Abstract

Fundo

Recentemente, rápidos avanços foram feitos em metabolômica baseada, fácil -para-uso de métodos de detecção de câncer precoce utilizando amostras de sangue. Entre metabolitos, perfis de aminoácidos livres no plasma (PFAAs) é uma abordagem promissora porque PFAAs ligar todos os sistemas de órgãos e têm um papel importante no metabolismo. Além disso, os perfis PFAA são conhecidos por ser influenciada por determinadas doenças, incluindo cancros. Portanto, o objetivo do presente estudo foi determinar as características dos perfis PFAA em pacientes com câncer e a possibilidade de utilizar esta informação para a detecção precoce.

métodos e resultados

As amostras de plasma foram coletadas a partir de cerca de 200 pacientes de vários institutos, cada diagnosticado com um dos seguintes cinco tipos de cancro: pulmão, gástrico, colorectal, da mama, ou cancro da próstata. Os pacientes foram comparados com sexo e da mesma idade controles pareados também utilizado no presente estudo. Os níveis PFAA foram medidos usando-alto desempenho cromatografia líquida (HPLC) de ionização -electrospray (ESI) Espectrometria de -massa (MS). A análise univariada revelou diferenças significativas nos perfis PFAA entre os controles e os pacientes com qualquer um dos cinco tipos de câncer listados acima, mesmo aqueles com doença em estágio inicial assintomática. Além disso, a análise multivariada discriminado claramente os pacientes com câncer a partir dos controles em termos da área sob a curva de características receptor-operador (AUC da ROC 0,75 para cada cancro), independentemente do estágio do câncer. Porque este estudo foi desenhado como um estudo de caso-controle, novas investigações, incluindo a construção e validação usando coortes com amostras maiores modelo, são necessários para determinar a utilidade de PFAA profiling.

Conclusões

Estes achados sugerem que PFAA profiling tem um grande potencial para melhorar o rastreio e diagnóstico do cancro e compreender patogênese da doença. PFAA perfis também pode ser utilizado para determinar várias diagnóstico de doenças a partir de uma única amostra de sangue, o qual envolve um ensaio de plasma relativamente simples e impõe um fardo físico inferior em indivíduos quando em comparação com métodos de triagem existentes

citação:. Miyagi Y, Higashiyama H, Gochi A, Akaike H, Ishikawa T, T Miura, et al. (2011) Plasma gratuito Aminoácidos Profiling dos cinco tipos de pacientes com câncer e sua aplicação para a detecção precoce. PLoS ONE 6 (9): e24143. doi: 10.1371 /journal.pone.0024143

editor: Libing Song, Sun Yat-sen University Cancer Center, China

Recebido: 08 de abril de 2011; Aceito: 01 de agosto de 2011; Publicação: 07 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Miyagi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho tem sido apoiada por Grant-in-Aid para a Investigação científica em Pesquisa básica B (No. 17.390.195) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Ajinomoto, Co., Inc. tinha um papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e ter a seguinte conflitos: Dr. Horimoto, Dr. Tochikubo, Dr. Yamakado, e Dr. Okamoto ter sido consultores para a Ajinomoto, Co., Inc. e receber honorários de consultoria da Ajinomoto, Co., Inc. Dr. Imaizumi, Dr. Yamamoto, e Dr. Miyano são funcionários da Ajinomoto, Co., Inc. Dr. Miyagi, Dr. Higashiyama, Dr. Gochi, Dr. Akaike, Dr. Ishikawa, Dr. Miura, Dr. Saruki, Dr. Bando, Dr. Kimura, Dr . Imamura, Dr. Moriyama, Dr. Ikeda, Dr. Chiba, Dr. Oshita, Dr. Tochikubo, Dr. Mitsushima, Dr. Yamakado, e Dr. Okamoto recebeu bolsas de pesquisa da Ajinomoto, Co., Inc. Dr. Higashiyama, Dr. Imamura, Dr. Imaizumi, e Dr. Okamoto ter aplicado para as patentes de perfis de plasma de aminoácidos por meio de análise multivariada como ferramenta de diagnóstico para o câncer e cânceres de pulmão (WO2008 /016111 e WO2009 /110517), Dr. Gochi, Dr. Imaizumi, e Dr. Yamamoto ter aplicado para as patentes de plasma de perfis de aminoácidos por meio de análise multivariada como uma ferramenta de diagnóstico para câncer gástrico (WO2009 /099005), Dr. Imaizumi e Dr. Okamoto ter aplicado para as patentes de perfis de plasma de aminoácidos usando análise multivariada como ferramenta de diagnóstico para o cancro colorectal (WO2008 /075663), Dr. Imaizumi e Dr. Okamoto ter aplicado para as patentes de perfis de plasma de aminoácidos por meio de análise multivariada como ferramenta de diagnóstico para câncer de mama (WO2008 /075662), Dr. Miyagi, Dr. Miura, Dr. Imaizumi, Dr. Yamamoto, e Dr. Okamoto solicitaram patentes de plasma de perfis de aminoácidos usando análise multivariada como ferramenta de diagnóstico para câncer de próstata (WO2009 /154297), e Dr. Miyano aplicou para as patentes de sistemas de medição de amino ácido plasma (WO2003 /069328 e WO2005 /116629). Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS One políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Vários métodos de diagnóstico minimamente invasivo, câncer easy-to-use, utilizando sangue periférico ou as amostras de urina foram recentemente desenvolvidos para aliviar o fardo físico em pacientes e para reduzir os custos e tempo envolvidos [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [ ,,,0],8]. Os rápidos avanços foram feitos nos métodos de diagnóstico e prognóstico do câncer com base na análise metaboloma [3], [9], [10], [11], [12], [13], [14], que envolve frequentemente o uso de multivariada técnicas de análise, tais como, sistemas de aprendizado de máquina assistida por computador para mineração de dados.

Embora a análise metaboloma é uma abordagem promissora para rastreio de doenças como câncer, algumas limitações práticas permanecem. Estes incluem a necessidade de medir um grande número de metabolitos [15], [16], [17], os problemas de redundância de dados, incluindo a taxa de falso-descoberta (FDR) e overfitting, e restrições de custo. Uma abordagem para superar estes problemas é “metabolômica focado”, o que limita os objetos da análise aos que desempenham um papel no metabolismo geral e compartilham semelhanças físicas.

Os aminoácidos estão entre os candidatos mais adequados para metabolômica focado como eles são ou ingerido ou sintetizado endogenamente e desempenham papéis essenciais tanto fisiológicos como os metabolitos e os reguladores básicos metabólicas. Para medir aminoácidos, plasma livre aminoácidos (PFAAs), que abundantemente circulam como um meio de ligação de todos os sistemas de órgãos, seria o alvo mais favorável, porque seus perfis têm sido conhecida a ser influenciada por variações metabólicas em sistemas de órgãos específicos induzidos por doenças específicas [18], [19], [20], [21]. Além disso, as amostras de plasma podem ser facilmente recolhidos de pacientes.

Vários investigadores também relataram alterações nos perfis PFAA em doentes com cancro [22], [23], [24], [25], [26], [ ,,,0],27], [28]. No entanto, apesar das evidências de uma relação entre perfis PFAA e alguns tipos de câncer, poucos estudos exploraram o uso de perfis PFAA para o diagnóstico porque, embora perfis PFAA diferem significativamente entre os pacientes, as diferenças de aminoácidos individuais nem sempre fornecem capacidade de discriminação suficientes por si só [24], [29], [30]. Para abordar esta questão, nós previamente construído e testado um índice de diagnóstico com base nas concentrações PFAA, conhecida como a “tecnologia AminoIndex” [29], [30], [31], [33] [32], para comprimir a informação multidimensional de PFAA perfis em dimensão única e maximizar as diferenças entre pacientes e controles (Figura 1). Obtivemos os dados preliminares sobre a eficácia da “tecnologia AminoIndex” para a detecção precoce de colo, mama e câncer de pulmão em cerca de 150 amostras de um único instituto médico [29], [30].

No parte superior do diagrama, as concentrações PFAA são medidos para cada sujeito. No meio, variáveis ​​e análise univariada de perfis PFAA alvo são representados. Na parte inferior, uma estimativa do classificador com o poder de discriminação optimizada utilizando análise multivariada é apresentada.

Além disso, as tecnologias foram recentemente desenvolvido para analisar os aminoácidos com elevada precisão. Por exemplo, foi desenvolvido um método para medir os perfis PFAA usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de ionização -electrospray (ESI) Espectrometria de -massa (MS) [34], [35], [36].

o presente estudo teve como objetivo determinar a possibilidade de PFAA perfil para diagnóstico de câncer usando um grande número de amostras de vários institutos médicos. Medimos os perfis PFAA de cerca de 200 pacientes com câncer a partir de três diferentes institutos, cada um com um dos seguintes cinco tipos de câncer: pulmão, gástrico, colo-retal (CRC), de mama ou câncer de próstata. Os pacientes foram comparados com cinco vezes tamanhos de controles pareados por gênero e idade, também utilizadas neste estudo. Em seguida, compararam as alterações nos perfis PFAA entre os doentes com cancro e os controles usando análises uni e multivariada. Como um resultado, alterações significativas nos perfis PFAA foram observadas em doentes com cancro, em comparação com sujeitos de controlo. Nós demonstramos dois tipos de alterações nos perfis PFAA em pacientes com câncer: algumas diferenças refletiram as alterações metabólicas comuns a muitos tipos de câncer, enquanto outros são específicos para cada tipo de câncer. Nós também descobrimos que ambas as alterações comuns e câncer de tipo específico de perfis PFAA foram observadas mesmo nos pacientes com câncer em estágio precoce. Além disso, usando um grande número de amostras permitiu-nos para verificar a robustez do PFAA profiling para a detecção precoce de vários tipos de câncer.

Materiais e Métodos

Ética

O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsínquia, eo protocolo foi aprovado pelos comitês de ética do Cancer Center Kanagawa, do Centro Médico Osaka para o cancro e as doenças cardiovasculares, o Hospital Universitário de Okayama, o Medical Center Yokohama City University, o cancro da Prefeitura de Gunma centro, o Shizuoka Prefectural Cancer center, o Chiba Prefectural Cancer center, o hospital de Yokohama Municipal Cidadão do, o Minami Kyosai Hospital Yokohama, Kanagawa Associação de Serviços de Saúde, o Kameda Medical center Makuhari, eo Hospital Memorial Mitsui. Todos os indivíduos deram o seu consentimento informado por escrito para inclusão antes que participaram do estudo. Todos os dados foram analisados ​​anonimamente ao longo do estudo.

Assuntos

dados de pacientes japoneses com câncer de pulmão (LC), câncer gástrico (GC), cancro colorectal (CRC), cancro da mama (BC) , e cancro da próstata (PC) foram analisadas neste estudo. Os pacientes foram histologicamente diagnosticado com câncer primário em vários institutos médicos japoneses entre 2006 e 2009. A LC pacientes foram recrutados a partir do Centro Osaka Medical para o cancro e as doenças cardiovasculares, o Cancer Center Chiba Prefectural, o Cancer Center Kanagawa, eo Gunma Centro de câncer. Os pacientes do GC foram recrutados no Hospital Okayama University, o Gunma Cancer Center, eo Cancer Center Shizuoka Prefectural. Os pacientes com CCR foram recrutados a partir do Centro de Câncer Kanagawa, Shizuoka Prefectural Cancer Center e do Centro de Câncer de Gunma. Os pacientes BC foram recrutados a partir do Centro Yokohama City University Medical, o Cancer Center Kanagawa, eo Cancer Center Gunma. Os pacientes de PC foram recrutados a partir do centro do cancro de Kanagawa, o hospital de Yokohama Municipal Cidadão do, o Minami Kyosai Hospital Yokohama, e do Centro de Câncer de Gunma. indivíduos controle sem câncer aparente foram escolhidos entre aqueles submetidos a exames médicos abrangentes em três diferentes institutos médicos japoneses (o Centro de Testagem de Saúde Multiphasic e Serviços da Mitsui Memorial Hospital, o Centro Kameda Medical Makuhari, e da Associação de Kanagawa Serviço de Saúde) entre 2008 e 2009.

pacientes pólipos do cólon foram recrutados entre aqueles submetidos a polipectomia endoscópica no Kameda Medical Center Makuhari entre 2006 e 2008.

para efeitos de análise de dados, os pacientes foram designados para cinco grupos com base em seus diagnósticos de câncer primário (~140-200 pacientes por grupo), e cinco grupos de controle pareados por idade e gênero também foram estabelecidos (Tabela 1). Conjuntos de dados para todos os pacientes com câncer e controles, bem como todos os pacientes com câncer estratificados por sexo, também foram analisados.

medição PFAA

As amostras de sangue foram coletadas a partir dos controles e os doentes antes de qualquer tratamento médico. As amostras de sangue (5 ml) foram recolhidas a partir de veias do antebraço após um jejum durante a noite em tubos contendo ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA; Termo, Tóquio, Japão) e foram imediatamente colocadas em gelo. O plasma foi preparado por centrifugação a 3.000 rpm a 4 ° C durante 15 min e, em seguida, armazenada a -80 ° C até à análise. Após a coleta de plasma, todas as amostras foram armazenadas e processadas no Instituto para a Inovação da Ajinomoto Co., Inc. (Kawasaki, Japão). Para reduzir qualquer desvio introduzido antes da análise, as amostras foram analisadas por ordem aleatória. As amostras de plasma foram desproteinizadas utilizando acetonitrilo a uma concentração final de 80%, antes da medição. As concentrações de aminoácidos no plasma foram medidos por meio de HPLC-ESI-MS, seguido de derivatização pré-coluna. Os métodos analíticos utilizados foram como descrito anteriormente [34], [35], [36].

Entre os 20 aminoácidos geneticamente codificados, o glutamato (Glu), aspartato (Asp) e cisteína (Cys) foram excluídos da análise porque eles são instáveis ​​no sangue. Citrulina (Cit) e a ornitina (Orn) foram medidos em vez porque são relativamente abundante no sangue e são conhecidos por desempenhar papéis importantes no metabolismo. As seguintes 19 aminoácidos e moléculas relacionadas, foram, portanto, medidos e analisados: alanina (Ala), arginina (Arg), asparagina (Asn), Cit, glutamina (Gln), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile) , leucina (Leu), lisina (Lys), metionina (Met), Orn, fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptofano (Trp), tirosina (Tyr) e valina (Val).

Duas medidas foram feitas para cada um dos 19 aminoácidos, incluindo a concentração absoluta de cada aminoácido, o que reflectido directamente a sua disponibilidade e o consumo, e os rácios associados com o estado metabólico específico em cada órgão . As concentrações de aminoácidos no plasma foram expressas em? M, e as relações entre as concentrações de aminoácidos foi expressa pela equação seguinte: em que

X2

i, j

é o rácio de amino-ácido concentração do aminoácido j-th de i-ésimo sujeito, e

X

i, j

é a concentração de plasma (uM) do ácido amino j-th de i-ésimo sujeito.

a análise estatística

foram utilizados dois tipos de métrica para cada conjunto de dados para análise usando tanto a concentração de amino-ácido ou a relação como variáveis ​​explicativas.

Média e SD.

As concentrações de aminoácidos médios ± desvios-padrão (SDS) foram calculadas para determinar perfis PFAA resumidos para ambos os pacientes e controles.

Mann-Whitney U-teste.

O Mann -Whitney

U

-test foi usado para avaliar diferenças significativas das concentrações de aminoácidos no plasma entre os pacientes e os controles.

ROC análise.

característica receptor-operador (ROC) análises de curvas foram realizadas para determinar as habilidades de uni e multivariada analisa a discriminação entre pacientes e controles. Os rótulos de pacientes foram fixados como rótulos de classe positivos. Por isso, uma área sob a curva ROC (AUC de ROC) valor de 0,5 indica que o nível dos aminoácidos foi menor nos pacientes do que os controlos, ao passo que um valor de AUC de ROC de 0,5 indicou que era mais elevada. O intervalo de confiança de 95% (95% CI) da AUC do ROC para a discriminação de pacientes com base nas concentrações de aminoácidos e rácios também foi estimada como descrito por Hanley e McNeil [37].

Two-way análise de variância (ANOVA).

O two-way ANOVA foi utilizado para avaliar os efeitos de sexo, idade e tabagismo como potenciais fatores de confusão. foram assumidas a presença de câncer e sexo como fatores independentes, idade foi tratada como um preditor contínua em vez de um preditor categórico, e o termo de interação entre a presença de status de câncer e tabagismo foi analisada.

Two-classe análise de discriminação linear (LDA).

análise discriminação linear (LDA) com seleção de variáveis ​​stepwise foi realizada para distinguir pacientes com cada tipo de câncer a partir dos indivíduos do grupo controle, em que tanto a máxima e mínima p-valores para um termo para ser adicionado ou removido foi fixado em 0,001.

multi-classe LDA para a discriminação.

LDA com seleção de variáveis ​​stepwise também foi realizada para distinguir pacientes com câncer específica a partir dos dados completa conjunto contendo todos os pacientes com câncer estratificados por sexo (quatro tipos de pacientes com câncer em cada conjunto de dados). Uma vez que o tamanho de cada grupo era menor do que a de LDA em duas classes, o valor p máximo para um termo para ser adicionado foi de 0,05 e o valor p para um mínimo de prazo a ser removida foi fixado em 0,10. A distância de Mahalanobis foi usado como uma métrica de classificação. A precisão foi definida como a relação dos pacientes corretamente discriminados para o número total de pacientes com câncer cada vez de AUC da ROC porque a análise ROC poderia ser aplicada apenas para a discriminação de duas classes.

Deixe um fora cruzada validação (LOOCV).

LOOCV foi realizada para corrigir eventual excesso de otimização para modelos LDA obtidos. Resumidamente, uma amostra foi omitido do conjunto de dados de estudo, e o modelo de LDA foi calculada para as amostras restantes para estimar os coeficientes para cada aminoácido. Os valores de função para a amostra deixada de saída foram calculadas com base no modelo. Este processo foi repetido até que cada amostra no conjunto de dados do estudo tinha sido deixado de fora uma vez.

Logística de regressão condicional análise (c-logística).

C-logística análise também foi realizada para verificar os efeitos da idade e sexo, potenciais fatores de confusão, sobre as habilidades de discriminação dos modelos LDA obtidos para diferenciar pacientes com cada tipo de câncer a partir dos controles.

a análise de subgrupo.

para avaliar os efeitos de estágio do câncer, cada conjunto de dados foi dividida em um conjunto de acordo com o estágio da doença, incluindo controles correspondentes sub-dados e analisados ​​utilizando a análise ROC em cada conjunto de dados.

Software

MATLAB ( os Mathworks, Natick, MA) foi utilizado para os cálculos de média e SD, o Mann-Whitney

U

-teste, a análise ROC, two-way ANOVA, ADLs e LOOCV. GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA), também foi utilizado para a análise da curva ROC. LogXact (Cytel, Cambridge, MA) foi utilizado para a análise c-logística.

Resultados

As características dos indivíduos

A tabela 1 resume as características dos sujeitos neste estudo . Os conjuntos de dados composta por 200 pacientes LC e 996 controles, 199 pacientes do GC e 985 controles, 199 pacientes CRC e 995 controles, 198 pacientes aC e 976 controles, e 134 pacientes de PC e 666 controles (Tabela 1). O tamanho da amostra para cada tipo de câncer foi maior do que em relatórios anteriores [25] e forneceu poder estatístico suficiente para testar a robustez dos perfis PFAA para diagnóstico de câncer.

Não houve diferenças significativas no índice de massa corporal ( IMC) entre os conjuntos de dados (Tabela 1). A perda de peso devido à desnutrição, portanto, não era esperado para influenciar os resultados. Embora tenham sido observadas diferenças significativas na média de idade entre os conjuntos de dados (LC,

p Art 0,05; GC,

p Art 0,05; e PC,

p

0,001), os efeitos parecem ser relativamente menor porque os valores absolutos dessas diferenças foram pequenas (Tabela 1)

para LC, GC, CRC, e BC, fases da doença foram determinados de acordo com a sexta edição. do tumor-nódulo-metástase (TNM) Classificação de tumores malignos [38] União Internacional Contra o Câncer (UICC). Para PC, o palco foi determinada de acordo com o sistema de estadiamento Jewett [39]. Para todos os tipos de câncer, uma grande proporção dos pacientes tinham doença em estágio inicial. As frações de pacientes em cada fase de acordo com o tipo de câncer foram os seguintes: ~ 50% fase I, ~ 10% estágio II, -25% fase III, e -15% fase IV para LC; -60% Fase I, -15% estágio II, ~13% fase III, e -12% fase IV para GC; ~ 35% estágios 0 e I, ~ 25% estágio II, ~ 30% do estágio IV, e ~ 10% fase IV para CRC; ~ 5% fase 0, -25% fase I, ~ 25% fase II e fase III -7% para BC; e -75% fase B, ~13% fase C e -12% fase D para PC (Tabela 1).

Os pacientes com cada tipo de câncer poderia ser subdividida com base no tipo histológico (por LC , GC, CRC, e BC) ou pontuação de Gleason (para PC), como está resumido na Tabela S1. As características dos 34 pacientes de pólipos do cólon, bem como o tabagismo dos pacientes também são resumidos na Tabela S1.

perfis PFAA compartilhada entre cânceres

A análise univariada foi utilizado para comparar os perfis PFAA do pacientes com câncer e controles. As diferenças nos níveis de significância de cada um dos aminoácidos entre os pacientes e os controles estão apresentados na Figura 2A. Os resultados da análise ROC está representado na Figura 2B, porque os níveis de significância depender do tamanho da amostra. As concentrações e proporções de cada perfil de aminoácidos para ambos os pacientes e controles são apresentados nas Tabelas S2. E as AUC do ROC e seus IC de cada aminoácido são mostradas na Tabela S3 (concentração) e Tabela S4 (razão), respectivamente

Os resultados do teste de Mann-Whitney

L

. – teste (A) e característica receptor-operador (ROC) análise da curva (B) são indicados. A. Células coloridas indicam que a concentração ou proporção é aumentada em pacientes com cancro a p 0,001 (vermelho), p 0,01 (laranja), e p 0,05 (rosa), e diminuiu em pacientes com cancro a p 0,001 (azul) , p 0,01 (céu azul), e p 0,05 (azul claro), respectivamente. B. eixos mostrar a AUC do ROC para cada aminoácido a discriminar os pacientes de controlo. Concentrações e proporções de cada paciente com câncer e o conjunto de dados agrupados são indicados, respectivamente. linhas arrojadas pretos indicam o ponto onde a AUC da ROC = 0,5.

Two-way ANOVA foi utilizado para avaliar os potenciais efeitos de confusão de gênero, idade e tabagismo. Corrigindo esses fatores não afetou muito os níveis de significância de cada aminoácido, sugerindo que seus efeitos sobre os perfis PFAA foram menores (Tabela S5)

.

As concentrações plasmáticas de Gln, Trp, e Sua foram significativamente menores em todos os tipos de câncer, exceto PC, e nenhum dos aminoácidos mostraram aumento da concentração em todos os tipos de câncer (

p Art 0,05). Os rácios de Trp e Sua significativamente foram reduzidos, enquanto as de Pro e Orn foram aumentados, em todos os cancros (

p Art 0,05) (Figura 2)

Para examinar ainda mais a compartilhado. características entre pacientes com câncer, os perfis PFAA foram comparados utilizando um conjunto de dados em pool, incluindo todos os pacientes e controles de câncer. Notavelmente, os aminoácidos que foram afetados por este tipo de análise teve diferenças significativas na concentração e proporção: 11 aminoácidos (ASN, Gln, Cit, Vai, Met, Leu, Tyr, Phe, His, Trp, e Arg) mostraram diminui, enquanto que quatro aminoácidos (Ser, Pro, Gly, e Orn) aumenta expostas (Figura 2). Alterações em Gln, Trp, His, Pro, e Orn foram detectados na análise de todos os tipos de cancro. Alterações nestes aminoácidos pode, portanto, refletir alterações características no metabolismo que são comuns a todos os tipos de câncer.

Os perfis específicos para cada PFAA

câncer

Além das mudanças que eram comuns a todos os tipos de câncer , foi detectada alteração nos perfis PFAA que eram específicas para cada tipo de doença (Figura 2). Em geral, as concentrações da maioria dos aminoácidos foram diminuídos em pacientes com CCR e GC, enquanto que não há tendências claras nas concentrações de aminoácidos foi observada nos outros grupos (Figura 2). Além disso, alguns dos aminoácidos mostrou tendências opostas em diferentes tipos de cancro. Por exemplo, as concentrações de Thr foram diminuídos em pacientes com CCR e GC, mas aumentada em pacientes com CM (Figura 2). Estas variações nos perfis PFAA pode refletir as características específicas de cada câncer, em contraste com o conjunto limitado de aminoácidos que são responsáveis ​​pelas alterações metabólicas compartilhados por todos os tipos de câncer.

mudanças nos perfis PFAA em cânceres em estágio inicial

pacientes em estágio inicial

Apesar de alterações nos perfis PFAA de pacientes com câncer avançado cachexic têm sido bem documentadas, poucos relatos ter considerado. No entanto, uma grande fracção de pacientes com cancro no conjunto de dados actual estavam nas fases iniciais da doença (Tabela 1). As diferenças nos perfis PFAA de acordo com o estágio da doença foram, pois, examinadas para cada câncer (Figura 3, Figura S1, Tabela S3, S4 Tabela).

Os eixos mostrar a AUC do ROC para cada aminoácido para discriminar pacientes de controlos. A. Comparação de concentrações de pacientes e controlos cancerosas. B. Comparação de proporções de pacientes e controles de câncer. Escala, como descrito para a Figura 2. Para LC, GC, CRC, e BC, estágios do câncer foram determinados de acordo com a União Internacional Contra o Câncer TNM Classificação dos Tumores Malignos, 6ª edição [38], e para PC, estágios do câncer foram determinados de acordo com a sistema de estadiamento Jewett [39].

em particular, as alterações nos perfis PFAA foram detectados em todos os pacientes, incluindo aqueles nas fases iniciais da doença, no estudo atual. Todas as concentrações de amino-ácidos e proporções foram drasticamente diminuída em pacientes com doença fase inicial, independentemente da progressão subsequente. Em particular, a diminuição significativa de cada uma das concentrações de aminoácidos foram observadas em pacientes de CRC e GC (Figura 3A), e mudanças em cada proporção foram notável em todos os pacientes de cancro (Figura 3B).

cancro na fase inicial pacientes são geralmente assintomáticas. Além disso, a maior parte dos sujeitos no presente estudo não mostram perda de peso significativa (um sintoma típico dos pacientes caquéticos) (Tabela 1), a anorexia, ou diminui na concentração de albumina no soro (dados não mostrados). As mudanças nos perfis PFAA em pacientes com câncer, portanto, pareceu ser independente de quaisquer efeitos causados ​​pela má nutrição resultante da progressão do tumor.

Discriminando pacientes e controles de câncer pelos perfis PFAA

Os resultados da análises uni sugeriu que os pacientes e controles de câncer poderiam ser discriminado por meio de análise multivariada. Assumindo que a presença de cancro e as concentrações ou proporções dos perfis PFAA foram variáveis ​​objectivos e explicativas, respectivamente, LDA foi capaz de distinguir pacientes com cancro dos controles correspondentes, com selecção variável. Os resultados da seleção de variáveis ​​são indicadas na Tabela 2 (concentração) e Tabela S6 (ratio), respectivamente.

As habilidades de discriminação para cada paciente com câncer foram avaliados utilizando a AUC do ROC do escore de discriminar e Não foram encontrados como sendo 0,75 em todos os casos (Tabela 3 e Tabela S7). Na análise concreta, AUC para a discriminação de pacientes com base nas concentrações de aminoácidos e rácios, respectivamente, também foram estimados como segue: (IC 95%: 0.766~0.838) 0,802 e 0,802 (95% CI: 0.767~0.837) para LC ; (IC 95%: 0.816~0.882) 0,849 e 0,816 (95% CI: 0.780~0.852) para GC; (IC 95%: 0.842~0.906) 0,874 e 0,881 (95% CI: 0.851~0.910) para CRC; (IC 95%: 0.741~0.815) 0,778 e 0,778 (95% CI: 0.741~0.815) para BC; e (IC 95%: 0.740~0.826) 0,783 e 0,779 (IC 95%: 0.740~0.819) para PC (Tabela 3 e Tabela S7). A análise discriminante foi, portanto, capaz de distinguir adequadamente entre os diferentes tipos de câncer paciente.

Seleção de variáveis ​​também foi realizada para cada paciente com câncer. Oito aminoácidos foram seleccionadas em mais do que dois dos cinco tipos de cancros: Gln, Ala, Val, Ile, His, Trp, Orn, Lys e para as concentrações (Tabela 2A); e Ser, Gln, Vai, Met, His, Trp, Lys, Arg e para as proporções (Tabela S6). Quatro dos aminoácidos (Gln, Vai, His, e TRP) entre cada conjunto foram selecionados para ambas as variáveis ​​explicativas (Tabela 2 e Tabela S6). Estes aminoácidos foram semelhantes aos associados com todos os tipos de cancro, tal como indicado pela análise univariada (Gln, Trp, His, Pro, e Orn).

Por outro lado, alguns ácidos aminados incorporados no LDA modelo não foram identificados como aminoácidos significativas, por análise univariada. Por exemplo, a concentração Val não mostraram uma alteração significativa na análise univariada (Figura 2A), mas foi incorporado no modelo de LDA (Tabela 2). Uma vez que as concentrações plasmáticas de cada um dos aminoácidos são metabolicamente ligados uns aos outros, pode haver uma correlação potencial que não pode ser detectada por análise univariada sozinho. De facto, o coeficiente de correlação de Spearman parcial entre Val e cancro (ou não) foi -0,127 (p 0,001), enquanto que o coeficiente de correlação entre estes dois factores foi 0,035 (não significativa). Portanto, este sugeriu que o modelo LDA obtido reflectiu a rede metabólica de PFAAs, que não eram aparentes análise univariada completa.

Uma vez que os resultados obtidos podem ter sido sobre-optimized, LOOCV foi realizado para gerar uma análise imparcial . Isto produziu AUC similares aos obtidos para LDA, sugerindo que não houve evidente sobre-optimização nos modelos LDA obtidos (Tabela 3 e Tabela S7).

análises de subgrupo dos conjuntos de dados, divididos de acordo com a fase do cancro, incluindo controles correspondentes, foram então realizados para avaliar a capacidade dos perfis PFAA para distinguir entre fases do cancro, para cada tipo de doença. Em qualquer fase de cada cancro, a AUC da curva ROC foi encontrado para ser maior do que 0,75, o que sugere que os modelos LDA obtidos seria, assim, espera-se que seja eficaz na detecção precoce, bem como cancros do estádio avançado (Tabela 3 e Tabela S7).

também foram avaliadas as capacidades de discriminação para todos os pacientes com câncer. As AUCs do ROC para ambas as concentrações e proporções foram de 0,796 (IC 95%: 0.779~0.814) e 0.785 (95% CI: 0.767~0.803), respectivamente (Tabela 3 e Tabela S7). Nomeadamente, a maioria dos 19 aminoácidos foram estatisticamente seleccionado para estes discriminações: 16 para as concentrações de 12 e por as proporções. Mesmo utilizando uma classificação difícil, independentemente do tipo de câncer, foi possível discriminar entre pacientes e controles com alta precisão, e as contribuições globais de inúmeros aminoácidos pode refletir as mudanças características de grande escala associados ao metabolismo do câncer.

Uma análise c-logística, utilizando fatores correspondentes (sexo e idade) foi realizada para cada conjunto para avaliar e corrigir possíveis fatores de confusão de dados.