamento com uma miR-21 pequenos ARN inibidor específico (Fig. 3A). Não houve diferenças significativas nos níveis de ARNm PDCD4 foram observados por RT-PCR quantitativo em qualquer das condições de tratamento (Figura 3B.); Em contraste, foi observado um aumento significativo (p = 0,002, teste t não emparelhado) em PDCD4 ao nível da proteína por Western Blot nas células miR-21 inibidor tratados em comparação com células de controlo não tratadas ou tratadas de encriptação. Estes resultados são consistentes com o miR-21 actua para inibir a tradução de ARNm PDCD4 em vez de dirigir a sua degradação e confirmar que o miR-21 desempenha um papel na regulação negativa em PDCD4 HCA-7 células. Portanto, tanto os COX-2 e miR-21 vias de contribuir para a regulação negativa da PDCD4 no HCA-7 células, tornando-as um sistema adequado para estudar se existe uma relação funcional entre as duas vias.

Após 72 horas de transfecção diminuição significativa em níveis de miR-21 são vistos apenas em células transfectadas com o miR-21 inibidor de (a).

PDCD4

níveis de mRNA não foram afetados pela inibição de miR-21 (B). A análise de Western blot de PDCD4 (painel superior C durante uma mancha representativa) revela um aumento significativo nos níveis de proteína em células transfectadas com o inibidor, em comparação com células não tratadas ou embaralhar de controlo tratados, quando quantificados relativamente a proteína beta actina (bact) como um carregamento controle (painel inferior C). O gráfico de barras indica a média da coluna e os bigodes demonstrar o erro padrão da média (SEM). A significância estatística foi calculada através do teste t desemparelhado. As experiências foram repetidas três vezes e foram analisadas em duplicado. Se não for tratada = cultura de células em meios de comunicação; Scramble = células transfectadas com inibidores de RNA corrida; miR-21 = inibidor de células tratadas com o inibidor de ARN de miR-21.

Relação entre o miR-21 e COX-2 na regulação negativa da PDCD4 em HCA-7 células

Para investigar a interacção funcional entre o miR-21 e COX-2 vias, analisou-se primeiro o ARNm de COX-2 e os níveis de proteína em HCA-7 células após 72 horas de tratamento com o inibidor de miR-21 em comparação com o controlo precipitação e células não tratadas. Não se observou qualquer diferença em COX-2 nem no ARNm ou nos níveis de proteína (p = 0,62 e p = 0,83, respectivamente, teste t não emparelhado), mostrando que a COX-2 não é um alvo de miR-21 (Fig. S1 em S1 ficheiro).

próxima células tratadas com 100 uM NS398, um inibidor específico da COX-2 relatada como sendo não citotóxico e eficaz a esta concentração em cultura de células [41], ou com veículo HCA-7 sozinho (0,1% DMSO). COX-2 desempenha um papel crítico durante a inflamação nas etapas iniciais da conversão de ácido araquidónico em prostaglandinas, incluindo prostaglandina E, (PGE

2) e a sobre-regulação de COX-2 no cancro colo-rectal foi mostrado para associar com aumento acentuado na produção de PGE

2 [42]. Usando Elisa para medir os níveis de PGE

2 encontramos uma diminuição significativa (p = 0,006, teste t não pareado) nos meios de células tratadas com NS398 comparação com células não tratadas ou células tratadas com veículo sozinho, consistente com a inibição da COX 2 a actividade catalítica (Fig. S2 no ficheiro S1).

Tendo estabelecido a eficácia do tratamento que, em seguida, mediu a expressão relativa de miR-21 e foi possível detectar uma diminuição significativa na miR-21 a seguir ao tratamento durante 72 NS398 hora (p 0,01, teste t não emparelhado, A Fig. 4A). Em contraste, o tratamento de HCA 7-células com NS398 não alterou a expressão de ARNm PDCD4 (p = 0,74, teste t não emparelhado) (Fig. 4B), uma observação que está em contraste com o anteriormente relatado 1,5 upregulation vezes de ARNm PDCD4 seguindo tratamento de HCA-7 células com NS398 [39]. A diferença pode ser devido aos métodos utilizados: o último estudo analisou a expressão do mRNA PDCD4 por Northern blot e quantificado relativamente a GAPDH, enquanto em nosso estudo, mediram os níveis de mRNA usando RT-PCR quantitativo e normalizou os dados usando a média geométrica de três genes de referência (GAPDH, PGK e HPRT), em conformidade com as diretrizes MIQE [30] (ver métodos). Nossos dados de PCR em tempo real sugere que o tratamento NS398 leva a uma diminuição nos níveis de GAPDH (Fig. S3 no ficheiro S1) e esta alteração iria resultar num aumento aparente nos níveis de PDCD4 se GAPDH foi usada como o único gene de referência. Portanto, concluímos que o tratamento NS398 não altera taxa de transcrição PDCD4 ou estabilidade do mRNA; No entanto, consistente com a diminuição observada na miR-21, significante sobre-regulação da expressão da proteína PDCD4 (p 0,001, teste t não emparelhado) foi observada em células tratadas NS398, em comparação com apenas células não tratadas ou com o veículo (Figura 4-C.). Estes dados indicam que a sub-regulação de PDCD4 por COX-2 não é uma consequência da síntese de ARNm PDCD4 diminuída ou a sua estabilidade, mas sim que a COX-2 pode actuar por promoção de um aumento na miR-21, que por sua vez inibe a tradução do ARNm PDCD4.

a seguir ao tratamento de 72 horas diminuição significativa em níveis de miR-21 é vista nas células tratadas NS398 (a).

PDCD4

níveis de ARNm não são afectados pelo tratamento NS398 (B). A análise de Western blot de PDCD4 (painel superior C durante uma mancha representativa) revela um aumento significativo nos níveis de proteína em NS398 células tratadas, em comparação com não tratados ou veículo isoladamente (DMSO), as células tratadas, quando quantificados relativamente a proteína beta actina (bact) como um controle de carga (painel inferior C). O gráfico de barras indica a média da coluna e os bigodes demonstrar o erro padrão da média (SEM). A significância estatística foi calculada através do teste t desemparelhado. As experiências foram repetidas três vezes e analisadas em triplicado. Não tratados = células cultivadas em meios; DMSO = células cultivadas em meio suplementado com 0,1% de veículo de DMSO; NS398 = células cultivadas em meio suplementado com NS398 preparado em DMSO a uma concentração final de 100 uM NS398 e 0,1% de DMSO.

COX-2 activação de miR-21 em HCA-7 células é mediada pela PGE

2

Dado o papel da COX-2 na produção de prostaglandinas, para investigar o mecanismo subjacente a activação de miR-21 por COX-2 que células tratadas com 1 uM de PGE

2 por 24 horas como esta concentração foi mostrado para trabalhar eficazmente nestas células [38]. Descobrimos que o miR-21 foi significativamente sobre-regulada (p = 0,019, teste t não emparelhado) na sub

2 PGE células tratadas, em comparação com veículo (0,1% DMSO) ou tratadas as células não tratadas (Fig. 5a). Não houve mudanças nos níveis de ARNm PDCD4 foram observadas em PGE

2 células tratadas (Fig. 5B); no entanto, uma diminuição significativa (p 0,05, teste t não emparelhado) foi observada nos níveis de proteína PDCD4 que paralelo com o aumento na miR-21 (Figura 5C.). O tratamento combinado com PGE

2 e inibidor de miR-21 resultou em níveis de miR-21 para baixo para níveis comparáveis ​​com os de células não tratadas (Fig. S4 no ficheiro S1), e o tratamento com aspirina também conduziu a uma diminuição na miR- 21 níveis (Fig. S5 em Arquivo S1). Estes dados sugerem que a COX-2 de baixa regulação orientada PDCD4 neste sistema modelo é principalmente devido à PGE

2 supra-regulação induzida de miR-21.

após 24 horas de tratamento aumento significativo em níveis de miR-21 é vista em PGE

2 células tratadas (A).

PDCD4

níveis de ARNm não são afectados pela PGE

2 de tratamento (B). A análise de Western blot de PDCD4 (painel superior C durante uma mancha representativa) revela uma diminuição significativa nos níveis de proteína em

2 células tratadas PGE, em comparação com não tratados ou veículo isoladamente (DMSO), as células tratadas, quando quantificados relativamente a proteína beta actina ( bact) como um controlo de carga (C painel inferior). O gráfico de barras indica a média da coluna e os bigodes demonstrar o erro padrão da média (SEM). A significância estatística foi calculada através do teste t desemparelhado. As experiências foram repetidas três vezes e foram analisadas em duplicado. Não tratados = células cultivadas em meios; DMSO = células cultivadas em meio suplementado com 0,1% de veículo de DMSO; PGE

2 = células cultivadas em meio suplementado com PGE

2 preparado em DMSO a uma concentração final de 1 uM de PGE

2 e 0,1% de DMSO.

Discussão

a desregulação de miARNs é um passo reconhecido na patogénese de muitos tipos de cancro, incluindo CRC. miR-21 é um miRNA freqüência regulada no CRC, cuja expressão aumentada níveis estão associados com resultados terapêuticos mais pobres no CRC [34]. Nós confirmamos que a sobre-expressão de miR-21 se correlaciona significativamente com pior estadiamento patológico de coorte do nosso paciente CRC (Fig. 1), composto por pacientes que apresentavam tumores numa fase Dukes ‘atribuído, sugerindo um papel importante de miR-21 na invasão e disseminação do cancro.

alguns dos potenciais alvos a jusante regulados por miR-21 ter sido confirmada, e estes incluem a morte celular programada 4 (PDCD4) gene supressor de tumor que inibe a transformação neoplásica [43]. Estudos recentes têm mostrado uma redução progressiva na expressão PDCD4 da mucosa normal, para pólipo, de tumor colorretal [33]. É interessante notar um aumento significativo na miR-21 foi observada em CRC em comparação com o normal, mas não entre os pólipos adenomatosos e normal, apesar de uma diminuição na expressão PDCD4 era evidente neste transição [33]. Em nossa coorte observamos uma diminuição nos níveis de mRNA PDCD4 nos tumores em relação aos tecidos normais, mas nenhuma mudança como a doença progrediu por etapa Dukes ‘(Fig. 2A). Tomadas em conjunto estas observações sugerem que na zona de transição do normal para a regulação negativa da hiperproliferação PDCD4 pode ser devido à regulação ao nível da transcrição e /ou ARN e a estabilidade da proteína. No entanto, na transição para a malignidade de miR-21 mediada por inibição da tradução dos níveis de proteína do PDCD4 já níveis de

PDCD4

ARNm torna-se predominante diminuiu, promovendo assim ainda mais a progressão da doença maligna. Portanto determinar os fatores que influenciam a montante miR-21 expressão é fundamental para determinar se e como miR-21 contribui para a progressão da malignidade e fornecer potenciais alvos terapêuticos.

Tendo em conta que, em nossa coorte de pacientes CRC regulação positiva de miR- 21 está positivamente relacionada com a da COX-2 mRNA e com pior estadiamento patológico (Fig. 1 e 2B), que a hipótese de que miR-21 upregulation na CRC pode ser ligado a uma resposta inflamatória.