Abstract

O carcinoma hepatocelular (HCC) é uma das neoplasias humanas mais comuns. Portanto, o desenvolvimento dos primeiros de alta sensibilidade biomarcadores, diagnóstico para prevenir HCC é urgentemente necessário. Soro a-fetoproteína (AFP), o biomarcador clínica de uso corrente, é elevado em apenas ~ 60% dos pacientes com carcinoma hepatocelular; Por conseguinte, é esperado identificação de biomarcadores adicionais para ter um impacto significativo na saúde pública. Neste estudo, foi utilizada a análise de microsséries glicano para explorar o valor diagnóstico potencial de várias antígenos de carboidratos associados ao câncer (cacas) como biomarcadores para HCC. Utilizou-se análise de microarray glicanos com 58 diferentes análogos de glicano para comparação quantitativa de 593 amostras de soro humano (293 amostras HCC; 133 amostras infecção pelo vírus da hepatite B (HBV), 134 amostras de infecção pelo vírus da hepatite C crônica (HCV), e 33 amostras de doadores saudáveis ) para explorar a possibilidade de diagnóstico de alterações de anticorpos séricos como biomarcadores para HCC. As concentrações séricas de anti-disialosyl galactosil globosídeo (DSGG), anti-fucosil-GM1 e anti-GB2 foram significativamente maiores em pacientes com HCC do que em indivíduos crônicas infecção por HBV não em pacientes com infecção pelo VHC crónicos. No geral, em nossa população de estudo, os candidatos biomarcadores DSGG, fucosil GM1 e GB2 de cacas conseguido melhor sensibilidade preditiva de AFP. Identificamos potenciais biomarcadores apropriados para a detecção precoce do CHC. análise de microarray glicano fornece uma ferramenta poderosa para a alta sensibilidade e detecção de alto rendimento de anticorpos séricos contra cacas, que podem ser marcadores biológicos valiosos para a detecção precoce de pessoas de alto risco para HCC

Citation:. Wu CS , Yen CJ, Chou RH, Li ST, Huang WC, Ren CT, et al. (2012) Cancer-associados carboidratos Antígenos como potenciais biomarcadores para carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 7 (7): e39466. doi: 10.1371 /journal.pone.0039466

editor: Erica Villa, da Universidade de Modena Reggio Emilia, Itália |

Recebido: 16 de fevereiro de 2012; Aceito: 21 de maio de 2012; Publicação: 13 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pelo Conselho Nacional de Ciência de Taiwan concede NSC99-2320-B-039-030-MY3, NSC99-2632-B-039-001-MY3, NSC100-2321-B-039-004, e da Universidade do Texas MD Anderson University Medical -China e Hospital Irmã Instituição Fundo DMR-101-115. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o carcinoma hepatocelular (HCC) é o quinto câncer mais comum em todo o mundo, com a China e América do Norte que mostra um aumento contínuo da taxa de incidência e mortalidade [1]. HCC quase sempre desenvolve no contexto da infecção por vírus da hepatite crónica ou cirrose hepática [2] – [4]. O prognóstico para pacientes com HCC continua pobre, ea taxa de sobrevida em 5 anos após o diagnóstico ou para a maioria dos pacientes é inferior a 5%, principalmente porque a doença é muitas vezes diagnosticada em um estágio avançado [5]. Para os pacientes com um diagnóstico de HCC numa fase inicial, a taxa de sobrevivência pode ser melhorada de forma significativa pela ressecção cirúrgica, o transplante de fígado, e outras terapias curativas, tais como tratamentos ablativos [6], [7]. Além disso, a vigilância dos pacientes de risco melhora a detecção e potencialmente o efeito curativo de tratamentos para tumores pequenos. Portanto, marcadores prognósticos iniciais são cruciais para o tratamento e prevenção de HCC eficaz.

O biomarcador HCC mais comum usado para triagem de pacientes com cirrose hepática é o soro a-fetoproteína (AFP), que é medido em intervalos de 6 meses [8]. No entanto, os níveis de AFP são muitas vezes elevados em alguns pacientes com doença hepática crônica que não têm câncer, e os níveis de AFP não são elevados em 30-40% dos pacientes com câncer de fígado [9]. O teste do soro AFP tem baixa sensibilidade, e cerca de um terço dos pacientes com carcinoma hepatocelular precoce como tumores pequenos ( 3 centímetros) têm o mesmo nível de AFP como que em indivíduos normais, o que faz com que o teste de AFP insuficiente para o início detecção de CHC em populações de risco [10]. Além disso, o teste de AFP tem uma elevada taxa de falsos positivos de ~ 20% entre os pacientes com hepatite crónica e 20-50% entre aqueles com cirrose hepática [5], [11]. A este respeito, existe uma necessidade urgente de identificar biomarcadores séricos mais sensíveis e fiáveis ​​para a detecção de carcinoma hepatocelular [12], [13].

Oncogenesis é frequentemente associado a alterações na expressão de hidratos de carbono da superfície celular. Em alguns casos, o padrão de hidrato de carbono pode ser específico para o tipo de doença [14]. Em outros casos, os níveis de anticorpos anti-hidrato de carbono pode ser marcadamente melhorada com o início da doença [15]. Estudos anteriores demonstraram que os perfis de glicosilação celular mudar significativamente durante a carcinogénese [14]. Os hidratos de carbono desempenham um papel crucial em vários eventos biológicos tais como o reconhecimento de células [16], a sinalização inter e intracelular, o desenvolvimento embrionário, a adesão celular [17], e as interacções célula-célula [18]. Atualmente, a descoberta do marcador glicanos com a análise microarray glicano apresenta grande potencial para a identificação de biomarcadores para o diagnóstico de câncer de mama [19].

microarrays glicano permitem a caracterização direta de interações proteína-carboidrato [20]. Microarray técnicas são métodos eficazes e sensíveis para a rápida análise da especificidade das interacções proteína-hidratos de carbono e a caracterização dos processos de diferenciação que pertencem ao aparecimento de cancro, a nível molecular [21]. Além disso, a ligação de açúcares nas superfícies pode efectivamente mimetizar a apresentação destes compostos sobre a membrana de células e, portanto, pode ser usado para ligar anticorpos [20]. Neste relatório, nós nos concentramos em glicanos que são conhecidos por serem antígenos de carboidratos associados ao câncer (cacas) em muitos tipos de câncer, mas que não foram estudadas no HCC. Utilizou-se análise de microarray glicano para explorar a possibilidade de diagnóstico de alterações de anticorpos séricos como biomarcadores para HCC. Além disso, comparamos a precisão dos biomarcadores que identificamos com o biomarcador AFP convencional para HCC.

Resultados

características do paciente

Um total de 593 participantes, incluindo 293 pacientes HCC , 133 do vírus da hepatite B crónica (HBV) pacientes com infecção, 134 crónica pelo vírus da hepatite C (VHC), e pacientes com infecção de 33 indivíduos normais foram recrutados para este estudo (Tabela 1). Não houve diferenças significativas de idade e sexo entre os casos e controles. Além disso, o grupo HCC e o grupo de controlos saudáveis ​​tinham estatisticamente diferentes resultados de laboratório para a albumina, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e bilirrubina total (BIL-t) (p 0,05). O estadiamento patológico (AJCC) de HCC foi de grau I em 96 casos (41,3%), grau II em 80 casos (34,5%), grau III em 48 casos (20,7%) e grau IV em 8 casos (3,4%).

Detecção de soro de anticorpos contra carboidratos Antígenos com glicano Microarray Análise

Testamos soro de pacientes com HCC para anticorpos que se ligam a fragmentos de glicano. Lâminas de vidro impresso em formato de microarray com os compostos de glicano 1-58 (Figura S1) foram incubados com amostras de soro e os anticorpos ligados foram detectados usando cabra-Cy3 anti-humano marcado anticorpo secundário IgG (Figura 1). As varreduras fluorescentes foram processadas para quantificar a intensidade de cada ponto. Os dados resultantes foram representados como a intensidade de fluorescência relativa média de replicados de cada amostra. Notou-se que a intensidade fundo de antígeno de carboidrato de ligação de indivíduos saudáveis ​​poderiam ser o resultado de uma ligação não específica; por conseguinte, a média de intensidades de fluorescência 35000 foram removidos a partir da análise. Esta abordagem forneceu uma base racional para o desenvolvimento de uma micromatriz de glicano para detectar a presença de 47 anticorpos de glicano diferentes no soro dos pacientes (após a remoção dos números de amostra 2, 3, 5, 7, 16, 20, 23, 24, 30, 31 e 47).

a imagem do slide representante obtido a partir de uma varredura de fluorescência após a detecção de IgG em amostras de soro (a). Cada grade foi impresso com números de glicano 1-20 na linha de cima, 21-40 na linha do meio, e 41-58 na linha de fundo. (B) Média ± desvio padrão especificidade de anticorpos que se ligam ao glicano números 1-58 em amostras de soro de pacientes com carcinoma hepatocelular. intensidades de fluorescência relativos foram calculados para cada local (contendo 100? M glicano) no microarray glicano.

Foram examinadas amostras de soro de 155 pacientes com HCC e 33 indivíduos saudáveis ​​para anticorpos que se ligam a carboidratos antígenos na microarray glicano. Os dados de fluorescência que reflectem a reactividade de anticorpo para cada glicano foram normalizados para GB5 para cada amostra, e as intensidades relativas de fluorescência para os anticorpos de IgG de doentes com HCC e indivíduos saudáveis ​​estão apresentados como média de glicano: GB5 rácios de IgG (Figura 2). Os anticorpos que se ligam ao GB5 foram detectados em pacientes com HCC e doadores saudáveis. Observou-se que os níveis de IgG contra os números de glicano 4 (SLacNAc 6SO

3), 15 (disialosyl galactosil-globosídeo; DSGG), 18 (fucosil GM1), 35 (Gb3), 36 (GB2), 42 (B19) , e 56 (Man7) eram significativamente mais elevados em doentes com HCC do que em indivíduos saudáveis.

rácios de fluorescência relativa foram calculados como a intensidade de fluorescência relativa de cada análogo de glicano dividida pela intensidade de fluorescência relativa de GB5, e eles são expressos como percentagens na figura. A figura mostra a taxa média ± desvio padrão para cada glicano. Os asteriscos indicam glicanos na qual o glicano média: GB5 IgG relação era significativamente mais elevada no soro de doentes com HCC (n = 155) do que no soro de indivíduos saudáveis ​​(n = 33).

p valores

foram calculados com um Student

t

-test (*

p Art 0,05; **

p Art 0,01).

a comparação dos níveis de anticorpos Sete Anti-glicano entre pacientes femininos e masculinos com CHC e em indivíduos saudáveis ​​

Em um estudo anterior [22], os homens tinham uma maior incidência de HCC do que as mulheres. Em nosso estudo, nós aumentamos os números de amostras HCC até 293 pacientes e estratificada nossos resultados por sexo para determinar se os níveis de anticorpos anti-glicano variou por sexo. Entre as mulheres, os níveis de IgG contra os números de glicano 15, 18 e 35 foram significativamente maiores em pacientes com HCC do que em indivíduos saudáveis ​​(

P

0,01) (Figura 3A). Entre os homens, os níveis de IgG contra os números de glicano 15, 18, 35, 36 e 42 foram significativamente maiores em pacientes com HCC do que em indivíduos saudáveis ​​(

P

0,05) (Figura 3B). Curiosamente, observou-se resultados semelhantes para os números de glicano 15, 18 e 35 entre os dois grupos.

rácios de fluorescência relativa foram calculados como a intensidade de fluorescência para cada análogo de glicano dividida pela intensidade da fluorescência para GB5, e são expressos como percentagens nas figuras. A figura mostra a taxa média ± desvio padrão para cada glicano. (A) O glicano: GB5 razões de IgG para números de glicano 15, 18, e 35 foram significativamente mais elevadas no soro de pacientes do sexo feminino com HCC (n = 70) do que no soro de mulheres saudáveis ​​(n = 11). (B) O glicano: GB5 razões de IgG para os números de glicano 15, 18, 35, 36 e 42 foram significativamente mais elevadas no soro de pacientes do sexo masculino com carcinoma hepatocelular (n = 223) do que no soro de homens saudáveis ​​(n = 22). Os asteriscos indicam glicanos na qual o glicano média: GB5 razão IgG foi significativamente mais elevada no soro de doentes com carcinoma hepatocelular que no soro de indivíduos saudáveis. O

p valores

foram calculados com um Student

t

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P Art 0,01).

Comparação do nível de Anticorpos Anti-Select glicanos de HCC e doença hepática crônica (CLD) por Sexo

em todo o mundo, mais de 52% dos casos de carcinoma hepatocelular são associados com infecção crônica pelo HBV, e 25% dos casos de carcinoma hepatocelular estão associadas com a infecção pelo VHC [23]. VHB ou VHC infecção conhecida pode aumentar o risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular [7]. Para examinar as diferenças em pacientes com CHC com HBV ou HCV, dividimos os pacientes para o HCC HBV-positivos (HBV-HCC; n = 132) ou HCC HCV-positivo (HCV-HCC; n = 65) para comparar doença hepática crônica ( HBV-CLD; n = 133 e HCV-CLD; n = 134). Para ambos os sexos, os níveis de IgG contra glicanos 15, 18 e 36 para fêmeas e machos foram maiores nos pacientes com HBV com HCC desses pacientes sem HCC (

P Art 0,05) (Figura 4A e B). Não houve diferenças significativas nos níveis de anti-glicano entre pacientes com pacientes crónicos do HCV (Figura 5A e B) e HCV-HCC.

rácios de fluorescência relativa foram calculados como a intensidade de fluorescência para cada análogo de glicano dividida pela fluorescência intensidade de GB5, e são expressos como percentagens nas figuras. A figura mostra a taxa média ± desvio padrão para cada glicano. Os rácios para números de glicano 15, 18 e 36 foram significativamente maiores do HCC relacionado com o HBV do que CLD (HBV) em mulheres (n = 30 e 44, em separado) (A) e do sexo masculino (n = 102 e 89, em separado) ( B). O

p valores

foram calculados com um Student

t

-test (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01, * **

P

. 0,001)

rácios de fluorescência relativa foram calculados como a intensidade de fluorescência para cada análogo de glicano dividida pela intensidade da fluorescência para GB5, e são expressos como percentagens nas figuras. A figura mostra a taxa média ± desvio padrão para cada glicano. Os rácios para números de glicano 15, 18, 35, 36 e 42 houve diferença significativa entre HCC relacionado com o HCV e CLD (HCV) no sexo feminino (n = 18 e 61, em separado) (A) e do sexo masculino (n = 47 e 73 , separadamente) (B). (

P Art 0,05).

Nós detecção próxima comparação de análogos de glicanos e AFP para sua sensibilidade de diagnóstico para HCC da CLD e saudável. Para um paciente com uma história de doença de fígado, de consenso para o diagnóstico de HCC pode ser feita com um nível elevado de AFP (≥200 ng /dL), juntamente com um estudo de imagem dinâmico mostrando um tumor hepático. Em Taiwan, o valor de corte do nível de AFP no soro para o diagnóstico de HCC é fixado em 200 ng /ml, e de acordo com as diretrizes de critérios clínicos de diagnóstico e estadiamento para HCC. Portanto, alterar o valor de corte de AFP. Quando AFP

200 (AFP com um valor de corte de 200 ng /mL) foi utilizado para prever a fase de HCC, uma sensibilidade de 33.33% (10 de 30) foi obtida para as fêmeas, e 24,51% (25 de 102 ) foi obtido para os homens (Tabela 2). Observou-se que a sensibilidade dos números 3 anti-glicano (15, 18, e 36) foram melhores do que a de AFP a 63,33% (19 de 30) /42.16% (43 de 102), 56,67% (17 de 30) /35,29% (36 de 102) e 43,33% (13 de 30) /45.1% (46 de 102), respectivamente, no feminino /masculino. (Mesa 2). Para testar se a sensibilidade de classificação poderia ser aumentada através da inclusão de dados clínicos, valores de AFP foram incluídos na análise. Como pode ser visto na Tabela 2, a inclusão de valores de AFP e 3 marcadores anti-glicano aumento da sensibilidade da classificação correcta de estados HCC a 80% (24 de 30) e 74,5% (76 de 102), respectivamente, no sexo feminino e masculino.

O valor diagnóstico de três anticorpos anti-glicano para HCC

para avaliar se os níveis séricos de anti-glicano pode ser usado como um potencial marcador diagnóstico para HCC, Receptor características operacionais (ROC) As análises foram realizadas curva. Foi revelado que o soro 3 marcadores anti-glicano além de níveis de AFP foi um marcador potencial para discriminar pacientes HCC HBV-positivos de controles saudáveis ​​com uma AUC (áreas sob a curva ROC) de 0,6843 (95% CI: 0,5882-0,7805) ( Figura 6A). No valor de corte de 0,4974, a sensibilidade e especificidade para este marcador foi 46,21% e 84,85%. A AUC do soro 3 marcadores anti-glicano além de níveis de AFP para discriminar HCC HBV-positivos de hepatite B crónica foi (IC 95%: 0,6215-0,7631) 0,6923 (Figura 6B). No valor de corte de 0,5268, a sensibilidade e especificidade para este marcador foi 57,58% e 82,43%. Este resultado sugere que estes 3 marcadores anti-glicano mais AFP pode ser aplicável ao diagnóstico de HCC relacionado com o HBV.

Estes 3 anticorpos anti-glicano produziu uma AUC (áreas sob a curva ROC) de 0,6843 ( IC 95%: 0,5882-0,7805), com 46,21% de sensibilidade e especificidade 84,85% para discriminar pacientes HCC de controles saudáveis ​​(a), e uma AUC de 0,6923 (95% CI: 0,6215-0,7631), com sensibilidade 57,58% e 82,43% de especificidade para discriminando HCC de pacientes HBV-CLD (B).

Discussão

os marcadores tumorais no soro de pacientes com HCC podem ser usados ​​como ferramentas de diagnóstico, fatores prognósticos e parâmetros de tratamento [ ,,,0],24]. Usando o nosso microarray glicanos, examinamos soro para pesquisa de anticorpos que podem distinguir entre os pacientes com HCC e indivíduos saudáveis. Este estudo demonstrou o potencial de uma micromatriz de glicano para a identificação de candidatos a biomarcadores cacas no soro de pacientes com carcinoma hepatocelular. No nosso estudo, as diferenças nos níveis de anticorpos séricos entre pacientes com HCC e indivíduos saudáveis ​​foram substanciais, com níveis de anticorpos para 7 de 58 glicanos diferencialmente abundantes (P 0,01). Estes glicanos foram SLacNAc 6SO

3, DSGG, fucosil GM1, Gb3, GB2, B19, e Man7. As alterações na glicosilação no cancro, assim como outras doenças, têm atraído muito interesse e têm demonstrado potencial, tanto como fonte de marcadores de doença e como alvos para a imunoterapia de tumores [15]. Alterações nos níveis de expressão de glicosiltransferase geralmente conduzir a um aumento no tamanho e ramificação de glicanos ligados a N, que cria locais adicionais para os resíduos de ácido siálico terminais [25]. Um aumento correspondente na expressão de sialiltransferase, em última análise conduz a um aumento global na sialilação [26]. A sobre-expressão das glicosiltransferases que estão envolvidos na ligação entre os resíduos terminais para glicanos leva à sobre-expressão de determinados epítopos de glicano terminais, tais como SLacNAc 6SO

3, DSGG, e fucosil GM1 em tumores [27] – [29].

Descobrimos que os níveis de anti-DSGG distinguiu entre pacientes com HCC e CLD. DSGG é um glicoesfingolipídio disialyl com uma estrutura de núcleo-série Globo [27]. Num estudo anterior, DSGG foi identificada como uma molécula de adesão, expresso em carcinoma de células renais, e a sua relação com o cancro metastático foi demonstrado [27]. Nossos dados são os primeiros a sugerir que DSGG é altamente expresso no HCC

Curiosamente, uma diferença de gênero foi descrito para HCC em quase todas as populações de estudo, com um macho:. Relação fêmea para a incidência de HCC em média, entre 02:01 e 4:01 [30]. Um mecanismo que pode explicar a disparidade entre os sexos observado na incidência de HCC é o aumento da atividade de estrogénios em pacientes do sexo feminino, o que pode oferecer proteção contra carcinogênese hepática [22]. Além disso, há provavelmente outras moléculas reguladoras celulares envolvidos na disparidade entre os sexos na incidência de HCC. Em nosso estudo, observou-se uma disparidade de género nos níveis de anticorpos anti-hidratos de carbono ligeiramente diferentes. Os níveis de anti-fucosil-GM1 diferiam em pacientes com CHC e VHB ou indivíduos saudáveis. Fucosil GM1 pertence a um tipo de gangliósidos [28]. Num estudo anterior, fucosil GM1 foi fortemente associado com o cancro de pequenas células do pulmão, e este antigénio associado ao tumor foi detectado com elevada sensibilidade e especificidade usando um método de imunof luorescência [28]. O papel deste glicano no câncer não é clara. A glicosilação de receptores hormonais tem sido sugerido como uma explicação para as disparidades de género na doença cardíaca coronária e câncer de próstata [31], [32]. Embora como geral, estas observações são a populações com uma etiologia da doença mais heterogênea continua a ser examinados, os resultados aqui apresentados sobre potenciais biomarcadores de glicano parecem bastante encorajador. Recentemente, métodos analíticos em larga escala têm sido desenvolvidos para o glycoproteome soro humano, o que também é uma ferramenta poderosa para a descoberta de alvos de diagnóstico e terapêuticos. Usando a análise glycoproteomic à base de lectina, glicoproteína (GP) 73 foi encontrado para ser um novo marcador tumoral de carcinoma hepatocelular [33]. Os níveis séricos de GP73 foram significativamente aumentados em pacientes com carcinoma hepatocelular, mesmo em doentes com HCC níveis séricos AFP menos do que 20 ng /ml [24]. Fucosilação de GP73 é relatado para ser aumentada em doentes com HCC [33]. Um estudo anterior sugeriu que fucosilação desempenha um papel importante na interacção entre a interleucina-8 e o seu receptor, induzindo assim a migração de células cancerosas no carcinoma hepatocelular [34]. Os nossos resultados actuais sugerem que fucosil GM1 é um candidato hepáticas biomarcadores cacas.

HCC está associada com a infecção por HBV em aproximadamente 50% dos casos [35]. Neste estudo, observou-se que cinco tipos de anticorpos anti-glicano foram aumentadas em doentes com HCC e infecção pelo HBV. Portanto, extrapolar que o aumento em anticorpos e infecção pelo HBV estão relacionados. Marmotas são usados ​​como um modelo animal preferido da infecção por HBV crónica [36]. Este modelo recapitula a progressão da doença de infecção por HBV em HCC e documentou semelhanças na glicosilação de proteínas com HCC humana [36]. Como HCC normalmente leva anos para se desenvolver como resultado de infecção crônica pelo HBV, a investigação dos eventos precoces no modelo marmota da infecção pelo VHB pode fornecer informações úteis sobre potenciais biomarcadores para o prognóstico do HCC. As influências biológicas condução estas mudanças requerem uma análise mais aprofundada.

AFP é o único marcador sorológico actualmente utilizado para a detecção clínica de HCC. Embora AFP melhora a detecção de carcinoma hepatocelular, um número significativo de doentes com HCC não têm níveis elevados de AFP, e, assim, os biomarcadores adicionais são necessários para aumentar a sensibilidade de detecção de HCC [37], [38]. Em pesquisas anteriores, AFP mostrou sensibilidade limitada (41-65%) para o diagnóstico de HCC [39]. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente de descobrir biomarcadores adicionais para o rastreio e o diagnóstico do carcinoma hepatocelular. Nosso estudo pacientes com HCC e CLD mais saudável em comparação, e estes 3 glicano proporcionou melhor sensibilidade do que a AFP. Além disso, a sensibilidade de 3 anticorpos anti-hidratos de carbono, mais AFP proporcionou melhor sensibilidade diagnóstico.

Além disso, não houve correlação entre os níveis destas 3 anticorpos anti-glicano e a fase do tumor (dados não apresentados). Portanto, sugere-se que os 3 anticorpos anti-hidrato de carbono pode ser como biomarcadores para o início da formação de tumor, mas não a progressão do tumor. Uma análise mais aprofundada através de um grupo de pacientes maior e um processo de validação, que inclui prospectivamente coletadas amostras de pacientes são necessários para verificar as nossas observações. Estes novos biomarcadores cacas, em combinação com outros biomarcadores sorológicos existentes, pode ser útil no diagnóstico de HCC. Com base em nossos resultados, sugerimos que a combinação de análise de microarray glicanos com medidas AFP irá fornecer uma ferramenta muito melhor para o diagnóstico de HCC que o uso de somente AFP.

Os biomarcadores têm sido muito procurados para seu diagnóstico, prognóstico e terapêutica usa. No entanto, não há biomarcadores fiáveis ​​para a maioria dos tumores sólidos, incluindo o HCC. Os métodos descritos no nosso estudo são úteis para a identificação de possíveis biomarcadores da doença. O desenvolvimento de um microarray glicano permitiu-alta sensibilidade e análise de alto rendimento de interações proteína-carboidrato e tem contribuído para avanços significativos em glycomics. Esta abordagem fornece uma ferramenta poderosa para a pesquisa básica e uma técnica promissora para o diagnóstico médico ea detecção de patógenos e câncer [20]. Este método requer muito pequenas quantidades de material e é mais eficaz e mais sensível do que o método tradicional de ELISA; Assim, proporciona uma outra plataforma para monitorizar a resposta imunológica de epitopos de hidratos de carbono, em diferentes fases durante a diferenciação, metástase, e de tratamento [21]. Nossa pesquisa atual identificou cinco cacas biomarcadores para o diagnóstico de HCC que precisam ser melhor avaliadas em trabalhos futuros. Identificação das cacas irá ser útil no desenvolvimento de novas terapias de cancro tais como a geração de vacinas ou de anticorpos dirigidos contra cacas [14], [19], [40] – [42]. Acreditamos que a micromatriz de glicano é um método viável para o diagnóstico clínico de HCC. Este método deve melhorar o prognóstico e pode oferecer insights sobre o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para outros tipos de câncer. Novos antigénios de glicano pode provar ser alvos úteis de vacinas de hidratos de carbono existentes e em desenvolvimento.

Em conclusão, mostrámos que a análise de micro-arranjo de glicanos utilizados para identificar novos biomarcadores candidatos de glicano para HCC pode ser útil no rastreio de biomarcadores séricos para HCC. Os candidatos biomarcadores foram identificados por meio de análise microarray glicano apresentou boa sensibilidade preditiva na população do estudo e, em geral, eles eram superiores a AFP. Além dos resultados acima para os testes de função hepática convencionais podem de fato melhorar a precisão do diagnóstico de doenças do fígado. análise de microarray glicano fornece uma ferramenta poderosa para a alta sensibilidade de detecção e de alto rendimento de anticorpos séricos contra cacas, e os biomarcadores séricos identificados podem ser úteis para a detecção precoce de HCC em populações de alto risco.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

o protocolo do estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board de Seres Humanos Comitê de Cheng Kung University Hospital de Ética em Pesquisa em Taiwan (No. ER-99-176). Além disso, o consentimento informado por escrito foi obtido dos participantes para o uso de seu sangue neste estudo.

Amostras de soro

As amostras de soro de indivíduos saudáveis ​​(n = 33), hepatite B crónica (n = 133 ), HCV crônica (n = 134) e pacientes com HCC (n = 293) foram coletadas no Hospital da Universidade Nacional Cheng Kung, em Tainan, Taiwan. As amostras foram criptografados para proteger a confidencialidade do paciente e foram utilizados no âmbito de um protocolo aprovado pelo Institutional Review Board of Human Assuntos Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Cheng Kung Hospital em Tainan, Taiwan. Os pacientes foram diagnosticados usando uma combinação de dados (avaliação clínica, laboratorial e achados de imagem e /ou biópsia). Todas as amostras foram armazenadas a -20 ° C até à sua utilização.

Métodos Gerais

NEXTERION corrediça H foram adquiridos a SCHOTT América do Norte. O revestimento na SCHOTT NEXTERION corrediça H é constituída por uma camada de polímero de ligação cruzada, de multi-componente activado com ésteres de N-hidroxissuccinimida (NHS) para proporcionar imobilização covalente dos grupos de amina. O procedimento geral para a stese de glicanos foi realizado como descrito [20], [21], [43]

Glicano Microarray Fabricação

Os microarrays foram impressas. (BioDot; cartesianas Technologies) com um pino robótico (SMP3; TeleChem International) com uma deposição de ≈ 0,7 nL de várias concentrações de glicanos contendo amina em tampão de impressão (tampão de fosfato 300 mM [pH 8,5] contendo 0,005% de Tween-20) a partir de uma placa de microtitulação de 96 poços sobre NHS-revestido lâminas de vidro. As lâminas foram manchados com 50 soluções uM de cada glicanos, com duas linhas de baixo para cima e cinco repetições verticais em cada subarray. Cada lâmina foi projetado para 14 grades. slides impressos foram deixados reagir numa atmosfera de 80% de humidade durante 1 h seguida por dia para o outro à dessecação. As lâminas foram armazenadas à temperatura ambiente num excicador até utilização. Antes do ensaio de ligação, as lâminas foram bloqueados com etanolamina (etanolamina 50 mM em tampão de borato 50 mM [pH 9,2]) e, em seguida, lavada duas vezes com água e tampão de fosfato salino (PBS) (pH 7,4).

Microarray análise de amostras de soro

as amostras de soro de doentes com HCC e indivíduos saudáveis ​​foram diluídas 1:20 com um tampão que consiste em 0,05% de Tween 20 e 3% de BSA em PBS (pH 7,4), aplicado às grades da microarrays de glicano, e, em seguida, incubadas numa câmara humidificada com agitação durante 1 h. As lâminas foram então lavadas três vezes cada uma com 0,05% de Tween 20 em PBS (pH 7,4), PBS (pH 7,4), e H

2O. Em seguida, foi adicionado cabra Cy3-conjugado anti-humano IgG (Jackson ImmunoResearch) para as lâminas, tal como acima descrito, e as lâminas foram incubadas sob uma coberta numa câmara humidificada com agitação durante 1 h. As lâminas foram lavadas três vezes cada uma com 0,05% de Tween 20 em PBS (pH 7,4), PBS (pH 7,4), e H

2O, e em seguida secou-se. As lâminas foram feitos a varredura em 532 nm (para anticorpo secundário Cy3 conjugado) com um leitor de chip de microarray de fluorescência (arrayWoRx leitor microarray).

Análise de Dados

O software GenePix Pro (Axon Instruments) foi utilizado para a análise de fluorescência dos dados extraídos. O fundo foi subtraído local, a partir do sinal em cada ponto de anticorpo. Os “medianas dos índices” de pontos replicados foram calculados dentro da mesma matriz. Para obter as intensidades de ligação relativas dos glicanos em soros humanos, que defina a intensidade de ligação para GB5 a 100% e as intensidades normalizadas de ligação relativa de cada análogo de glicano para cada amostra de soro. A proporção de anti-glicano: anti-soros em GB5 foi calculada dividindo a intensidade de ligação relativa média dos replicados de glicano por a intensidade de ligação relativa média para GB5 replica, e os resultados foram expressos como percentagens. A sensibilidade foi calculada como a razão entre o número de amostras de carcinoma hepatocelular que foram classificados correctamente como HCC (verdadeiros positivos) e o número total de amostras de carcinoma hepatocelular. Finalmente, a análise estatística dos níveis de IgG em pacientes com HCC e indivíduos saudáveis ​​foi realizada por meio de um Student não pareado

t

-teste. operating characteristic (ROC) Receptor foram construídos e a área sob a curva (AUC) foi calculada para avaliar a especificidade e sensibilidade de prever casos e controlos. A análise dos dados foi feita usando Prism 5 (GraphPad Software, Inc.) e SigmaPlot 9,0 software (SigmaPlot).

Informações de Apoio

Figura S1.

Síntese de glicanos. O método de química de composição foi utilizado para sintetizar 58 antígenos de carboidratos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0039466.s001

(TIF)