Abstract

O cancro do pulmão é o tumor maligno mais comum ea principal causa de mortes por câncer em todo o mundo. Enquanto fumar é de longe a principal causa de cancro do pulmão, outros factores ambientais e genéticos influenciar o desenvolvimento e progressão do cancro. Desde padrões de mutações únicas têm sido observadas em amostras de câncer individuais, identificação e caracterização do cancro do pulmão distintivo perfil molecular é essencial para o desenvolvimento de terapias mais eficazes, adaptados. Até recentemente, sequenciamento de DNA personalizado para identificar mutações genéticas em câncer era impraticável e caro. Os recentes avanços tecnológicos no seqüenciamento de DNA de última geração, como o Ion Torrent plataforma de sequenciamento à base de semicondutores, fez o custo de sequenciamento de DNA e tempo de efetivo com resultados mais confiáveis. Usando o Torrent Cancer Panel Ampliseq Ion, nós seqüenciados 737 loci de 45 genes relacionados com o cancro para identificar mutações genéticas em 76 amostras de câncer de pulmão humano. O sequenciamento revelou mutações missense em KRAS, EGFR, e genes TP53 nas amostras de câncer de mama de vários tipos histológicos. Assim, este estudo demonstra a necessidade de sequenciar cancros humanos individuais, a fim de desenvolver drogas personalizadas ou terapias combinadas para atingir efetivamente indivíduo, as mutações específicas do cancro da mama

Citation:. Cai X, Sheng J, Tang C, Nandakumar V, Ye H, Ji H, et al. (2014) Mutações freqüentes nos genes EGFR, KRAS e TP53 no câncer de pulmão humano tumores detectados por Ion Torrent DNA Sequencing. PLoS ONE 9 (4): e95228. doi: 10.1371 /journal.pone.0095228

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 25 de julho de 2013; Aceito: 25 de março de 2014; Publicação: 23 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Cai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelos subsídios da National Natural Science Foundation da China, o Jieping Fundação Wu, e do Instituto Nacional de Saúde (R01 CA90427 R01 AI084811 para SY Chen). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Chuanning Tang, Hua Ye, Feng Lou, Dandan Zhang, Hong Sun, Haichao Dong , Guangchun Zhang, Zhiyuan Liu, Zhishou Dong, Baishuai Guo, Ele Yan, Chaowei Yan, Lum Wang, Ziyi Su, e Yangyang Li são funcionários da San Vale Biotechnology, Inc. Este não altera a adesão dos autores para todo o PLoS One políticas em matéria de dados e materiais de partilha.

Introdução

o cancro do pulmão é o tumor maligno mais comum em todo o mundo, e também a principal causa de mortes relacionadas ao câncer. Em 2008, cerca de 1,61 milhões de novos casos foram registrados em todo o mundo, sendo responsável por 12,7% de todos os novos cancros [1]. Além disso, cerca de 1,38 milhões de mortes (18,2% do total de mortes de câncer) foram relatados em todo o mundo [2]. Na China, o cancro do pulmão tem a maior incidência de todos os novos casos de câncer em homens e mulheres (21,7% em 2008), com mais de uma taxa de mortalidade de 24,9% [2]. Mulheres na China registrou apenas uma incidência ligeiramente maior de câncer de pulmão sobre o câncer de mama neste mesmo ano; No entanto, a taxa de mortalidade de cancro do pulmão é mais de 3 vezes maior do que de cancro da mama (20,2% versus 6,1%, respectivamente) [2]. O câncer de pulmão geralmente apresenta sintomas não específicos, e diagnóstico geralmente ocorre em um estágio avançado ou após a metástase já ocorreu [3]. Enquanto continuam os esforços para melhorar o diagnóstico precoce e tratamento do câncer de pulmão, a incidência impressionante, mau prognóstico, ea taxa de mortalidade considerável prevalece.

A principal causa de câncer de pulmão é o tabagismo e aumento da exposição está diretamente correlacionado com o aumento do risco de desenvolver câncer de pulmão [4]. 85-90% das mortes por câncer de pulmão estão associados ao tabagismo e os fumadores são 15 vezes mais probabilidade de morrer de câncer de pulmão do que nunca fumaram [5]. Existem duas formas principais de cancro do pulmão: cancro de células não pequenas do pulmão (NSCLC) e cancro do pulmão de células pequenas (SCLC). NSCLC, que responde por cerca de 85% de todos os cânceres de pulmão, pode ser dividida em três principais subtipos histológicos: carcinoma de células escamosas (SCC), adenocarcinoma e cancro do pulmão de células grandes. Enquanto fumar pode ser atribuído a todas as formas de câncer de pulmão, é mais comumente ligada a SCLC e SCC. Que nunca fumaram, por outro lado, são mais vulgarmente diagnosticada com adenocarcinoma [3], [5]. Curiosamente, apenas 10-24% dos fumantes desenvolvem câncer de pulmão, indicando a importância de outros fatores genéticos e ambientais individuais [6], [7]. Além do fumo do tabaco, outros agentes etiológicos e fatores de risco foram identificados, incluindo a ocupação, a exposição ao fumo de segunda mão, amianto, gás radônio e poluição do ar, além de fatores genéticos [8] – [10]. Cerca de 10-15% dos cancros do pulmão surgem em pacientes que nunca se declararam ter fumado e estes cancros fazê-lo espontaneamente com um acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas [5].

Apesar dos esforços em curso para melhorar o rastreio e tratamento de pulmão cancros, o prognóstico de pacientes com a maioria das formas de cancro do pulmão continua pobre [3]. Uma vez que os factores genéticos e ambientais que provocam o cancro do pulmão variar amplamente, cada tumor tem o potencial de apresentar um perfil único de mutação genética. Como tal, a acumular evidência sugere que as terapias individualizadas, adaptadas são essenciais para o tratamento eficaz contra cancros do pulmão. Isto pode ser conseguido perfilando genoma do cancro do indivíduo, para dissecar os mecanismos oncogénicas que regulam a progressão do cancro. Recentemente, uma nova tecnologia baseada no seqüenciamento de semicondutor chamado Ion Torrent sequenciamento [11] está a resolver muitos dos problemas associados com outros métodos de sequenciamento, ou seja, o custo, o tempo e praticidade geral do sequenciamento do genoma individualizada. Neste estudo, utilizou-se Ion Torrent sequenciamento para analisar 76 amostras de câncer de pulmão clínicos para identificar as mutações genéticas em 737 loci de 45 genes relacionados com o cancro conhecidos.

Resultados

A análise da mutação do ser humano tumores de câncer de pulmão com Ion Ampliseq Painel cancro

Um total de 76 amostras de cancro do pulmão (Tabela 1) foram analisados ​​usando o Painel de cancro da Ion Torrent Ampliseq para identificar mutações em 737 loci de 45 oncogenes e genes supressores de tumor em cancros do pulmão humanos . Estas amostras de câncer de pulmão foram todos de pacientes chineses que variam de 28-80 anos de idade representados por 40 homens, com idade média de 62 anos e 36 mulheres, com idade média de 59 anos.

Os dados sequenciado foram processados ​​e as mutações identificadas usando v3.0 Ion Torrent Software suite com um plug-in “variante chamador”. A fim de eliminar a chamada base de erro, foram usadas três passos de filtragem para gerar chamada variante de confiança, como descrito nos Materiais e Métodos. A distribuição ler Sequência entre 189 produtos de amplificação gerados a partir de 76 amostras de FFPE foram normalizados para 300.000 leituras por amostra (Fig. 1). Usando um estrito chamada variante padrão, foram identificadas mutações em genes seguintes, como listado na Tabela 1:. BRAF, EGFR, erbB2, KRAS, PIK3CA, PTEN, SMAD4, e TP53

. Distribuição de cobertura média de cada amplicon. Os dados são apresentados como média ± DP. B. Número de amplicons com uma determinada profundidade ler, ordenados em caixas de 100 leituras. (Barras azuis número actual dos amplicons alvo dentro de profundidade leitura, linha vermelha apresenta% dos amplicons alvo = leitura de profundidade)

As amostras foram classificadas com base em sua origem como adenocarcinoma de pulmão, de grandes células de pulmão. carcinoma, carcinoma de células escamosas do pulmão e carcinoma neuroendócrino do pulmão. As diferentes fases dos cânceres evoluíram para foram marcados com base no «Comité americana conjunta sobre o cancro tamanho /Tumor, linfonodos afetados, Metástases (AJCC /TNM)” sistema (Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa, IIIb) e como metástase e cânceres de pulmão não-metástase. Além disso, os cânceres foram classificados como de fumantes pesados, luz-fumantes e não-fumantes para verificar a correlação de fumar com a acumulação destas mutações. A lista detalhada de mutações pontuais missense, inserções e deleções perfilado em 737 loci de amostras de cancro do pulmão 76 é fornecida na Tabela S1.

Dentre as mutações identificadas no nosso conjunto de amostras, BRAF (2,6%), EGFR (42,1%), ERBB2 (1,3%), KRAS (5,3%), PIK3CA (2,6%), PTEN (1,3%), SMAD4 (1,3%) e TP53 (22,4%) incorridos as maiores taxas de mutações (Tabela 2 ). As frequências de mutação em seus diferentes níveis de diferenciação (Tabela 3), no estadiamento AJCC diferente (Tabela 4), dos cancros do pulmão metastáticos e não-metastáticos (Tabela 5) e de pacientes com diferentes hábitos de fumo (Tabela 6) estão descritas no mesas. análise de sequenciação detalhada nos exons e domínios funcionais destes genes foi portanto executada.

distribuição mutação missense nos exons e domínios funcionais de EGFR

Dentre 76 amostras de câncer de pulmão seqüenciados, 36,1% das mutações EGFR foram missense junto exão 19, 50,0% eram missense junto exão 21, 5,6% ao longo do exão 20 e 8,3% ao longo do exão 18 (Fig. 2A). Estas mutações foram em e em torno do domínio de tirosina quinase de EGFR (Fig. 2B-3C). As mutações de activação do domínio tirosina-quinase do

EGFR

gene estimula a quinase de tirosina de proteína, o que leva à activação de vias de sinalização associadas ao crescimento e sobrevivência celular. As mutações no domínio extracelular do EGFR é muitas vezes associado com a amplificação de genes em outros cancros [12]. 57,7% dos cancros do pulmão associados ao EGFR eram adenocarcinomas (Tabela 2) e 86,7% de mutações EGFR associados a cancros ‘elevada diferenciação “(Tabela 3). Em nossa amostra estabeleceu 50% dos cancros do pulmão associados ao EGFR metástase para regiões locais, 27,3% a lymphs e 46,2% dos cancros metastáticos para órgãos distantes do nosso conjunto de amostras (Tabela 5).

A. Frequências de mutações detectadas em diferentes exons. distribuição B. A mutação em exons. distribuição C. A mutação em domínios funcionais.

A. Frequências de mutações detectadas em diferentes exons. distribuição B. A mutação em exons. distribuição C. A mutação em domínios funcionais.

distribuição mutação missense nos exons e domínios funcionais de KRAS

Dentre 76 amostras de câncer de pulmão seqüenciados, 100% das mutações KRAS foram missense junto exão 2 (Fig. 3A). A 34G T mutações resultam numa substituição de aminoácidos na posição 12 em KRAS, a partir de uma glicina (G) para uma cisteína (C) ou uma valina (V). A 64C uma mutação resulta em uma substituição de aminoácido na posição 22 a partir de uma glutamina (Q) a uma lisina (K) na KRAS. Todas estas substituições de aminoácidos ocorreu ao longo do domínio de ligação ao GTP de KRAS (Fig. 3A-C). KRAS se liga ao GTP no estado activo e possui uma actividade enzimática intrínseca que cliva o fosfato terminal do nucleótido, convertendo-a em PIB. Após a conversão de GTP em GDP, KRAS é desligada [13]. O resultado destas mutações é a ativação constitutiva da

KRAS

vias de sinalização. Uma vez que é ligado, ele recruta e ativa proteínas necessárias para a propagação de fator de crescimento e sinais de outros receptores tais como c-Raf e PI3-quinase [13]. 7,7% dos cancros do pulmão KRAS-associados eram adenocarcinomas (Tabela 2) e 6,1% de mutações KRAS associados a cancros ‘baixa diferenciação “e 7,4% de mutações KRAS foram cancros’ meados de diferenciação” (Tabela 3). Em nossa amostra definida 6,3% dos cancros do pulmão associada à KRAS metástase para regiões locais, 9,1% para lymphs e 5,1% dos cancros metastáticos para órgãos distantes em nosso conjunto de amostras (Tabela 5).

distribuição de mutação sem sentido na exons e domínios funcionais de TP53

anormalidade do gene TP53 é um dos eventos mais significativos em cancros do pulmão e desempenha um papel importante na tumorigênese de células epiteliais do pulmão. O gene supressor de tumor p53 está localizado no cromossoma 17p13 e se estende por 20 kb de ADN genómico abrangendo os exões 11 que codifica uma fosfoproteína 53KD [14]. A maioria das mutações de TP53, agrupam-se o domínio de ligação ao ADN do gene TP53, que abrange os exões 5 a 8 e se estende por aproximadamente 180 ou 540 codões de nucleótidos e não está limitada a algumas sequências particulares ou codões ao longo deste gene [15]. TP53 efectuadas várias mutações deletérias no nosso conjunto de amostras de 76 cancros do pulmão, principalmente ao longo do domínio de ligação de DNA codificado de exão 5 (27,8%), 6 (16,7%), 7 (33,3%), 8 (16,7%), e ao longo o domínio de oligomerização codificadas a partir de exon 10 (15,6%) (Fig. 4A-C). A maioria das mutações de TP53 missense conduzir à síntese de uma proteína estável, que não tem a sua função de ligação de ADN e de transactivação específica e acumula-se no núcleo das células. Tais proteínas mutantes se tornar inactivo e não têm a capacidade de transactivar os genes alvo a jusante que regulam o ciclo celular e apoptose [16]. Para além destas mutações que afetam o papel de TP53 como uma proteína de supressor de tumor, as mutações do gene TP53 também dotar a proteína mutante com “ganho de função ‘atividades (GOF), o que pode contribuir activamente para várias fases de progressão tumoral, incluindo metástases à distância , e a um aumento da resistência aos tratamentos anticancerígenos [17] – [19]. 50,0% dos cancros do pulmão TP53-associados eram carcinoma de células escamosas (Tabela 2) e 20,0% das mutações TP53 associados a cancros ‘elevada diferenciação “e 25,9% das mutações do gene TP53 foram cancros’ meados de diferenciação” (Tabela 3). Em nossa amostra definida 25,0% dos cancros do pulmão TP53-associados metástase para regiões locais, 54,5% a lymphs e 12,8% dos cancros metastáticos para órgãos distantes do nosso conjunto de amostras (Tabela 5).

A. Frequências de mutações detectadas em diferentes exons. distribuição B. A mutação em exons. distribuição C. A mutação em domínios funcionais.

Múltiplas mutações e pontos quentes de mutação em cancros do pulmão humanos

O sucesso clínico com terapia combinada individualizada baseia-se na identificação de combinações de mutação e padrões para co -Administração de uma combinação única ou de agentes alvo contra as combinações de mutações detectadas. Algumas das mutações detectadas no nosso grupo de tumor por meio da análise de sequenciação não eram única repetição frequente e também ocorreu, mas em combinação com outras mutações. cancros do pulmão em nosso conjunto de amostras continha a seguinte: 64,5% das amostras tinham pelo menos uma ou mais mutações missense, 19,7% tinham pelo menos duas ou mais mutações missense, 3,9% tinham pelo menos três ou mais mutações missense, 1,3% tinham pelo menos quatro ou mais mutações missense, e 35,5% das amostras efectuadas há mutações deletérias em qualquer um dos selecionados 13.500 loci do potencial supressor de tumor e oncogenes (Tabela 7).

Discussão

como o câncer de pulmão é o câncer mais prevalente e principal causa de mortes por câncer em todo o mundo, os esforços em curso são destinadas a melhorar a prevenção, diagnóstico e opções de tratamento eficaz para pacientes com câncer de pulmão. Atualmente há uma gama de opções de tratamento para pacientes com câncer de pulmão, com a cirurgia, sendo o mais eficaz para o tratamento de CPNPC, e quimioterapia com ou sem terapias de radiação como o tratamento padrão para CPPC. Porque a maioria CPPC metástase cedo para órgãos distantes, a cirurgia é muitas vezes ineficaz na cura desta cancro. CPNPC, por outro lado, são mais propensos a permanecer localizada durante o desenvolvimento, e são, portanto, são mais eficazmente tratados com intervenção cirúrgica. Além disso, CPPC são tipicamente muito mais sensível à quimioterapia e /ou terapia de radiação que são CPNPC [20], [21]. Um desafio na classificação e tratamento de câncer de pulmão adequada é a extrema heterogeneidade causada por diferentes propriedades genéticos, biológicos e clínicos, incluindo a resposta ao tratamento, com mais de 50 variantes histológicas reconhecidos pelo sistema de digitação OMS [22], [23]. Devido a isso, a classificação correta dos casos de câncer de pulmão é necessário para assegurar que os pacientes recebam uma melhor gestão [24].

Devido a estes vários níveis de heterogeneidade, tratamentos generalizadas pode ser menos eficaz. Alternativamente a terapia dirigida, que envolve o uso de drogas especialmente concebidos para direccionar selectivamente vias moleculares correlacionadas com o fenótipo maligno de células de cancro do pulmão, pode ser mais útil [25]. Vários genes comumente encontrado para ser transformado em vários tipos de câncer de pulmão têm sido relatados, incluindo ALK /ELM4 fusão, K-

ras

, EGFR, VEGF e p53, mas todo o perfil genético de cada formulário é ainda não foi totalmente definido [3]. Isto indica a necessidade de cancros do pulmão humanos sequenciação individuais, a fim de coincidir com o uso de um único medicamento alvo ou dois ou mais fármacos em combinação alvejados contra mutações específicas do cancro do pulmão indivíduo. Neste estudo utilizamos Ion Cancer Panel Ampliseq para sequenciar 13.500 loci em 45 genes relacionados ao câncer, principalmente oncogenes e genes supressores de tumor, de 76 amostras de câncer de pulmão humano. Foram identificadas mutações frequentes em um grupo de genes, incluindo o EGFR, KRAS, e TP53 (Tabela 2). Embora a maioria desses genes já eram conhecidas para ser associado com câncer de pulmão, os pontos de mutantes e as mutações associadas em outros genes eram diferentes em nosso conjunto de amostras (Tabelas 7).

Como há uma crescente consciência sobre as mudanças em células de câncer de pulmão nos últimos tempos, novos medicamentos que visam especificamente estas mudanças têm sido desenvolvidos. Estas drogas orientadas quer trabalhar em sinergia com os fármacos de quimioterapia ou por si só com muito menor toxicidade devido a um efeito selectivo como uma alternativa a uma modulação mais sistémica de proteínas associadas à oncogénese. inibidores de EGFR (afatinib, erlotinib, gefitinib e e) inibidores de VEGF (bevacizumab), são actualmente utilizadas para as terapias de alvo para os doentes com NSCLC com mutações no VEGF e de EGFR [26]. Erlotinib é uma droga que bloqueia EGFR de sinalização da célula para crescer. Ela impede a progressão do câncer de pulmão, especialmente em mulheres não-fumantes, e é usado principalmente no tratamento avançado NSCLC que não foi responsivo à quimioterapia. É também usado como o primeiro tratamento em pacientes cujos cancros têm uma mutação no

EGFR

gene [27]. Cetuximab é um anticorpo monoclonal que tem como alvo EGFR, que também é usada em NSCLC avançado em combinação com quimioterapia padrão como parte da primeira linha de tratamento [28]. Como erlotinib, afatinib é uma droga que bloqueia o sinal de crescimento de EGFR e utilizados para CPNPC avançado que têm mutações no

EGFR

gene [29]. Alguns, não-fumantes mais jovens com adenocarcinomas são encontrados para ter uma /EML4 oncogene fusão ALK que atualmente é um alvo para a droga Crizotinibe [30]. Outros fármacos actualmente utilizados para o tratamento de cancros do pulmão não são específicos de gene, e, em vez alvo vias gerais moleculares como anitmetabolites folato (metotrexato e pemetrexed), inibidores da mitose (docetaxel, piclitaxel, e vinorelbina), inibidores da topoisomerase (Etopophos e topotecano) e nucleósido análogos que interferem com a síntese de ADN (carboplatina, cisplatina, e gemciabine) [31], [32]. Os inibidores de tirosina-quinase dirigida-EGFR são estabelecidas para ser uma opção de tratamento eficaz para NSCLC avançado que não respondem à quimioterapia. No entanto, os anticorpos monoclonais dirigidos-EGFR em combinação com quimioterapia de primeira linha-base de platina, cetuximab combinado com cisplatina /vinorelbina e bevacizumab em combinação com quimioterapia à base de platina resultou em uma melhor sobrevivência em comparação com apenas quimioterapia em doentes com NSCLC avançado EGFR-positivo [ ,,,0],33]. Outras terapias-alvo, incluindo inibidores duplos e multi-quinase estão em estágios iniciais de desenvolvimento clínico [34].

Com o acúmulo de conhecimento e experiência em tecnologias de próxima geração, é necessário ampliar a nossa compreensão da sensibilidade do mutações específicas para terapias individualizada. Portanto, reunindo um perfil completo de mutações em cancros do pulmão para a aplicação da terapia-alvo personalizado e adaptado é fundamental para desenvolver tratamentos contra o cancro futuras. Acreditamos que uma ferramenta de genotipagem mais rápido e de baixo custo, tais como tecnologia de sequenciamento Ion Torrent vai ser muito benéfico para a atribuição de tais terapêuticas específicas no futuro próximo usar para cancros do pulmão.

Materiais e Métodos

ética declaração

o estudo foi aprovado pelo Comitê de ética em Pesquisa da Primeira Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Dalian, China. Para fixados em formalina e embebidos em parafina amostras (FFPE) tumorais do banco de tecidos de tumor no Departamento de Patologia do hospital, o comité de ética institucional dispensou a necessidade de consentimento. Todas as amostras e dados médicos utilizados neste estudo foram irreversivelmente anónimos.

As informações do paciente

amostras tumorais utilizadas no estudo foram coletadas a partir do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Dalian, China. Foram analisados ​​um total de 76 amostras tumorais FFPE de pacientes com câncer de pulmão. A idade média dos 76 pacientes foi de 61 anos (variação: 28-80 anos). Destes, 40 pacientes eram do sexo masculino com idade média de 61 anos (variação: 28-80 anos), e 36 pacientes eram do sexo feminino, com idade média de 61 (intervalo: 36-75 anos). amostras de tumor utilizadas no estudo foram coletadas a partir do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Dalian, China. Foram analisados ​​um total de 76 amostras tumorais FFPE de pacientes com câncer de pulmão. A idade média dos 76 pacientes foi de 61 anos (variação: 28-80 anos). Destes, 40 pacientes eram do sexo masculino com idade média de 61 anos (variação: 28-80 anos), e 36 pacientes eram do sexo feminino, com idade média de 61 (intervalo: 36-75 anos). 33 dos 76 pacientes (20 homens, 13 mulheres) foram classificados como baixa diferenciação patológica; 27 (14 homens, 13 mulheres) em meados, 15 (6 homens, 9 mulheres) com alto e 1 mulheres de diferenciação desconhecido. AJCC estadiamento do câncer é a seguinte: 0 pacientes em I ou IA; 18 (10 homens, 8 mulheres) na fase Ib; 3 (2 homens, 1 mulher) em IIa estágio; 9 (5 homens, 4 mulheres) na fase IIb; 26 (14 homens, 12 mulheres) no estádio IIIa; 8 (4 homens, 4 mulheres) no estádio IIIb; 0 pacientes em estágio IIIC; e 12 (5 homens, 7 mulheres) na fase IV. Do total de 76 pacientes, 16 dos 40 homens não relataram história de tabagismo, ao passo que nenhuma das 36 mulheres relataram ser fumantes; 6 homens relataram luz de fumar; 17 homens relataram tabagismo pesado, e um homem com uma história de tabagismo desconhecido.

preparação de ADN

DNA foi isolado de amostras de FFPE após desparafinização e extração de 3-5 ^ m parafina espessa em xileno, utilizando o Kit QIAamp DNA Mini (Qiagen) por instruções do fabricante.

Ion torrente PGM preparação biblioteca e sequenciamento

Um Ion Torrent biblioteca ligado adaptador foi feito seguindo o protocolo do fabricante para o Ion AmpliSeq biblioteca Kit 2.0 (Life Technologies) (Part # 4475345 Rev. A). Resumidamente, 50 ng amplicões foram reunidas reparado nas extremidades, e ligase de ADN foi utilizada para ligar iões Torrent adaptadores P1 e A. Após purificação com AMPure grânulos (Beckman Coulter, Brea, CA, EUA), os produtos ligados foram adaptador-nick-translation e amplificado por PCR, num total de 5 ciclos. grânulos AMPure (Beckman Coulter) foram usadas para purificar a biblioteca resultante, e um Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) e Agilent Bioanalyzer ADN de alta sensibilidade LabChip (Agilent Technologies) foram usadas para determinar a concentração e tamanho da biblioteca.

emulsão de amostra de PCR, quebra de emulsão, e o enriquecimento foram realizadas utilizando o kit de molde 200 Xpress Ion PGM (Parte # 4474280 Rev. B), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, uma concentração de entrada de um molde de ADN de cópia /Iões Esfera Partículas (FSI) foi adicionado à emulsão de PCR Master Mix e a emulsão gerado usando um misturador IKADT-20 (Life Technologies). Em seguida, os ISPs foram recuperados e ISP-molde positivo foram enriquecidas para uso com Dynabeads grânulos MYONE Estreptavidina C1 (Life Technologies). ISP enriquecimento foi confirmada utilizando o fluorímetro Qubit 2,0 (Life Technologies). 316 chips foram usados ​​para a sequenciação do Ion Torrent PGM durante 65 ciclos e as amostras foram código de barras. Ion PGM Kit 200 A sequenciação foi utilizado para reacções de sequenciação, de acordo com o protocolo recomendado (Parte # 4474004 Rev. B). O conjunto de dados foi depositado com o NIH Sequence Leia Archive, e o número de acesso é SRP028756 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?study=SRP028756).

Variant chamando

os dados dos PGM corridas foram processados ​​inicialmente usando o software gasoduto específico da plataforma Ion Torrent Torrent suite para gerar sequência lê, aparar as sequências de adaptador, filtrar e remover pobres sinal perfil lê. variante inicial chamando a partir dos dados de sequenciação Ion AmpliSeq foi gerado usando v3.0 Torrent Software Suite com um programa plug-in “variante chamador”. A fim de eliminar chamadas de base errônea, foram utilizados três etapas de filtragem para gerar chamada variante final. O primeiro filtro é estabelecida em uma profundidade média de cobertura total 100, cada cobertura variante 20, uma variante de frequência de cada amostra de 5, e P-valor 0,01. A fim de eliminar o erro de chamada de base, foram utilizados vários passos de filtragem para gerar finais variante de chamada (Fig. S1.). O primeiro filtro é estabelecida em uma profundidade média de cobertura total de 100, uma cobertura de cada variante de 20, uma variante de frequência de cada amostra de 5 e P-valor 0,01. O segundo filtro foi empregado por mutações visualmente examinando utilizando software (IGV) Integrative Genomics Viewer (http //www.broadinstitute.org /igv) ou Samtools software SAMtools de software (https://samtools.sourceforge.net), bem como por filtrando os possíveis erros específicos de Strand, ie. uma mutação única foi detectada em qualquer um “+” ou “-” Strand, mas não em ambas as cadeias de ADN. O terceiro passo de filtração foi definido como variantes dentro de 727 pontos de acesso, de acordo com as instruções do fabricante. O último passo do filtro foi eliminar variantes em AMPL339432 amplicão (PIK3CA, exon13, CHR3: 178.938.822-178.938.906), que não é único combinado no genoma humano. Do nosso sequenciamento é executado utilizando o Painel Cancer Ion Ampliseq, os dados de exclusão falsos foram gerados a partir do locus do gene JAK2 e, portanto, os dados de sequenciamento deste lócus foram excluídos da análise posterior.

mutações somáticas

Detectado mutações foram comparados com variantes no Projeto 1000 Genomas [35] e 6500 exomes do National Heart, Lung, and Blood Institute exome projeto de sequenciamento [36] para distinguir mutações somáticas e mutações germinativas.

Bioinformatical e validação experimental

aplicadas

Foi utilizado o COSMIC [37] (versão 64), banco de dados MyCancerGenome (https://www.mycancergenome.org/) e algumas publicações para avaliar mutações reaparecimento, em câncer de pulmão (Tabela S1). Além disso, algumas mutações missense detectados foram confirmadas por sequenciação de Sanger (Fig. S2).

A análise estatística

Nós selecionamos reaparecimento missense somática /in-del mutações de câncer de pulmão para fazer a análise estatística.

Informações de Apoio

Figura S1.

processo de Filtro de variantes. Nota: (a) variantes Strand-tendenciosa foram eliminados usando Integrative Genomics Visualizador de software (IGV) (http //www.broadinstitute.org /igv); (B) variantes em AMPL339432 deve ser eliminada, porque este não é único fragmento amplificado corresponde a PIK3CA no genoma humano; (C) Toda a nossa análise estatística baseou-se nos dados na caixa azul e doi:. 10.1371 /journal.pone.0095228.s001

(DOCX)

Figura S2. validações

Sanger de 15 variantes

doi: 10.1371. /journal.pone.0095228.s002

(DOC)

Tabela S1.

Frequências de mutações pontuais, de inserção e deleção mutações em 737 loci de 76 cancros do pulmão humanos

DOI: 10.1371 /. journal.pone.0095228.s003

(DOCX)

gostaríamos de agradecer Rong Shi no Jieping Fundação Wu, Dr. Haibo Wang, Zhi Yu, Ying Li e outros membros do San Vale Biotechnology Inc. Pequim por sua assistência na amostra e coleta de dados. Também gostaríamos de agradecer a equipe do Hospital Militar de Beijing por seu generoso apoio para a sequenciação de ADN e coleta de dados.