Abstract

Fundo

Programado ligando-1 morte (PD-L1) foi identificado como um fator associado com mau prognóstico em uma variedade de tipos de câncer, e foi relatado para ser principalmente induzido por perda de PTEN em gliomas. No entanto, o efeito clínico da PD-L1 e sua regulação pelo PTEN ainda não foi determinada em câncer colorretal (CRC). No presente estudo, verificou-se a regulação da PTEN em PD-L1 e determinou ainda mais o efeito de PTEN sobre a correlação entre parâmetros de expressão e clínicos PD-L1 no CRC.

Métodos /Resultados

abordagem interferência de RNA foi usada para regular a expressão de PTEN em SW480, SW620 e células HCT116. Foi demonstrado que a proteína DP-L1, mas não ARNm, foi significativamente aumentado nas células transfectadas com ARNsi de PTEN em comparação com o controlo negativo. Além disso, a capacidade de PTEN para regular a expressão de DP-L1 não foi obviamente afectados pelo IFN-γ, o principal indutor de PD-L1. Tissue microarrays imuno-histoquímica foi utilizado para detectar PD-L1 e PTEN em 404 amostras de pacientes de CRC. A sobre-expressão de DP-L1 foi significativamente correlacionado com metástase distante (P 0,001), fase TNM (P 0,01), a progressão metastático (P 0,01) e expressão de PTEN (P 0,001). A análise univariada revelou que pacientes com alta expressão de PD-L1 apresentaram uma sobrevida global pobres (P 0,001). No entanto, a análise multivariada não apoiar PD-L1 como um fator prognóstico independente (P = 0,548). Univariada (P 0,001) e sobrevivência multivariada (P 0,001) a análise de 310 pacientes de CRC localizados revelou que elevado nível de expressão de DP-L1 foi associado com o aumento dos riscos de progressão metastático. Além disso, o efeito clínico da PD-L1 no CRC não foi estatisticamente significativa em um subgrupo de 39 pacientes com nenhuma expressão de PTEN (metástases à distância: P = 0,102; TNM fase: P = 0,634, a sobrevida global: P = 0,482).

Conclusões

PD-L1 pode ser utilizada para identificar pacientes com CCR com alto risco de metástases e mau prognóstico. Esta manifestação clínica pode ser parcialmente associada com a expressão de PTEN

Citation:. Canção M, Chen D, Lu B, Wang C, Zhang J, Huang L, et al. (2013) Perda PTEN Aumenta PD-L1 Protein Expression e afeta a correlação entre PD-L1 Expressão e parâmetros clínicos em câncer colorretal. PLoS ONE 8 (6): e65821. doi: 10.1371 /journal.pone.0065821

editor: Jun Sun, Rush University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de dezembro de 2012; Aceito: 28 de abril de 2013; Publicação: 13 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Song et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por Sun Yat-sen University “100 talentos Programa”; Guangdong Programa Innovative Research Team (2009010058); Ciência e Tecnologia da Informação Bureau of Guangzhou, Guangdong (2011J5200009); Guangdong Provincial do Departamento de Ciência e Tecnologia (2012B050500004); e “985 Projecto” de Sun Yat-sen University e Guangdong Translational Plataforma Pública Medicina (4.202.037). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CCR) é a segunda principal causa de mortes por câncer nos países ocidentais. Globalmente, é o terceiro câncer mais comumente diagnosticado em homens e o segundo câncer mais comumente diagnosticado em mulheres [1]. O que é pior é que a mortalidade de CRC continua a aumentar em muitos países com câncer colorretal metastático (mCRC), sendo a principal causa de morte na maioria dos pacientes. pacientes com CCR fase inicial tiveram uma taxa de sobrevivência de cinco anos de até 90%, mas a taxa pode cair para pacientes montante 60% com envolvimento de gânglios linfáticos, e até mesmo para baixo para 10% quando as metástases estão presentes [2]. No entanto, é difícil detectar o mCRC na fase inicial apenas com base nos sintomas, o que leva a complicada tomada de decisão de tratamento, muitas vezes incluindo terapia ou tratamento feriados agressivos. Um biomarcador que possa identificar pacientes com alto risco de metástases e mau prognóstico poderia ter aplicações clínicas gerais. Estudos que buscam esses biomarcadores são abundantes. PD-L1 é um dos principais sujeitos de pesquisa biomarcador.

PD-L1 (também conhecido como CD274, B7-H1), um dos ligandos para uma morte celular programada (TP-1), é um do receptor imuno-inibidora pertencente a CD28 /T citotóxicos ao antigénio de linfócitos 4 (CTLA-4) família. Ele pode fornecer um sinal inibidor para DP-1 /B7-1 expressando células T, resultando em deficiência imune [3], [4]. proteína PD-L1 é muitas vezes expresso em células T activadas, células B, células NK, as DCs, macrófagos, mastócitos e células derivadas de medula óssea [5]. PD-expressão de L1 também é encontrado em uma vasta gama de tumores humanos. Além disso, os estudos relativos de expressão de DP-L1 para a evolução da doença ter sido feito na maioria dos tumores, e os resultados mostram que a expressão de DP-L1 se correlaciona fortemente com o prognóstico desfavorável no rim [6], do ovário [7], bexiga [8], mama [9], no fígado [10], gástrica [11], e cancro pancreático [12], mas não no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) [13]. Mais importante ainda, esses estudos revelam que a maior expressão de PD-L1 pode facilitar o avanço do estágio do tumor e aumentar o potencial de invasão. No entanto, em CRC, ainda não foi determinado o efeito clínico de PD-L1 e o seu mecanismo de regulação.

PD-L1 expressão pode ser induzida por diversos mediadores inflamatórios e citocinas, da qual o interferão-γ (IFN γ) é o mais potente. Tem sido demonstrado que tanto o tipo I e tipo II IFNs regular a expressão de DP-L1 na maioria das linhas celulares de cancro. Poucos estudos focam o papel regulador do PD-L1 em ​​tumores. Além disso, estes estudos produziram resultados divergentes. Um estudo recente indica que a perda de PTEN supressor de tumor (fosfatase e homólogo tensina suprimida no cromossoma dez) pode ser um mecanismo importante que aumenta a expressão de DP-L1 em ​​linhas de células de glioma e amostras de tumor de pacientes [14]. PTEN é um importante gene supressor de tumor, que regula negativamente principalmente a célula-a sobrevivência de sinalização da cinase B (AKT) via PI3K-proteína [15], [16]. Além disso, os estudos mostraram que se acumulam PTEN pode ser um gene que importante associado com a metástase do tumor [15], [17], [18]. Tanto no

vitro Comprar e no

vivo

experimentos de CRC mostrou que PTEN controla o potencial tumorigénico e metastático. Relata-se que a injecção de células-PTEN deficiente em ratinhos resultou em muito mais metástases pulmonares e “multi-local” do que a injecção de células de controlo [19]. Além disso, alguns dados clínicos indicam que a perda de detecção de PTEN por imunocoloração foi associada com doença avançada, a metástase do fígado e a sobrevivência do paciente pobre [20] – [22]. No entanto, alguns estudos recentes não suportam o papel de PTEN na regulação da expressão PD-L1. Foi dito que “expressão PD-L1 foi modulado por meio de diferentes vias, entre diferentes tipos de células de tumor” [23].

é bem conhecido que a PD-L1 é um regulador negativo da imunidade anti-tumoral potente, mas é Desconhece-se se este efeito de escapar imune é suficiente para torná-PD-L1 um fator distinto associado com mau prognóstico para todos os tipos de cânceres humanos. Por outro lado, PTEN foi identificada como um factor fundamental em diversos processos centrais do desenvolvimento do cancro, e como um gene importante para o diagnóstico e prognóstico do cancro. Após a recente descoberta de que a expressão da proteína PD-L1 correlacionada com a perda de PTEN [14], que entrou para a hipótese de que a progressão do tumor e expressão PD-L1 são independentemente relacionada com a perda de PTEN, e que o efeito clínico de PD-L1 pode, em menos em parte, ser atribuído à correlação entre a perda de PTEN e expressão PD-L1.

no presente estudo, primeiro analisou o efeito da perda de PTEN na expressão PD-L1 em ​​linhas celulares de CRC, e determinou se o efeito observado mantida na presença de IFN-γ. Em segundo lugar, foi avaliada a associação da expressão de PD-L1 com a evolução da doença e de expressão de PTEN em 404 pacientes com CCR com um seguimento médio de 5 anos. Por último, nós investigamos o significado clínico da PD-L1 em ​​um subgrupo de 39 pacientes com perda completa PTEN para explorar se o efeito de PD-L1 no CRC é dependente da expressão de PTEN.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi aprovado pelos conselhos de revisão institucionais de Sun Yat-Sen University (Guangzhou, China) e consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente.

Coleta de Amostras e Cultura celular

neste estudo, 404 amostras fixadas em formalina, embebidos em parafina de CRC foram obtidos a partir do banco de tumores do Departamento de Patologia do primeiro Hospital Filiado, Sun Yat-Sen University (Guangzhou, China ). Estes 404 pacientes que tinham sido diagnosticados com CRC e submetidos à ressecção cirúrgica inicial para CRC entre janeiro de 2000 e novembro de 2006 foram de acompanhamento por telefone ou cartas de uma cirurgia até abril de 2010 para recolher informações gerais, relatórios de patologia, e as informações sobre os pacientes ” condição após a cirurgia.

Três linhas de células de CRC, SW480, SW620 e HCT116 foram adquiridos a Culture Collection da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China), e cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina -streptomycin a 37 ° C em 5% de CO

2

a interferência RNA (RNAi)

Para baixo-regular a expressão de PTEN, os ARNic em cadeia dupla específicas destinadas PTEN humana (sentido: 5. ‘-GAGCGUGCAGAUAAUGACAdTdA-3′; anti-sentido: 3’-dAdTCUCGCACGUCUAUUACUGU-5 ‘) foram sintetizados e foram adquiridos à RiboBio Co. Ltd. (Cantão, China), e ARNic em cadeia dupla com sequências não específicas foram utilizadas como controlo negativo (CN). SiRNA transfecção foi realizada com lipofectamina 2000 (Invitrogen, CA, EUA) com uma concentração de 100 nM. A eficiência de transfecção foi testada por qRT-PCR e Western blot. Estas experiências foram realizadas na presença e na ausência de IFN-γ humana recombinante (500 UI /mL, Peprotech, NJ, EUA) e repetida em triplicado.

quantitativa de transcrição reversa PCR (qRT-PCR)

Quarenta e oito horas após a transfecção, o RNA celular total foi extraído com o reagente TRIzol (Invitrogen, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. O ADNc foi derivada a partir de 500 ng de ARN total utilizando cDNA kit de transcrição reversa (Toyobo, Osaka, Japão). Depois, PCR em tempo real foi realizado utilizando o kit de quantitativa SYBR Green PCR (Takara Bio, Dalian, China) em ABI 7500 RT-PCR System (Applied Biosystems, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Os iniciadores utilizados são listados na Tabela 1, PTEN e nível de expressão do gene em relação PD-L1 foi analisada utilizando o comparativo C

método T (também referido como o

-ΔΔCT método 2). Detalhes da

método comparativo C T foram previamente descritos [24], [25]. Resumidamente, três amplificações de PCR foram realizadas em duplicado para cada amostra. β-actina foi utilizado como um controlo interno. A média C

T foi calculada para ambas as genes alvo e β-actina. O ôc

T foi determinada por (a média dos valores de sub>

valores de T para β-actina). O ΔΔC

T representada a diferença entre as linhas celulares emparelhados, onde PTEN ΔΔC

T = ôc

T de células transfectadas com ARNsi menos ôc

T de controlo negativo e PD-L1 ΔΔC

T = ôc

T de células tratadas com IFN-γ menos ôc

T das células de controlo não tratadas. O nível de expressão relativa foi expressa como 2

-ΔΔCT.

Western Blot

Setenta e duas horas após a transfecção, as células foram lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS ) e lisadas com tampão RIPA (Dingguo, Pequim, China) suplementado com inibidores de protease e fosfatase (Merck Bioscience, Darmstadt, Alemanha). Em seguida, os níveis de proteína foram determinadas usando PTEN de duas cores fluorescentes western blotting sobre o sistema de imagem de infravermelhos Odyssey (LI-COR, Nebraska, EUA) como previamente descrito [26]. Em resumo, quantidades iguais de proteína foram separadas por 10% de dodecil sulfato de sódio-electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidos para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Pall, Nova Iorque, EUA). As membranas foram então bloqueados com BSA a 5% durante 1 h e incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C [O anticorpo primário: de coelho anti-PTEN (diluído 1:10000, Epitomics, CA, EUA); De coelho anti-Akt (diluído 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, EUA); De coelho anti-fosfo-Akt

Ser473 (diluído 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, EUA); Rato anticorpo β-actina (diluído 1:10000, Proteintech, Chicago, EUA)]. No dia seguinte, depois de incubação com anticorpos secundários conjugados fluorescentes de espécies apropriadas para 1 h à temperatura ambiente, as membranas foram analisados ​​utilizando o sistema de imageamento infravermelho Odyssey.

Citometria de Fluxo

PD-L1 expressão na superfície da célula foi determinada utilizando citómetros de fluxo. As células foram colhidas e incubadas com PD-L1 anti-humano PE-Cy7 (eBioscience, CA, EUA) ou anticorpo de controlo do mesmo isotipo (eBioscience, CA, EUA) durante 30 minutos no escuro em gelo (0,5 ug anticorpos para 10

5 células em um volume final de 100 ul). Depois as amostras foram lavadas três vezes, as células coradas foram re-suspensas e analisados ​​em BD FACSCanto II (BD Biosciences, CA, EUA) utilizando o software FlowJo (Tristar, CA, EUA). intensidades de fluorescência normalizados foram calculados dividindo as intensidades de fluorescência média de anticorpos específicos por as intensidades de fluorescência média de controlo de isotipo igualado. Todos os dados foram coletados a partir de três experimentos independentes. A significância estatística foi determinada por amostras pareadas

t

teste.

Tissue Microarray (TMA) e imuno-histoquímica (IHQ)

TMA foram construídos utilizando instrumento tissue microarray automatizado (ALPHELYS, Plaisir, França). Depois de identificar os H lâminas E-manchado por tecido tumoral ideal, duas biópsias núcleo cilíndrico (2 mm de diâmetro) foram perfurados a partir de cada fixados em formol, blocos de tecido embebidos em parafina e vestida de beneficiários blocos de TMA (2 × 3 cm) como descrito anteriormente [27], [28]. Cada bloco TMA inclui 108 núcleos de tecido de 54 pacientes. Posteriormente blocos receptores foram cortados em secções de 5 mícrons e aderiu às lâminas de vidro silanizadas para coloração IHC.

IHC foi realizada utilizando o super HRP Elivision ™ (Mouse /Rabbit) Kit IHC (Maixin-Bio, Fuzhou, China) de acordo com as instruções do fabricante. Após deparaffinised em xileno e re-hidratadas numa série de álcoois graduados (100%, 95%, 75%), as lâminas foram recuperados antigénio em tampão de citrato de sódio (pH 6,0) em microware. Em seguida, as lâminas foram incubadas com 3% H

2O

2 para bloquear o soro de cabra peroxidase endógena e para bloquear a ligação não específica. Em seguida, as lâminas foram incubadas com anticorpo PD-L1 (diluído 1:500, Abcam, Hong Kong, China) ou anticorpo de PTEN (diluído 1:600, Abcam, Hong Kong, China) durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, as lâminas foram incubadas com o agente de amplificação (reagente A, Elivision Super fornecimento Kit) e polimerase (reagente B, Super Elivision fornecimento Kit). Por último, as lâminas foram coradas com DAB e contrastadas com hematoxilina (40 segundos). Um controle negativo usando diluição do anticorpo como substituto de anticorpos primários foi realizada para cada experimento.

Coloração Avaliação

Para cada ponto, uma imagem digital em 2592 × 1944 pixels de resolução a 100 × ampliação foram capturados por o microscópio Leica DMI 4000B invertida (micro-sistemas Leica, Wetzlar, Alemanha). coloração imuno-histoquímica da imagem foi analisada por meio do programa Image Pro-Plus (versão 5.0, Media Cybernetics, Silver Spring, EUA), introduzido por Xavier [29]. Em resumo, a área de tumor foi seleccionado como a área de interesse (AOI), e a soma área e densidade óptica integrada (IOD) da AOI foram seleccionados como os parâmetros de medição. PD-L1 e índice de expressão de PTEN igualou o quociente entre o IOD ea área total da AOI. Por fim, o índice médio de expressão para cada duplicado foi usada para análise estatística.

Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o v.17.0 SPSS (SPSS Inc, Chicago, EUA). software X-telha (versão 3.6.1, Yale University School of Medicine, New Haven, EUA) foi utilizado para determinar o ponto de corte único optimizado para a curva de sobrevivência. Todos os valores de P foram dois lados e P . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Associações de PD-L1 expressão /PTEN com parâmetros clínicos foram avaliados utilizando Wilcoxon rank sum (para duas populações que estão relacionados) ou Kruskal- Wallis (para mais do que duas populações que são relacionados) porque os dados de PD-L1 índice de expressão /PTEN não é consistente com uma distribuição normal (teste de Shapiro-Wilk: P 0,001). A sobrevida global (OS) e sobrevida livre de metástases (MFS) foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier. Sendo diagnosticados como metástase durante o seguimento nos pacientes localizado CRC (pM0) foi definida como o evento terminal para análise MFS. As associações de PD-L1 expressão /PTEN com a evolução da doença foram avaliados utilizando modelos de regressão de riscos proporcionais de Cox. O ponto de corte ideal único para PD-L1 expressão /PTEN que os pacientes separados em um grupo com PD-L1 /PTEN maior expressão e um grupo com PD-L1 /PTEN menor expressão foram construídos por software X-telha, como descrito anteriormente [23 ], [24]. associações similares e análise de sobrevida foi realizada no subgrupo de 39 pacientes sem qualquer expressão de PTEN, que representa o grupo no qual o papel de confusão de PTEN é controlado.

Resultados

Não PTEN perda, mas IFN -γ Expressão induzida PD-L1 de ARNm em linhas de células de CRC

Tanto o nível de ARNm e o nível de proteína de PTEN diminuiu em células transfectadas com ARNsi de PTEN em comparação com o controlo negativo. O nível de ARNm de PTEN foi reduzida para cerca de 12,4% em SW480, SW620 em 14,6%, 22,6% em HCT116 às 48 h após a transfecção em células transfectadas com ARNsi de PTEN em comparação com o controlo negativo (Fig. 1. A). Não houve diferença significativa no nível de ARNm de DP-L1 entre as células transfectadas com ARNsi de PTEN e o controlo negativo. Em contraste, o nível de ARNm de DP-L1 aumentou significativamente em células que foram expostas a IFN-γ em comparação com as células de controlo combinado sem exposição ao IFN-γ (cerca de 8 dobras) (Fig. 1 B).

(a) o nível de expressão relativa de ARNm de PTEN (detectado por qRT-PCR, calculada por 2

-ΔΔCT método) em quatro grupos: as células transfectadas com ARNsi de PTEN ou sequências não específicas na presença ou ausência de IFN -γ. (B) O nível de expressão relativa de ARNm de DP-L1 em ​​quatro grupos de células. Os dados foram coletados a partir de três experimentos independentes. As barras de erro representam SD.

Ambos IFN-γ e perda de PTEN expressão induzida PD-L1 Protein no CRC

Foram avaliadas as consequências de PTEN knockdown na ativação da Akt na presença /ausência de IFN-γ. A fosfo-Akt

Ser473 aumentada nas células transfectadas com ARNsi de PTEN em comparação com o controlo negativo, independentemente da presença de IFN-γ (Fig. 2). a expressão da proteína PD-L1 foi significativamente aumentado nas células transfectadas com ARNsi de PTEN em comparação com o controlo negativo (P 0,05). Além disso, a presença de IFN-γ não alterou esta situação da linha de base (Fig. 3).

O nível de expressão da proteína de PTEN, Akt e fosfo-Akt

Ser473 foram determinados por Western blotting. β-actina foi utilizada para verificar o carregamento igual. Imagens representativas são seleccionados a partir de experiências realizadas em triplicado repetidas

nível de expressão da proteína PD-L1 na superfície de SW480, SW620 e HCT116 foi determinada por citometria de fluxo:. as células transfectadas com ARNsi de PTEN (linhas vermelhas) e células transfectadas com sequências não específicas (linhas azuis), na ausência de IFN-γ; As células transfectadas com ARNsi de PTEN (linhas pretas) e células transf ectadas com sequências não específicas (linhas de laranja) na presença de IFN-γ; células marcadas com o anticorpo de controlo de isotipo (área sombreada). intensidade de fluorescência padrão de proteína PD-L1 foi descrito por histograma no painel direito: células tratadas com (coluna branca) ou não tratados (coluna cinzenta) com o IFN-γ. Os dados foram coletados a partir de três experimentos independentes. As barras de erro representam SD. . (* P 0,05 sub-amostras pareadas

t

test)

IFN-γ induzido proteína PD-L1 com duas estruturas diferentes na linha de células SW480

A citometria de fluxo histogramas mostrou dois picos de células SW480 tratados com IFN-γ (500 UI, 72 horas), enquanto houve apenas um pico distinto único no grupo não tratado. Além disso, apenas um único pico distinto foi observada em células SW620 e células HCT-116 ambos na presença e na ausência de IFN-γ (Fig. 3). Para determinar se estes dois picos foram ou dependente da dose dependente do tempo, que tratado com células SW480 diferente de dosagem de IFN-γ durante 48 horas. proteína PD-L1 foi maximamente aumentada a 500 UI /ml de IFN-γ. efeito de tempo-curso de IFN-γ na proteína PD-L1 foi determinada posteriormente. SW480 foi tratada com 500 UI /ml de IFN-γ para 0, 24, 48 e 72 horas. Os resultados mostraram que na presença de IFN-γ, independentemente da dose de IFN-γ e o tempo de tratamento, a proteína DP-L1 com duas estruturas diferentes foi reconhecido na superfície de células SW480 (Fig. 4).

(a) SW480 tratados com IFN-γ na concentração indicada (0 UI /ml, 50 UI /ml, 100 UI /ml, 500 UI /mL, 1000 UI /ml). (B) SW480 tratada com 500 UI /ml de IFN-γ por vezes acusados ​​(0 h, 24 h, 48 h e 72 h). A área sombreada representa SW480 sem tratamento de IFN-γ, e números ao lado de picos representam a intensidade de fluorescência padrão de PD-L1. Imagens representativas são selecionados a partir de experimentos realizados repetidas em triplicado

acompanhamento do paciente

Entre os 404 pacientes, 5 pacientes ( 3%). tinha sido perdido no final acompanhamento, 110 pacientes (27,2%) morreram em um tempo médio de acompanhamento de 2,7 anos (variação: 0.1-9.1 anos), e os restantes 288 pacientes tiveram um tempo médio de acompanhamento de 5,8 anos (intervalo: 0,1 -10.2 anos). Quando IHC foi realizada, o tecido de 57 pacientes foi lavado fora das lâminas de vidro e os restantes 347 pacientes tinham dados de imuno-histoquímica. Não houve diferença na sobrevida global entre os pacientes com e sem dados de imuno-histoquímica (P = 0,716, teste log-rank). Também não houve diferença significativa na progressão metastática (diagnosticados como metástase após a cirurgia) taxas entre pacientes com e sem dados de imuno-histoquímica (12,4% e 14,0%, P = 0,682).

Correlação de PD-L1 /PTEN Expression e parâmetros clínicos

A coloração imuno-histoquímica de PD-L1 localizado no sistema de membrana celular e endomembrane teve um índice de expressão variou 0-15,9 (média: 2,33) (Fig 5. A

1-D

1, A

2-D

2). PTEN foi localizado no citoplasma com um índice de expressão variou 0-54,7 (média: 5,57) (Fig. 5. E

1-G

1, E

2-G

2) .Há foi de 39 pacientes que não tinham expressão de PTEN (Fig. 5. H

1, H

2).

(A

1, A

2, E

1 , E

2) controle negativo; (B

1, B

2, F

1, F

2) As amostras do mesmo paciente com progressão metastática; (C

1, C

2, G

1, G

2) Amostras de outro paciente sem progressão metastática; (D

1, D

2) Um representante típico que mostraram que a expressão de DP-L1 é elevada na área do tumor (T), em comparação com aqueles da mucosa normal adjacente (N); (H

1, H

2) As amostras de paciente sem qualquer expressão de PTEN; (J, K) A análise estatística demonstrou que a expressão de DP-L1 está aumentada em pacientes com a progressão metastático, quando comparada com aqueles sem progressão metastático, enquanto que tal análise estatística de PTEN não foi significativa. (Dois de painéis, coradas com anticorpo PD-L1, dois painéis para baixo, corados com anticorpo PTEN), (a

1-H

1, × 100; A

2-H

2, × 400)

Como mostrado na Tabela 2, os pacientes com maior expressão PD-L1 foram mais propensos a apresentar metástases à distância (pM) (p . 0,01), características adversas patológicas (2007 classificação TNM) (P 0,01), e progressão metastático (P 0,001) expressão (Fig. 5. J), e PD-L1 foi correlacionada com a expressão de PTEN em certa medida (P 0,001). Não houve diferença estatisticamente significativa entre os sexos, idade, localização do tumor, classificação do tumor primário (PT), comprometimento de linfonodos regionais (PN), ou recorrência após a cirurgia. Por outro lado, a expressão de PTEN não teve associação significativa com as variáveis ​​primárias (PT: P = 0,221; PN: P = 0,131; pM: P = 0,525; estágio TNM: P = 0,337; recorrência: P = 0,397; progressão metastática: P = 0,710 ). A sobrevida global ea sobrevida livre de metástase também não foi associada com a expressão de PTEN (P = 0,366, P = 0,141, respectivamente) (Fig. 6. C, D).

(A, B) do sistema operacional e MFS foram significativamente menores em pacientes de L1-superior-expressão de DP, quando comparada com pacientes com PD-L1-inferior-expressão de ambos (P 0,001). (C, D) O sistema operacional e MFS não foram significativamente diferentes entre os pacientes PTEN-maior-expressão e os pacientes PTEN-lower-expressão (OS, P = 0,366; MFS, P = 0,141). (E) No subgrupo de 39 pacientes com perda de PTEN completa, expressão PD-L1 foi não está mais associado com o sistema operacional (P = 0,482).

Análise de Sobrevivência

Análise do software X-telha revela que 1,49 foi o ponto de corte ideal que separou os pacientes em um grupo com PD-L1 maior expressão e um grupo com PD-L1 menor expressão. A curva de Kaplan-Meier eo teste de log-rank mostrou que a taxa de sobrevida global de pacientes com menor expressão PD-L1 foi significativamente maior do que os pacientes com maior expressão PD-L1 (Fig 6A, χ2 = 13,964, P . 0.001). A taxa OS 5 anos foi de 62,9% para os pacientes com maior expressão PD-L1 e 81,1% para os pacientes com menor expressão PD-L1. Na análise multivariada por Cox modelo de riscos proporcionais, PD-L1 não foi um fator prognóstico independente para CRC após o ajuste para as variáveis ​​que atendem a premissa de PH (idade, localização do tumor, grau de diferenciação, pT, pN, PM, progressão metastática) (P = 0,548). No entanto, se as variáveis ​​que significativamente associados com a expressão de DP-L1 (pM, progressão metastático) não foram ajustadas para a análise multivariada, expressão PD-L1 tornou-se um preditor significativo para CRC (P 0,01). (Tabela 3)

Como mostrado em nossos resultados, PD-L1 inclinados a associar com as variáveis ​​metástase. Então, para continuar a determinar a associação de PD-L1 com câncer progressão metastática, estudamos o subconjunto de 310 pacientes com CRC localizada (pM0), dos quais 28 (9,03%) evoluíram para metástases distantes em um seguimento médio de 5,14 anos ( gama, 0.06-10.14 anos). Neste subgrupo, expressão PD-L1 foi significativamente associada com sobrevida livre de metástases (MFS) (Fig 6B, χ2 = 21,444, P . 0.001). A taxa de MFS 5 anos foi de 99,5% para pacientes de menor expressão PD-L1 e 72,1% para os pacientes PD-L1-maior-expressão. Além disso, a análise de Cox revelou que a expressão PD-L1 foi um preditor significativo para a progressão metastática. (RR: 1.165; IC 95%: 1,072-1,268; P 0,001)

Curiosamente, no subgrupo de 39 PTEN pacientes -no-expressão, em que o efeito de confusão de PTEN em PD-L1 é controlada, expressão PD-L1 não foi mais associado com metástases à distância (P = 0,102), estadiamento TNM (P = 0,634), e análise de sobrevivência mostrou que não houve diferença significativa na sobrevida global entre o grupo de PD-L1-maior-expressão e grupo de menor expressão PD-L1 (Fig. 6E, χ2 = 0,494, P = 0,482).

Discussão

PD-L1 tem sido um dos principais temas de pesquisa com biomarcadores tumor na última década. Um grande número de estudos têm demonstrado uma correlação entre a agressividade do tumor e expressão da proteína PD-L1. No presente estudo, nós também forneceu fortes evidências de que um nível mais elevado de expressão PD-L1 no CRC facilita o avanço de fase e progressão tumoral metastático. A taxa de sobrevivência global dos doentes com menor expressão de DP-L1 foi significativamente mais elevada do que a de pacientes com maior expressão de DP-L1. Além disso, a expressão PD-L1 também foi significativamente associada à sobrevida livre de metástases nos 310 pacientes com CCR localizado. No entanto, a expressão PD-L1 não foi significativamente associada com prognóstico desfavorável após o ajuste para metástase e progressão metastática por análise de sobrevida multivariada. Isto é inconsistente com a observação anterior de que a expressão PD-L1 permanece associado com prognóstico desfavorável por meio de análise multivariada em pacientes renais carcinoma de células [6]. Uma explicação para esta discrepância pode ser as diferentes variáveis ​​que são ajustados no modelo multivariada. No estudo anterior, a variável de progressão metastática (diagnosticados como metástase após a cirurgia) não foi ajustado para na análise de sobrevivência multivariada. É bem conhecido que a metástase é a principal causa de morte em pacientes com CCR; Portanto, uma vez que ajustado para esta variável relacionada com a morte, PD-L1 não era mais um fator prognóstico independente para CRC.

evidências da literatura e nossa pesquisa mostrou que PD-L1 superexpressão está intimamente associada com a progressão do câncer ( especialmente com a progressão da metástase), fazendo de DP-L1 um biomarcador promissor e alvos terapêuticos para tumores. No entanto, o mecanismo pelo qual PD-L1 aumenta a progressão do cancro é mal compreendida. Como descrito na literatura, estas associações podem ser atribuídas à “escudo molecular” bem reconhecido fornecida por PD-L1. Foi relatado que o PD-L1 proporciona um efeito de “blindagem” para proteger as células de tumor da lise por células T citotóxicas. Além disso, PD-L1 foi encontrada para ter um efeito anti-apoptótico em células tumorais [3], [30]. No entanto, um em

vivo

estudo mostrou que a expressão transgénica de PD-L1 em ​​um rato ingênuo PD-L1-deficiente não alterou a sua tumorigenicidade [31]. No estudo multicêntrico de fase I, Brahmer et al declarou que o bloqueio mediada por anticorpos de PD-L1 induz a regressão do tumor durável e prolonga a estabilização da doença em pacientes com cancros avançados selecionados. Infelizmente, o câncer colorretal não é um desses cânceres selecione [32]. Nós saber se a capacidade de destruir o “escudo molecular” pode fornecer base adequada para esta associação clínica no CRC. Andrew T Parsa também sugerido que a extensão em que a expressão da proteína PD-L1 afecta directamente a progressão do cancro continua a ser determinado [14].

Neste estudo, para identificar os efeitos indirectos adicionais de expressão de DP-L1 na progressão do cancro , estudamos as vias de sinalização envolvidas na regulação da expressão de PD-L1 no CRC.