Abstract

Fundo

Nós informou recentemente que as células tumorais de cólon estimular macrófagos a liberar IL-1β, que por sua vez inactiva GSK3β e aumenta a sinalização de Wnt em células cancerígenas do cólon, gerando um auto amplificando loop que promove o crescimento de células tumorais.

principais conclusões

Aqui nós descrevemos que os macrófagos proteger as células HCT116 e HKE-3 de cancro do cólon da apoptose induzida por TRAIL. Inactivação de IL-1β por anticorpo neutralizante de IL-1β, ou silenciamento de IL-1β em macrófagos inibiu a sua capacidade de contrariar a apoptose induzida por TRAIL. Por conseguinte, a IL-1β foi suficiente para inibir a apoptose induzida por TRAIL. colapso induzida por TRAIL do potencial de membrana mitocondrial (Δψ) e activação de caspases foram impedidos pelos macrófagos ou por IL-1β recombinante. A inibição farmacológica da libertação de IL-1β de macrófagos por vitamina D

3, um potente agente quimiopreventivo de cancro colorectal, restaurou a capacidade de TRAIL para induzir apoptose de células tumorais em cultura com macrófagos. Os macrófagos e IL-1β não conseguiu inibir a apoptose induzida por TRAIL em células HCT116 que expressam dnIκB, dnAKT ou dnTCF4, confirmando que eles se opor a morte celular induzida por TRAIL através de indução da sinalização de Wnt em células tumorais. Nós mostramos que os macrófagos e IL-1β estabilizado Snail em células tumorais de um modo dependente de NF-kB /Wnt e que as células de tumor deficiente Snail não foram protegidos contra a apoptose induzida por TRAIL por macrófagos ou por IL-1β, demonstrando um papel crucial de Snail na resistência das células tumorais de trilha

significância

Nós identificamos um ciclo de feedback positivo entre as células tumorais e macrófagos que se propaga o crescimento e promove a sobrevivência de células cancerígenas do cólon:. células tumorais estimular macrófagos a secretar IL-1β, que por sua vez, promove a sinalização Wnt e estabiliza Snail em células tumorais, que confere resistência a TRAIL. A vitamina D

3 paradas Este ciclo de amplificação por interferir com a libertação de IL-1β a partir de macrófagos. Por conseguinte, a vitamina D

3 sensibiliza as células de tumor à apoptose induzida por TRAIL, o que sugere que a eficácia terapêutica de TRAIL pode ser aumentada por este agente quimiopreventivo prontamente disponíveis

citação:. Kaler P, Gálea V, G Augenlicht , Klampfer L (2010) Tumor Associated macrófagos Proteger células cancerígenas do cólon de apoptose induzida por TRAIL através de Estabilização Dependente IL-1β- de Snail em células tumorais. PLoS ONE 5 (7): e11700. doi: 10.1371 /journal.pone.0011700

editor: Dong-Jin Yan, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 13 Abril, 2010; Aceito: 27 de junho de 2010; Publicação: 22 de julho de 2010

Direitos de autor: © 2010 Kaler et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo CA 111361 (para LK), U54 CA 100.926 (para LA) e P30-13330 do Instituto Nacional do Câncer. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a inflamação contribui para a progressão do tumor através da criação de condições que suportam o crescimento de células tumorais e sobrevivência e aumentar o seu potencial metastático. Com efeito, a inflamação crónica tem sido demonstrado que predispõem ao desenvolvimento de uma variedade de tumores, sendo um exemplo marcante da doença inflamatória do intestino, a qual está associada com risco elevado de cancro do cólon [1]. Além disso, parece que os cancros do cólon que não se desenvolvem como uma complicação da doença inflamatória do intestino também são accionados por uma inflamação, uma vez que foi mostrado que a utilização regular de AINEs reduz a mortalidade a partir do cancro do cólon esporádica e resultados na regressão de adenomas nos pacientes FAP , que herdam uma mutação no gene APC [2]. factores solúveis que se propagam a inflamação pode ser produzida por células de tumor em si ou, mais frequentemente, por células recrutadas para o microambiente do tumor, tais como os macrófagos associados a tumores (TAMs). sinalização coordenada entre células tumorais e células não-malignas no microambiente do tumor é necessária para a progressão de tumores, e as vias de sinalização que regulam a diafonia entre as células de tumor do cólon e do estroma, tais como NF-kB e STAT3, surgiram como alvos importantes para quimiopreventivo e agentes quimioterapêuticos [3], [4]. Da mesma forma, os antagonistas de TNFa estão em fase I /II de ensaios clínicos e mostrou ser bem tolerada em pacientes com tumores sólidos [5], [6].

recentemente estabelecido que os macrófagos promover a sinalização de Wnt no cancro do cólon células e, assim, aumentar a sua proliferação, e demonstraram que os macrófagos exercem a sua actividade protumorigenic principalmente através da liberação de IL-1β [7], [8]. Aqui mostramos que factores derivados de macrófagos, além de suportar o crescimento de células tumorais, também promover a sobrevivência após tratamento com TNF-a apoptose relacionado com ligando indutor (TRAIL), um iniciador potente da via extrínseca da apoptose.

TRAIL inicia a apoptose através da ligação a dois receptores de morte, DR4 e DR5, enquanto que a ligação para os receptores de engodo que não possuem o domínio de morte, tais como DCR1, DCR2 e osteoprotegerina, inibe a sua actividade pró-apoptótica [9]. A ligação de TRAIL para induzir a morte receptores resultados DR4 /DR5 no recrutamento do domínio Fas -associated morte (FADD) para os receptores, o que inicia a ligação de pro-caspase-8 e pro-caspase-9, e a formação do complexo de sinalização indutor de morte (DISC) [9]. Em células do tipo I, ativação da caspase-8 é suficiente para ativar caspases efetoras 3, 6 e 7, enquanto que em células do tipo II, a cascata apoptótica exige a integração da via mitocondrial mediada por caspase-8 clivagem induzida de proposta.

as células tumorais são significativamente mais sensíveis à apoptose induzida por TRAIL que as células normais, estabelecendo TRAIL e anticorpos agonistas de DR4 ou DR5 como atraentes drogas anti-câncer. Na verdade, em contraste com outros membros da família TNF, tratamento de camundongos e primatas com regressão significativa induzida TRAIL recombinante de tumores sem toxicidade sistêmica [10], [11]. Recentemente, a combinação de TRAIL com todos acetato de trans-retinilo (rac) tem sido demonstrado que induzem apoptose selectivamente em polipose adenomatosa (APC) células epiteliais deficiente sem prejudicar cellsαα normal e tratamento de aPC

min

murganhos com TRAIL e RAC apoptose induzida em pólipos intestinais e sobrevivência dos animais prolongada [12].

no entanto, existem diferenças significativas na sensibilidade TRAIL entre células cancerosas humanas. A resistência à TRAIL tem sido demonstrado que se desenvolvem em células com mutante DR5 [13] ou em tumores deficientes em reparação de emparelhamentos incorrectos com mutações Bax [14]. Em contraste, c-Myc promove a capacidade de resposta às TRAIL inibindo a expressão da FLIP, um inibidor da TRAIL sinalização [15], e mediante a neutralização induzida por TRAIL regulação positiva de MCL-1 e cIAP2, duas proteínas com capacidade intrínseca para inibir a apoptose [ ,,,0],16]. Além disso, as células do estroma e factores solúveis presentes no microambiente do tumor ter sido demonstrado que têm um impacto significativo sobre a sensibilidade das células tumorais a agentes terapêuticos [17], [18].

TRAIL deficiente ratinhos exibem susceptibilidade aumentada carcinógeno para tumorigénese induzida e ter maior potencial metastático [19], [20], demonstrando que exerce uma actividade de TRAIL supressor de tumor e sugere um papel importante de TRAIL endógena na vigilância de tumores. De fato, os autores mostraram que TRAIL é, pelo menos em parte, responsável pela célula NK mediada, IFNy dependente, mecanismo de eliminação do tumor.

Neste estudo demonstramos que TRAIL induziu apoptose de células cancerígenas do cólon é inibida pela macrófagos derivados de IL-1β, e mostraram que os macrófagos e recombinante IL-1β neutralizar a apoptose induzida por TRAIL-através da activação de sinalização de Wnt e estabilização de Snail em células tumorais. Finalmente, são apresentados dados indicando que a “normalização” do microambiente do tumor pela vitamina D

3, um agente quimiopreventivo potente, restaura a sensibilidade de células de cancro do cólon para TRAIL, o que sugere que a eficácia terapêutica de TRAIL pode ser grandemente melhorada por agentes que inibem a crosstalk entre as células tumorais eo microambiente do tumor.

Materiais e Métodos

linhas celulares e co-cultura experimentos

o HCT116 e linhas de células de carcinoma colorectal-3 HKE , que diferem entre si apenas pela presença do alelo k-Ras mutante [21] e as células SW480 foram cultivadas em MEM, enquanto que as células 293T foram cultivadas em DMEM. A linha celular monocítica humana, THP1, foi cultivada em meio RPMI. monócitos humanos normais, 90% CD14 e CD11c positiva e receptor de célula inferior a 1% anti T positiva, foram adquiridos a partir de

Astarte Biologics

(Redmond, WA). As células tumorais e monócitos /macrófagos foram co-cultivados separados por transpo� inserções de uma membrana de policarbonato com tamanho de poro de 0,4 mm, que impedem o contato direto célula-célula, mas permitem a troca de fatores solúveis (Corning Incorporated, Lowell, MA).

para o ensaio clonogénico, HCT116 e células HKE-3 foram semeadas a uma densidade de 200 células por poço de uma placa de seis sozinho ou juntamente com THP1 macrófagos ou monócitos do sangue periférico para 7 dias. As células de tumor foram cultivadas com THP1 monócitos directamente (1600 por poço de uma placa de 6 poços), como células THP1 não anexar e colónias de formulário. A proporção óptima entre as células tumorais e macrófagos foi estabelecida anteriormente [7], [8]. As colónias foram fixadas e coradas com 6% de glutaraldeído e 0,5% de violeta de cristal e contadas utilizando total Lab software 1.1 (Nonlinear Dynamics, Durham, NC, EUA).

Ensaio de Apoptose

As células foram tratadas com TRAIL recombinante (50 ng /ml, que foi determinada a concentração óptima) sozinho ou na presença de macrófagos, IL-1β (5 ng /ml) ou TNFa (10 ng /ml) durante 7 horas. As células foram ressuspensas em tampão hipotónico (0,1% de Triton X-100, 0,1% de citrato de sódio) e coradas com iodeto de propídio (50 ug /ml) durante 4 horas a 4 ° C como descrito [22]. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo e a distribuição do ciclo celular e a extensão da apoptose (células com um teor de ADN subG1) foram analisados ​​por o

Modfit

software. potencial de membrana mitocondrial foi determinada por citometria de fluxo utilizando o corante fluorescente de JC-1 (

Invitrogen). As células foram coradas com 1 uM de JC1 durante 1 hora a 37 ° C, lavadas com PBS e analisadas por fluorescência no canal FL2. As células foram tratadas com TRAIL para ~ 7 horas e foram coletadas para avaliação com base em critérios morfológicos. No entanto, como a coloração de PI podem subestimar a quantidade de apoptose [23], que confirmou a natureza apoptótica de células por análise bioquímica dos lisados ​​celulares. A análise estatística foi realizada através do teste t de Student não pareado, com valores 0,05 considerado estatisticamente significativo

células

transfecção transitória e Reporter ensaio de gene

HCT116 e HKE-3 foram transfectadas transitoriamente com o TOP-. FLASH ou TOP-FOP plasmídeos repórter luciferase usando o método de fosfato de cálcio. A eficiência de transfecção foi normalizada por co-transfecção com pTK Renilla-e a actividade da luciferase foi determinada de acordo com o protocolo do fornecedor (ensaio de repórter duplo de Luciferase, Promega, Madison, WI). IκBα negativo dominante foi expresso a partir de um plasmídeo que codifica para IκBα com serinas 32 e 36 mutados para alanina, o qual confere resistência ao estímulo degradação induzida por [24]. Os plasmídeos que expressam constitutivamente activa AKT, (HA-mdelta (4-129) PH-AKT), e AKT negativo dominante (HA-AKT-K179M) foram fornecidos por Richard Roth [25], [26]. dnTCF4 foi descrito anteriormente [27].

Os macrófagos foram transfectadas com 20 nM de siRNA não específico (NSP) ou siRNAs específicos para VDR, IL-1β ou STAT1 (Dharmacon, Lafayette, CO) usando Lipofectamin LTX (Invitrogen , Carlsbad, CA). A eficiência de silenciamento foi monitorizada por imunotransferência (para STAT1 e VDR), ou por meio de ELISA (para IL-1β), como relatado [7], [8].

Imunofluorescência

Pela detecção subcelular de β-catenina por imunof luorescência, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante 30 minutos. As células foram incubadas com anticorpo anti-β-catenina (1:100) durante 1 h a 37 ° C e com o anticorpo anti-coelho secundário conjugado com FITC durante 45 min a 37 ° C. As imagens foram adquiridas com uma câmara CCD SPOT e analisadas por software SPOT.

Western Blot

As transferências de Western foram realizadas utilizando procedimentos padrão. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em TBS contendo 0,1% de Tween 20, e incubadas com anticorpos específicos para a caspase 8 (Abcam), caspase 9, PARP, Snail (Cell Signaling Technology), pGSK3β (Millipore, Billerica, MA), P total de -catenina (BD Biosciences, San Jose, CA), e β-actina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). bandas imuno foram visualizadas por quimioluminescência (Amersham ECLTM kit de detecção de western blot, Piscataway, NJ).

Resultados

Os macrófagos e IL-1β proteger as células cancerígenas do cólon de TRAIL induziu apoptose

Foi demonstrado que os macrófagos induzir várias vias de sinalização prosurvival em células cancerígenas do cólon, incluindo o NF-kB, AKT e sinalização Wnt [7], [8], sugerindo que a presença de macrófagos pode afectar a resposta de células tumorais a agentes terapêuticos. células cancerígenas do cólon HCT116 são altamente suscetíveis à apoptose induzida por TRAIL [16]. Assim, TRAIL inibiram significativamente o crescimento clonogénico de células HCT116 e HKE-3 (Fig. 1A e B), as linhas celulares que diferem apenas pela presença dos KRAS mutantes [21]. Não houve diferença reprodutível entre a capacidade de resposta de células HCT116 e HKE-3 de TRAIL (Fig. 1 e 2), o que demonstra que a presença de mutantes KRAS não regula a capacidade de resposta das células a TRAIL. Para determinar se os macrófagos alterar a sensibilidade de células tumorais para TRAIL, que trataram células HCT116 e HKE-3 com TRAIL na ausência ou na presença de macrófagos THP1. Notavelmente, a presença de macrófagos THP1 ou tratamento com IL-1β, uma citocina produzida em co-culturas de células tumorais e macrófagos [7], restaurou o crescimento clonogénico de células cancerígenas do cólon tratadas com TRAIL (Fig. 1).

a e B: células HCT116 e HKE-3 foram semeadas a uma densidade de 200 células por poço de uma placa de seis na ausência ou na presença de macrófagos (1600 /poço) ou IL-1β, e foram tratados com TRAIL para 4 horas. Os resultados mostrados na B representam a média de duas experiências independentes, cada uma realizada em duplicado.

macrófagos não inibiu a expressão de DR4 ou DR5, ou modulam os níveis de receptores de engodo DcR1 ou DcR2 na HCT116 /HKE-3 células (Figura S1), sugerindo que eles não modular a capacidade de resposta a trilha através de regulação dos receptores TRAIL.

em seguida, mostraram que os macrófagos e apoptose induzida por TRAIL inibiram a IL-1β de HCT116 e Hke- 3 células (Fig. 2A). THP1 macrófagos e IL-1β colapso induzida por TRAIL impedidas de o potencial de membrana mitocondrial (MMP) (Fig. 2B) e a activação induzida por TRAIL impedido de caspase-8 e caspase-9 (Fig. 2C). A linha celular monocítica humana THP-1 foi derivada a partir do sangue periférico de um paciente com células de leucemia monocítica aguda e THP1 têm propriedades de macrófagos derivados de monócitos humanos [28]. Estas células têm várias características de macrófagos associados a tumores (TAMs), incluindo a activação diminuída de NF-kB, a falta de produção de óxido nítrico em resposta a LPS /IFN-y (não mostrado) e alta STAT1 constitutiva de sinalização [7], [8]. Entretanto, para confirmar que os resultados obtidos utilizando células THP1 são biologicamente relevante, mostrámos que os monócitos de sangue periférico normais, os precursores de macrófagos associados a tumores, protegido contra um painel de linhas celulares de cancro do cólon a partir apoptose induzida por TRAIL (Fig. 2D). Como os macrófagos THP1, monócitos do sangue periférico normais restaurado o MMP e activação impedido de caspase 8 e clivagem da PARP em células de tumor tratadas com TRAIL (dados não mostrados, A Figura S2), o que é consistente com a capacidade das células do cancro do cólon para induzir IL 1β libertação a partir de monócitos do sangue periférico [7]

a:. HCT116 (média de 5 experiências independentes) e HKE-3 células (média de 4 experiências independentes) foram tratados com TRAIL na ausência ou na presença de macrófagos ou IL-1β (5 ng /mL), como indicado e a extensão da apoptose foi determinada após 7 horas. B: O potencial da membrana mitocondrial (MMP) foi determinada por coloração com JC1 5 horas após o tratamento. C: Activação de caspase 8 e caspase-9 foi determinada em células de cancro de cólon tratadas com TRAIL (50 ng /ml) sob as condições indicadas. D: TRAIL- linhas celulares de cancro sensíveis foram tratados com TRAIL na ausência ou na presença de monócitos humanos de sangue periférico (Mo) e a extensão da apoptose foi determinada 7 horas após o tratamento. Os dados mostrados representam a média de 2 ou 3 experiências independentes.

monócitos do sangue periférico induzidos por TRAIL inibiram a apoptose também em células 293T (Fig. 2D), demonstrando que factores derivados de macrófagos são inibidores potentes e gerais de morte celular induzida por TRAIL.

macrófagos proteger de apoptose induzida por TRAIL através de IL-1β

mostrou que a IL-1β é suficiente para inibir a apoptose induzida por TRAIL (Fig. 2). Para estabelecer se a IL-1β é necessário para a protecção mediada por macrófagos de células tumorais a partir apoptose induzida por TRAIL, primeiro silenciados IL-1β em THP1 macrófagos. Estas experiências revelaram que a IL-1p macrófagos deficientes falham para proteger as células tumorais a partir de apoptose induzida por TRAIL (Fig. 3A e 3B). Consistente com estes dados, a neutralização de IL-1β por anticorpos específicos de IL-1β, ou silenciamento de STAT1, um factor de transcrição que se mostrou é necessária para a libertação de IL-1β de macrófagos [7], também inibiu a actividade anti-apoptótica de macrófagos (Fig. 3A e 3B). Como esperado, o anticorpo neutralizante IL-1β inibiu a actividade da IL-prosurvival 1β, demonstrando a especificidade do anticorpo. Juntos, estes dados estabelecido que macrófagos associados a tumores proteger as células tumorais a partir apoptose induzida por TRAIL de uma forma dependente de IL-1β

A e B:. As células HCT116 foram cultivadas com THP1 macrófagos com silenciados IL-1β ou expressão de STAT1 e foram tratadas com TRAIL tal como indicado. IL-1β foi neutralizada por anticorpos específicos anti-IL-1β. As fotografias foram tiradas (A) e a quantidade de apoptose (B) foi determinada após 7 horas. Os dados apresentados em B representam a média de três experiências independentes. C e D: Estudos de Gyorffy

et al

([29], C) e por Khambata-Ford

et al

([30], D) foram levantados através Oncomine e indicam que células linhas (C) e cancros do cólon primários (D) com níveis mais elevados de resistência à IL-1βdisplay a agentes terapêuticos, tais como vinblastina, doxorrubicina e cetuximab (CTX).

para determinar se a capacidade da IL -1β para interferir com a terapia de apoptose induzida por TRAIL é restrita a, nós examinamos Oncomine (www.oncomine.org), que é um conjunto de estudos de microarray de tumores humanos. A análise de 30 linhas de células por Gyorffy

et al [29] revelou que a expressão elevada de IL-1β em células tumorais de linhas correlaciona-se fortemente com a resistência das células à vinblastina e doxorrubicina (Fig. 3C). A análise de 70 tumores de cólon metastático [30] revelou que os tumores do cólon que abrigam KRAS mutado têm níveis mais altos de IL-1β do que os tumores com KRAS WT (Fig. 3D, painel esquerdo). Se a IL-1β é produzido por células do estroma ou próprias células tumorais não se pode concluir, no entanto, a análise desta base de dados revelou que níveis mais elevados de IL-1β em tumores correlacionam-se com a resistência ao cetuximab [30] (Fig. 3D, painel da direita). Em resumo, estes dados estabelecido que os níveis de IL-1β são elevados em um subconjunto de tumores do cólon humanos, e que a IL-1β modula a resposta das células de tumor a uma variedade de agentes terapêuticos, tanto

In vitro e

in vivo

.

a inibição farmacológica da estimulação IL-1β por vitamina D

3 inibe a atividade dos macrófagos prosurvival

recentemente, demonstramos que a conversa cruzada entre tumor células e macrófagos é interrompido pela vitamina D

3, um importante agente quimiopreventivo para o cancro colorectal. A vitamina D

3 inibiu a capacidade de as células de tumor para estimular a libertação de IL-1β de macrófagos [7] e, subsequentemente, a vitamina D

3 macrófagos tratados falharam em induzir sinalização de Wnt em células tumorais [7]. Estes dados sugerem que a vitamina D

3 também pode regular TRAIL induziu apoptose. As células HCT116 foram cultivadas isoladamente ou na presença de macrófagos, e foram tratados com TRAIL na ausência ou na presença de vitamina D

3. A vitamina D

3 não afectou a apoptose induzida por TRAIL em células HCT116 ou HKE-3 (dados não mostrados), o que é consistente com a falta de responsividade dessas células à vitamina D

3 [31]. No entanto, demonstrou-se que a capacidade dos macrófagos para proteger as células de cancro do cólon a partir apoptose induzida por TRAIL foi inibida pela vitamina D

3 (Fig. 4A). A adição de IL-1β impedido a capacidade de vitamina D

3 para regular TRAIL induziu apoptose, confirmando que a vitamina D

3 restaurou a sensibilidade de células tumorais à pista por inibição da libertação de IL-1β de macrófagos, e não afectando a sinalização por IL-1β. O silenciamento de VDR por ARNsi específico VDR em macrófagos não afectou a sua capacidade para inibir a apoptose induzida por TRAIL em células de tumor, no entanto, a vitamina D

3 não conseguiu restabelecer TRAIL induziu apoptose de células tumorais co-cultivadas com VDR macrófagos deficiência (Fig. 4A) . Estes dados demonstraram que a vitamina D

3 afecta a diafonia entre as células tumorais e macrófagos por segmentação macrófagos e não as células de tumor, e que, por conseguinte, requer a expressão de RVD em macrófagos, consistente com os nossos dados publicados [7].

R: A quantidade de apoptose foi determinada em células HCT116 tratados com TRAIL sob as condições indicadas. As barras de erro foram derivados a partir de 2 expericias independentes. B: O efeito da vitamina D

3 na activação induzida por TRAIL de caspases e a clivagem de PARP e β-catenina foi determinado por imunotransferência

A análise bioquímica confirmado que, enquanto os macrófagos TRAIL- inibida. activação induzida de caspase 8 e caspase-9 e a clivagem de PARP e β-catenina, o tratamento com vitamina D

3 promovida a activação mediada por TRAIL da cascata apoptótica em células de tumor que foram cultivadas na presença de WT, mas não VDR deficientes macrófagos (Fig. 4B). Como a vitamina D

3 actua como um inibidor da libertação de IL1-β, a sua actividade foi impedida por IL1β exógeno e era dependente da expressão de RVD em macrófagos (Fig. 4A, a Fig. 4B) e não em células tumorais (dados não mostrado).

vitamina D

3 também restaurou a sensibilidade a TRAIL em células cancerígenas do cólon que foram cultivadas na presença de monócitos do sangue periférico. É realçado activação de caspase 8 e subsequente clivagem da PARP e β-catenina em HCT116 que a resistência adquirida à pista, devido à presença de monócitos do sangue periférico (Figura S2).

Estes dados sugerem que a eficácia terapêutica de TRAIL poderia ser muito melhorado pela vitamina D

3 em cancros que são infiltradas por macrófagos.

sinalização Wnt é necessário para a atividade dos macrófagos prosurvival

Nós recentemente demonstrado que os macrófagos e IL-1β induzir a sinalização de Wnt em células cancerígenas do cólon através da activação de sinalização de NF-kB AKT-dependente [8], vias que foram mostrados para proteger as células tumorais a partir de apoptose. Para determinar se os macrófagos e IL-1β inibir a apoptose induzida por TRAIL através da activação destes pro-sobrevivência vias de sinalização, que expressa em células HCT116 dnIκB (um inibidor de sinalização de NF-kB), dnAKT (um inibidor de sinalização de AKT) e dnTCF4 ( um inibidor da via de sinalização Wnt). A inibição da NF-kB ou AKT não teve impacto apoptose induzida por TRAIL. No entanto, as células transfectadas com dnTCF4 mostrou reprodutivelmente uma quantidade modesta redução da apoptose induzida por TRAIL (diferenças não foram estatisticamente significativa), o que pode ser consistente com a exigência de a via Wnt por apoptose óptima induzida por TRAIL [32] (Fig. 5A) . No entanto, o ponto crítico foi que, em contraste com as células transfectadas com um plasmídeo vazio, macrófagos e IL-1β não protegeu as células com insuficiência de NF-kB, AKT ou de sinalização Wnt de apoptose induzida por TRAIL (Fig. 5A). Confirmou-se que os macrófagos e IL-1β falhou para neutralizar a activação induzida por TRAIL de caspase-8 e caspase-9 e subsequente clivagem da PARP em células que expressam quer dnIκB, dnAKT ou dnTCF4 (Fig. 5B). De particular interesse, macrófagos e clivagem induzida por TRAIL IL-1β impedido de β-catenina, mas apenas em células com intacta NF-kB /AKT /sinalização Wnt (Fig 5B).

A e B:. HCT116 expressando dnIκB, dnAKT ou dnTCF4 foram tratados com TRAIL sob as condições indicadas e da quantidade de apoptose foi determinada por coloração com iodeto de propídio. A: Os dados representam a média de 5 experiências independentes. B: O grau de activação de caspase e a clivagem de PARP e β-catenina foi determinado em lisados ​​celulares por imunotransferência. C:. A localização de β-catenina foi determinada por imunof luorescência em células HCT116 tratados com TRAIL na ausência ou na presença de IL-1β ou TNFa

Clivagem de β-catenina foi mediada por caspases, como poderíamos evitar a sua transformação por zVAD, um inibidor pan-caspase (Figura S3). Clivado β-catenina foi demonstrado exibir actividade transcricional comprometida [33]. Mostrámos que TRAIL inibe a actividade de transcrição TCF4 /β-catenina e que os macrófagos e IL-1β pode restaurar parcialmente a actividade de transcrição β-catenina em células tratadas com TRAIL (Figura S3).

Semelhante à relatórios publicados [34] verificou-se que, apesar do facto de que as células HCT116 portadores de um alelo mutante β-catenina, a maioria dos β-catenina é localizada para as membranas em células HCT116. Consistente com a clivagem de β-catenina por TRAIL, localização membranoso de β-catenina foi severamente diminuída em células tratadas com TRAIL (Fig. 5C). Tanto a IL-1β e TNFa restaurada a localização membranoso de β-catenina em células HCT116 em células tratadas com TRAIL (Fig. 5C), em conformidade com a sua actividade prosurvival.

Em conjunto, estes dados demonstraram que os macrófagos associados a tumores (TAM) proteger as células tumorais de apoptose induzida por TRAIL através da sua capacidade para estabilizar β-catenina e promover a sinalização de Wnt em células de câncer de cólon.

Os macrófagos, TNF e IL-1β estabilizar Caracol em uma NF-kB e AKT /WNT forma dependente

Embora os macrófagos e as células de tumor protegidos IL-1 a partir apoptose induzida por TRAIL, eles não regulam os níveis de os membros da família Bcl-2 em células de tumor, tais como Bcl-x ou MCL1 , ou alterar a expressão de CIAPS, que foram mostrados para modular a resposta de células para a apoptose induzida por TRAIL [16] (dados não mostrados). Contudo, mostrámos que os níveis de proteína do caracol foram aumentados em células HCT116 tratados com IL-1β ou em células HCT116 cultivadas na presença de macrófagos (Fig. 6A). TNFa, outro factor derivadas de macrófagos que podem induzir sinalização de Wnt em células tumorais [7], [35], também elevados os níveis de Snail em células de tumor (Fig. 6A). Foi demonstrado que os macrófagos, IL-1β e TNFa elevado caracol através de NF-kB, e a sinalização de Wnt AKT, uma vez que não conseguiu aumentar os níveis de Snail em células que expressam dnIκB, dnAKT ou dnTCF4 (Fig. 6A). Os níveis de ARNm de Snail em células HCT116 ou HKE-3 não foram aumentados pelos macrófagos (não mostrados), sugerindo que os factores derivados de macrófagos estabilizar proteína Snail em células tumorais. A indução de c-Jun por IL-1β e TNFa também necessário NF-kB, consistente com os dados publicados (Fig. 6A). Mostrámos que o TNFa e IL-1β também não conseguiu induzir c-Jun em células que expressam dnTCF4, confirmando a importância da sinalização de Wnt para a actividade biológica destas citoquinas e para a interacção das células tumorais com os macrófagos

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A : Os macrófagos, IL-1β e TNF estabilizar Caracol em um discreto /Wnt dependente de NF-kB /AKT. As células HCT116 foram transfectadas com dnIκB, dnAKT ou dnTCF4 e foram tratados com IL-1β ou TNFa, ou THP1 foram cultivadas com macrófagos como indicado. Os níveis de Snail e c-Jun foram determinados por immunoblotting. B: Os níveis de Snail e pGSK3β foram determinados por immunoblotting em células HKE-3 que foram tratados com IL-1β, TNFa ou foram co-cultivados com macrófagos na ausência ou na presença de LY 294002 durante 24 horas. C: HCT116 e HKE-3 células foram tratadas com TRAIL na ausência ou na presença de IL-1β e LY294002, como indicado. O experimento foi realizado três vezes.

GSK3β é um grande quinase que fosforila Caracol e induz a sua degradação [36], [37]. Porque já relatado que os macrófagos e IL-1β inactivar GSK3β em células tumorais [7], [8], que em seguida examinado se macrófagos /IL-1β estabilizar caracol através da inibição da GSK3β. células HCT116 e HKE-3 foram tratados com LY294002, um inibidor de PI3K – e, assim, activador de GSK3β (fosforilação de GSK3β na serina 9 inibe a sua actividade). Como mostrado na Fig. 6B, o tratamento de células com LY294002 macrófagos fato impedidas /IL-1p /inactivação mediada por TNFa de GSK3β, e de estabilização completamente impedido de Snail por macrófagos, TNFa e IL-1β. Este resultado demonstra que a inibição da GSK3β regula a estabilidade de Snail em células HCT116 e sugere fortemente que os macrófagos, TNFa e IL-1β estabilizar caracol através da sua capacidade para inibir a GSK3β. Com efeito, a inibição farmacológica de GSK3β por LiCL ou pelo inibidor específico GSK3β, AR-A014418, foi suficiente para estabilizar Snail em células de tumor (Figura S4).

Finalmente, o tratamento de células com LY29004 impediu completamente a capacidade da IL -1β para proteger as células de cancro do cólon a partir apoptose induzida por TRAIL (Fig. 6C), o que implica que os macrófagos e IL-1β proteger de apoptose induzida por TRAIL através GSK3β estabilização dependente de caracol.

macrófagos e IL-1β proteger a apoptose induzida por TRAIL através de estabilização de Snail

Snail foi mostrado para interagir com β-catenina e para promover a expressão de genes alvo Wnt [38]. De acordo com estes dados, descobrimos que a sobre-expressão de Snail promove a atividade TOP-driven-FLASH tanto em HCT116 e células HKE-3 (Fig. 7a). A fim de determinar se a estabilização de Snail por macrófagos /IL-1β contribui para a sua capacidade de conduzir a sinalização de Wnt, que silenciados Snail em células de tumor (Fig. 7B), e examinaram a capacidade de macrófagos e IL-1β para induzir a sinalização de Wnt na caracol HCT116 deficiente e células HKE-3.