Abstract

Fundo

Para investigar a implicação da ribonucleótido-redutase M2 (RRM2) na carcinogênese do colo do útero e sua relação com características clínicas e prognóstico de pacientes com câncer.

Metodologia e principais conclusões

o impacto da RRM2 sobre a viabilidade celular foi investigada em SiHa cervical células cancerígenas após RRM2 knockdown e a adição de cisplatina, que induz ligações cruzadas de DNA inter- e intra-cadeia. RRM2 imunorreatividade foi avaliada pela pontuação semi-quantitativa H entre 29 normal, 30 displasia de baixo grau, 30 displasia de alto grau e 103 amostras de tecido de câncer invasivo do colo uterino, utilizando microarrays de tecido. RRM2 foi então correlacionada com as variáveis ​​clínico-patológicas de câncer cervical e a sobrevida do paciente. Um efeito tóxico maior sobre a viabilidade celular utilizando a cisplatina foi reflectido pela maior redução na expressão de proteínas em células SiHa RRM2. A expressão RRM2 em tecidos de câncer foi maior do que na displasia de alto grau, displasia de baixo grau ou tecidos cervicais normais. RRM2 regulação positiva foi correlacionada com a invasão estromal profunda, tumores grandes e invasão parametrial e previu sobrevida.

Conclusões

RRM2 é um novo marcador molecular para o diagnóstico e os resultados clínicos de cancro cervical. Ele está envolvido na carcinogênese cervical e prediz a sobrevivência pobre, e pode ser um alvo terapêutico potencial, incluindo no tratamento com cisplatina

Citation:. Su YF, Wu TF, Ko JL, Tsai HT, Tee YT, Chien MH, et ai. (2014) a expressão dos ribonucleotídeo redutase M2 na carcinogênese do colo do útero e sua relação com características clínicas e prognóstico dos pacientes com câncer. PLoS ONE 9 (3): e91644. doi: 10.1371 /journal.pone.0091644

editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, Taiwan

Recebido: 11 Janeiro, 2014; Aceito: 13 de fevereiro de 2014; Publicação: 17 de março de 2014

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por bolsas de investigação do Hospital da Universidade Chung Shan Medical, Conselho Nacional de Ciência (CSH-2013-D-001) e Taiwan (NSC 102-2314-B-040-014-MY3). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

redutase do ribonucleotídeo (RNR) é uma enzima que catalisa a formação de desoxirribonucleótidos de ribonucleótidos [1]. Desoxirribonucleótidos por sua vez são usados ​​na síntese de ácido desoxirribonucleico (ADN) e de reparação do ADN [1], [2]. RNR consiste de duas subunidades de proteína a que se refere a tão grande R1 (denominado como M1, em seres humanos) e [3] pequena R2. R2 é classificada como RRM2 (ribonucleótido-redutase M2) e p53R2 subunidades que formam um tetrâmero heterodimérica activa em humanos [4], [5]. RNR foi relatado para ser correlacionado com a proliferação celular e diferenciação [6], [7], e a actividade RNR precisa de ser coordenada com a progressão do ciclo celular para preservar o equilíbrio entre a produção de dNTP e a replicação do ADN. As concentrações de proteína R1 são relativamente estável ao longo do ciclo celular e são sempre em excesso de [8] RRM2. Por conseguinte, a actividade dependente de ciclo celular de RNR é regulada pelos níveis RRM2 [8].

A destruição das células cancerosas por cisplatina requer a ligação do fármaco para o ADN e a formação de aductos de ADN-platina, que pode estabelecer ligações cruzadas de DNA inter e intra-Strand, inibindo assim a replicação do ADN [9]. O trans-complementação grupo 1 (ERCC1) da enzima de reparação de excisão foi reportado para desempenhar um papel importante na reparação de ligações cruzadas inter-cadeia de ADN [10] – [12]. Além disso, a expressão R2 é dependente do ciclo celular, com o mais alto nível simultâneo com a replicação do ADN [4], [8], sugerindo que a reparação do ADN combustíveis RRM2. A nossa experiência preliminar demonstrou que as células SiHa cancro cervical, que têm um teor de proteína mais elevado RRM2, apresentam maior viabilidade celular de células Caski cancro cervical, que têm um menor teor de proteína RRM2, com base em MTT [brometo de 3- (4,5-2-cimethylthiazol -il) – 2,5-difenil tetrazólio] ensaio após o tratamento de cisplatina. Os níveis de proteína RRM2 de SiHa cancros cervicais de expressão foram 2,3-3,6 dobra mais do que aqueles de Caski cancros cervicais. Após 48 horas de cultura com a adição de 5 pM de cisplatina, a viabilidade celular das células SiHa foi cerca de 80% das células originais SiHs sem adição de cisplatina, ao passo que, a viabilidade celular das células Caski foi reduzida para 51% (vs. SiHa CaSki: 80 % vs. 51%,

p Art 0,001). Isto implica que as células cancerosas do colo do útero com a expressão RRM2 elevada têm melhor viabilidade celular.

Para o melhor de nosso conhecimento, o envolvimento de RRM2 na carcinogênese cervical e a sobrevida do paciente não foi relatado anteriormente. Portanto, os objetivos deste estudo foram investigar a implicação clínica do RRM2 em câncer cervical. Nossa hipótese é que RRM2 está correlacionada com a progressão do câncer de colo uterino. Detectamos se a viabilidade das células do cancro foi reduzida depois da adição de cisplatina utilizando o ensaio de MTT, se o gene RRM2 foi derrubado em células de cancro do colo do útero. Se RRM2 poderia afetar a proliferação de células cancerosas, examinamos mais RRM2 imunorreatividade em baixo grau e tecidos displasia de alto grau e invasivos espécimes normais, de tecido de cancro do colo do útero e definida a correlação de expressão RRM2 com a carcinogênese do câncer cervical. Além disso, associada a expressão de RRM2 com variáveis ​​clínico-patológicas de pacientes com câncer cervical, e investigou a relação da sua expressão com a recorrência do câncer e sobrevida do paciente.

Materiais e Métodos

cultura celular

SiHa e linhas de células humanas embrionárias de rim 293T foram obtidos a partir do Culture Collection (ATCC; Rockville, MD, EUA) da American Type Tissue. SiHa e células 293T foram cultivadas em linhas de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM; Gibco, Grand Island, NY) suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor 10%. (FBS; Gibco, Grand Island, NY):

Lentivírus produção e transdução

as células 293T foram transfectadas com 5 ug de ARN gancho de cabelo curto (shRNA) de plasmídeo, 4 ug e 0,4 ug pCMVDR8.91 pMD.G por jetPEI reagente de transfecção de ADN com base no protocolo do fabricante (Polyplus-transfecção , 101-10; Strasbourg, França). sequências shRNA e de destino predefinidos foram adquiridos a partir da Unidade Nacional de RNAi Núcleo da seguinte forma: shRRM2 # 354 (TRCN0000286354): 5′-CGG AGG AGA GAG TAA GAG AAA -3 ‘; shRRM2 # 962 (TRCN0000038962): 5’-TCG CAA GAA ACG AGG ACT GAT-3 ‘e shLuc (TRCN0000072246): CAA ATC ACA GAA TCG TCG TAT. Após 24 horas de cultura, as células do cancro do colo do útero SiHa foram infectadas com lentivírus vectores recombinantes a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1. No dia seguinte, o meio foi removido e as células foram seleccionadas por 2 ug /ml de puromicina (Sigma, P8833, St. Louis, MO). O # 354 e SiHa shRRM2 # 962 linhas de células SiHa shRRM2 foram estabelecidos.

análise de Western blot

Uma quantidade equivalente de proteína total foi processado por 12% SDS-PAGE e electrotransferidas para Hybond ECL PVDF membranas, incubados com anticorpos primários contra RRM2 humana (GTX103193, GeneTex, Inc .; Irvine, CA 92606 EUA) e β-actina (A5441, Sigma, St. Louis, MO).

MTT [brometo de 3- ( 4,5-cimethylthiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio] ensaio

SiHa shRRM2 # 354, # 962 shRRM2 SiHa e SiHa shLuc células foram semeadas em uma placa de microcultura de 96 poços a 5000 células /poço e deixadas a ligar durante a noite. No dia seguinte, as células foram expostas a diferentes concentrações (0, 25, 50 uM) de cisplatina em meio DMEM suplementado com 10% FBS e incubadas durante 48 horas. O meio foi substituído com meio fresco contendo MTT (0,2 mg /ml) e as placas foram incubadas durante mais 3 horas. O meio foi então removido e sulfóxido de dimetilo (DMSO) foi adicionado para dissolver os cristais de formazano MTT. A absorvência da cor foi medida a 570 nm, e a viabilidade celular foi calculada como a percentagem de células viáveis ​​no total da população.

Os sujeitos do estudo e imuno-histoquímica de expressão RRM2 no cancro, de alto grau e de baixo grau de displasia e os tecidos normais utilizando microarrays de tecido

Foram construídos dois, microarrays de tecido embebidos em parafina (núcleos de tecido MaxArray, Zymed, South San Francisco, Califórnia) fixados em formol, que consiste em 29, 30 displasia normal de baixo grau, 30 displasia de alto grau e 103 amostras de tecido de câncer invasivo do colo uterino. Estas amostras de tecido foram coletados a partir de blocos de parafina histopatológicos dos departamentos de patologia em Chung Shan Medical University. Um total de 103 doentes com cancro do colo do útero foram recrutados consecutivamente entre Março de 1999 e Março de 2006. Eles foram classificados de acordo com a Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia 2009 (FIGO) Classificação [13] e recebeu protocolos de tratamento padrão do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia , Chung Shan Medical University Hospital, Taiwan. Trinta pacientes com displasia de alto grau tinha recebido grandes excisões laço da zona de transformação, o total de histerectomia abdominal (TAH), ou histerectomia vaginal total (TVH). O diagnóstico patológico destas amostras revelou moderada, severa displasia ou carcinoma de células escamosas (SCC) in situ. Trinta pacientes com displasia de baixo grau para o qual eles receberam biópsias colposcopia-dirigida, todos encontrados para ter displasia leve por estudos patológicos. Vinte e nove amostras normais de tecido do colo uterino foram coletadas de pacientes que receberam TAH ou TVH para a doença uterina benigna, sem lesões cervicais. As secções de tecido microarray (MaxArray com 96 núcleos de tecido em cada tissue microarray, Zymed Laboratories Inc.) foram incubadas com anticorpos anti-RRM2 (ab57653, Abcam Inc. MA, EUA). Uma pontuação H semi-quantitativa da imunorreactividade RRM2 foi determinado multiplicando a pontuação proporcional de células coradas pela sua intensidade imunorreactividade [14], [15]. O endpoint clínico primário foi correlacionar a expressão de RRM2 com a sobrevida dos pacientes com câncer cervical. Este estudo foi aprovado pela Chung Shan Medical University Hospital Institutional Review Board (IRB CSMUH; CS12218 e CS12242) e o consentimento informado foi obtido de cada paciente. Nós seguido as recomendações OBSERVA para marcadores tumorais neste estudo [16].

A análise estatística

O método de Kruskal-Wallis H foi utilizado para analisar as diferenças na expressão RRM2 entre o câncer cervical, de alta displasia -grade, displasia de baixo grau e amostras de tecidos normais. O teste de Mann-Whitney foi utilizado para análise post-hoc. Em resposta a várias análises, o método Hommel foi usado para ajustar os

P valores

usando software winpepi, versão 10.0.

Nós associada as expressões de RRM2 com características clinicopatológicas dos pacientes com cancro do colo do útero usando qui-quadrado ou teste exato de Fisher.

valores e odds ratio P

foram analisados ​​por winpepi Software, versão 10.0. As curvas de Kaplan-Meier foram plotados para os doentes com cancro do colo do útero com base na expressão RRM2 para a probabilidade de recorrência ou sobrevida global entre a cirurgia primária e morte ou recorrência ou o final do estudo (31 de Maio de 2012). Média (mediana) e as taxas de tempos de sobrevivência de 5 anos de sobrevivência foram estimadas pelo método de produto limite de Kaplan-Meier. Multivariada e modelos de regressão de Cox univariada foram utilizados para avaliar o valor prognóstico de parâmetros biológicos e clínicos, com ou sem ajuste para a expressão RRM2 e variáveis ​​clínico-patológicas. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software estatístico SPSS (versão 11.0; SPSS, Inc., Chicago, IL). Todos os testes estatísticos foram bilaterais e uma

valor p

inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Quando o gene RRM2 foi derrubado na SiHa células de cancro do colo do útero, utilizando shRRM2 # 354 e # 962 RRM2, o nível de proteína RRM2 foi reduzida mais significativamente no SiHa shRRM2 # 354 do que nas linhas celulares # 962 (Figura 1A). Quando 25 pM de cisplatina foi adicionado ao SiHa shRRM2 # 962 e # 354 linhas de células, a viabilidade celular não foi reduzida nas células # 962, mas foi significativamente reduzida nas células 354 # (

P

0,001 ) em comparação com as células de controlo SiHa shLuc, em que o shLuc controlo do vector foi transfectado para as células de cancro cervical SiHa (Figura 1B). Quando 50 pM de cisplatina foi adicionado ao SiHa shRRM2 # 962 e # 354 linhas de células, a viabilidade celular foi reduzida em tanto # 962 (

P

0,001) e # 354 células (

p

. 0.001) em relação ao controle células SiHa shLuc (Figura 1B)

(a) os níveis da proteína de RRM2 foram detectados nas células de câncer cervical SiHa com shRRM2 # 354 ou # 962 utilizando Western blot. β-actina foi utilizada como controlo interno. As expressões relativas de RRM2 /β-actina são mostrados. O efeito do silenciamento de genes RRM2 foi mais forte nas células SiHa com shRRM2 # 354 comparação com aqueles com shRRM2 # 962. (B) um efeito tóxico maior sobre a viabilidade celular utilizando a cisplatina foi encontrado nas células SiHa com shRRM2 # 354 do que naqueles com shRRM2 # 962 em comparação com as células de controlo SiHa shLuc, em que shLuc foi transfectado em células SiHa. As viabilidades celulares foram detectados utilizando-se 3- (4,5-cimethylthiazol-2-il) -2,5- difenil ensaio de tetrazólio. RRM2, ribonucleótido-redutase M2; ***

p

. 0,001

A coloração de RRM2 era nuclear e o padrão de expressão de proteína RRM2 em tecidos tumorais estava em núcleos de tumor em microarrays de tecido de cancro do colo do útero. (Figura 2). O valor médio de todas as contagens de H das células tumorais nos núcleos 103 do cancro do colo do útero foi de 1,0. As contagens de H medianos da 29 normal, 30 displasia de baixo grau e 30 tecidos displasia de alto grau foram de 0,5, 0,5 e 0,5, respectivamente. A expressão RRM2 foi significativamente diferente entre o câncer cervical, displasia de alto grau, displasia de baixo grau e tecidos normais (

p Art 0,001, Kruskal-Wallis método H). A expressão RRM2 nos tecidos de câncer foi maior do que na displasia de alto grau (mediana pontuação H: 1,0 vs 0,5; ajustado

p 0,001), displasia (pontuação H mediana de baixo grau: 1,0 vs. 0,5; de Hommel ajustado

p

= 0,002) ou normal (pontuação H mediana: 1,0 vs 0,5; ajustados

p 0,001) tecidos. Quando as contagens de H de RRM2 nos tecidos de cancro cervical eram um valor médio de 1 ou mais, suas expressões imuno-histoquímica foram considerados como sendo alto (positivo); caso contrário, eles eram considerados como sendo de baixo (negativo).

(A) imunocoloração alta RRM2 (à esquerda) e baixa imunocoloração RRM2 (à direita) em tecidos de cancro cervical. imunocoloração (B) High RRM2 (à esquerda) e baixa imunocoloração RRM2 (à direita) na displasia de alto grau cervical. imunocoloração (C) alta RRM2 (à esquerda) e baixa imunocoloração RRM2 (à direita) na displasia de baixo grau do colo do útero. (D) Alta RRM2 imunocoloração (à esquerda) e baixa imunocoloração RRM2 (à direita) em tecidos cervicais normais. Ampliação: 200 ×; RRM2, ribonucleótido-redutase M2.

A média de idade dos pacientes com câncer de colo uterino foi de 51,4 ± 11,8 anos. Os pacientes com câncer invasivo do colo uterino foram clinicamente classificados com base no FIGO Classification 2009, e 68 pacientes foram encenadas I, 32 encenado II, 2 encenado III e 1 encenado IV. A mediana do tempo de acompanhamento após a cirurgia foi de 61,0 meses eo tempo médio de sobrevivência foi de 103 meses. A taxa de sobrevida em 5 anos foi de 80,6%. Dois pacientes foram perdidos para follow-up, 25 pacientes morreram e 16 pacientes recaída. A coloração para RRM2 foi mais forte nos pacientes mais velhos [ 50 anos;

p = 0,004

, odds ratio (OR): 4,97], aqueles com doença em estágio avançado (≥stage II;

p

= 0027; OR: 4,01), a invasão estromal profunda (

p Art 0,001; OR: 12,46), tumores grandes (

p

= 0,001; OR: 2,62), diferenciação celular moderada ou pobre (

p Art 0,001 ; OR: 15,98), invasão parametrial (

p

= 0,022; OR: 7,97) e tendeu a ser mais forte nos pacientes com metástase ganglionar (

p

= 0,066; OR: 6,10) (Tabela 1)

a análise univariada revelou que os pacientes com tecidos de câncer exibem imuno RRM2 positiva tiveram pior sobrevida do que aqueles com tecidos de câncer exibem negativo RRM2 imunorreatividade [taxa de sobrevida em 5 anos:. 76,4 vs . 95,5%; taxa de risco (HR): 7,94, 95% de intervalo de confiança (IC): 1,07-58,82;

p

= 0,016] (Tabela 2). Outros fatores significativos para a sobrevivência pobres incluídos invasão profunda do estroma, grande diâmetro tumoral, invasão parametrial e metástases nos linfonodos pélvicos (Tabela 2). No entanto, a análise multivariada revelou que a má sobrevivência só foi encontrada em pacientes cujo câncer tecidos exibiu profunda do estroma invasão. (HR: 6,25, 95% CI: 1,43-27,03,

p

= 0,015) (Tabela 2)

curvas de Kaplan-Meier foram plotados para a probabilidade de recorrência e sobrevivência de acordo com as expressões de RRM2 (Figura 3). Descobrimos que os pacientes com uma expressão RRM2 positiva tendem a ter uma maior probabilidade de recorrência (

p

= 0,094) (Figura 3A). Além disso, os pacientes com uma expressão RRM2 positiva tiveram uma sobrevida significativamente mais pobres do que aqueles com uma expressão RRM2 negativo. (

p

= 0,016; Figura 3B)

Os doentes (A) com RRM2 positiva tenderam ter uma maior probabilidade de recorrência (N = 99,

p

= 0,094), em comparação com os pacientes com RRM2 negativo. (B) Pacientes com RRM2 positiva tiveram sobrevivência significativamente menor (N = 101,

p

= 0,016), em comparação com os pacientes com RRM2 negativo. RRM2, ribonucleótido-redutase M2.

Finalmente, observamos que os pacientes que recebem o tratamento do colo do útero relacionadas com a cisplatina cujo câncer tecidos exibiu positiva RRM2 imunorreatividade tiveram um prognóstico pior. Trinta e um pacientes com cancro do colo do útero recebeu quimioradioterapia concomitante (CCRT), utilizando cisplatina ou quimioterapia adjuvante contendo cisplatina. De 28 pacientes que tiveram tecidos de cancro positivo para RRM2, 14 apresentaram recidiva ou expirado. No entanto, em 3 pacientes que tiveram câncer de tecidos negativos para RRM2, nenhum deles mostrou recorrência ou expirado.

Discussão

Neste estudo, verificou-se que os efeitos citotóxicos da cisplatina foram aumentados em células com maior redução de expressão RRM2 (shRRM2 # 354), em comparação com células com menor redução de expressão RRM2 (shRRM2 # 962). Porque RRM2 pode abastecer de reparação do ADN, e por causa da actividade dependente de ciclo celular de RNR é regulada pelos níveis RRM2 [8], RRM2 está associado com a proliferação celular. Portanto, se o gene é RRM2 derrubado em células de cancro do colo do útero SiHa, a proliferação de células pode ser afectada. Isto é suportado pela descoberta de que knockdown de proteína RRM2 crescimento celular marcadamente inibida de UM-UC-3 células de cancro da bexiga [17]. RRM2 regulação positiva tem sido demonstrado aumentar a proliferação celular maligna e o potencial de certos tipos de cancros, e que a inibição da RRM2 reduzida proliferação de células in vitro e in vivo [18], [19]. Lin et ai. postulado que knockdown estável da subunidade R2 leva à diminuição induzida pela cisplatina preenchimento de lacunas síntese em nucleótidos de reparação da excisão e um nível de dATP reduzida no G

2 /H de fase do ciclo celular, e que esta interfere com a reparação de lacunas de cadeia simples que são de outra forma convertidos em quebras de cadeia dupla na fase S subsequente no HCT-116 células cancerígenas do cólon humano [20]. Embora o gene RRM2 foi derrubado e os níveis de RRM2 expressão foram reduzidos, o SiHa shRRM2 # 354 e # 962 linhas celulares ainda tinha níveis de expressão suficientes de RRM2 para manter relutantemente suas viabilidades celulares após 48 horas de cultura no presente estudo (dados não mostrou). Portanto, as viabilidades celulares de SiHa shRRM2 # 354 e # 962 linhas celulares não foram reduzidos a significância estatística, em comparação com as células de controlo SiHa shLuc no nosso estudo. O RRM2 silenciar isolado não teve efeito forte o suficiente para reduzir a viabilidade celular com uma significância estatística. A cisplatina se liga ao DNA e promove a formação de aductos de ADN-platina, que podem estabelecer ligações cruzadas de DNA inter e intra-cadeia e, em seguida, inibe a replicação do ADN [9]. RRM2 não inibiu especificamente a toxicidade da cisplatina. Após a adição de cisplatina, o efeito agravar da proliferação celular reduzida resultante de ligações cruzadas de DNA inter e intra-cadeia de cisplatina e de diminuição do complemento de ADN por RRM2 knockdown levou a viabilidade de células reduzido com significância estatística no # 354 e # 962 linhas celulares. O silenciamento de expressão RRM2 em SiHa # 354 e # 962 células de células aumentada a toxicidade da cisplatina.

Nossos resultados mostraram que a imuno RRM2 em tecidos de câncer é maior do que na displasia de alto grau, displasia de baixo grau e normal tecidos do colo uterino. superexpressão RRM2 tem sido correlacionada com a carcinogênese cervical. Fan et al. demonstraram que a proteína R2 não é apenas um componente limitante da velocidade para a redução de ribonucleótidos, mas também é capaz de cooperar com uma variedade de oncogenes nos mecanismos de transformação celular e a tumorigénese [21]. RRM2 subunidade sobre-expressão foi também observada em tumores de cancro da bexiga e do cancro gástrico [17], [22]. Em contraste com as descobertas de Morikawa et ai. [17] na qual foi demonstrada uma coloração positiva em tecidos de carcinoma in situ da bexiga, RRM2 supra-regulação não foi encontrado nos tecidos displasia de alto grau do colo uterino no estudo corrente. Isto pode ser atribuível às diferentes oncogenes cooperantes que transformam as células por diferentes mecanismos. estresse oncogénico foi reportado para produzir deficiência de dNTP e consequente tensão replicação de ADN típico de um evento oncogénico precoce [23]. RRM2 foi relatado para ser regulado transcricionalmente por factores associados com o ciclo celular, tais como E2F [24]. Além disso, Liu et ai. propôs que uma expressão hRRM2 elevada provoca estresse oxidativo e ativa o /Raf /sinal via MAPK Ras [25]. A coloração de RRM2 foi encontrado para ser nuclear no presente estudo. Niida e Zhang constatou que RRM2 é recrutado para o núcleo para garantir a disponibilidade local de dNTPs para a síntese de reparação do ADN eficiente em resposta a danos no DNA [26], [27]. D’Angiolella et ai. descobriram que, em resposta ao stress genotóxico, RRM2 acumula nos núcleos das células de cancro cervical HeLa [2]. Eles demonstraram ainda que o calendário de acumulação RRM2 seguinte dano ao DNA é paralelo ao tempo de reparo do DNA.

O nosso estudo revelou que uma expressão RRM2 positiva está correlacionada com características clinicopatológicas pobres, tais como idade avançada, estágio avançado que não seja a fase I , invasão profunda do estroma, tumores grandes, tumores de alto grau e invasão parametrial positivo. RRM2 tendem a ser altamente expresso nos pacientes com metástases em linfonodos pélvicos positivos no momento da cirurgia. Em alguns tipos de cancro, um elevado nível de expressão RRM2 foi relatado para ser correlacionado com invasividade celular [28], angiogénese tumoral [19], metástase [25] e os resultados dos pacientes pobre [29]. A sobre-expressão de RRM2 tem sido demonstrada estar correlacionada com um aumento do potencial invasivo de células em uma linha de células de carcinoma KB orofaríngea humana [3]. RRM2 podem interagir com uma variedade de oncogenes que promovem a progressão do tumor e aumentar a capacidade de invasão de células cancerosas [30]. Morikawa et ai. demonstrou que RRM2 superexpressão só é significativamente associada com muscularis propria invasão, mas não mostrou associação significativa com outros parâmetros, tais como metástase ganglionar [17]. Wang et al. mostrou que os pacientes com cancro do ovário com FIGO clínica fases III-IV apresentam expressões mais elevado de genes RRM2 do que aqueles com FIGO clínica estágios I-II [31].

No estudo atual, a análise univariada revelou que pacientes com câncer cervical com invasão profunda do estroma, grande diâmetro tumoral, invasão parametrial, pélvica e metástases em linfonodos, bem como a expressão RRM2 positiva têm baixa média e mediana de sobrevida, a taxa de sobrevida em 5 anos pobres, e uma alta de RH da morte. Os pacientes com expressões RRM2 positivos foram encontrados para ter uma sobrevivência significativamente mais baixos e uma maior probabilidade de recorrência. Rosty et ai. utilizado um Affymetrix HG-U133A oligonucleótido microarrays para mostrar que a expressão de HPV E6 /E7 desempenha um papel fundamental na progressão de cancro cervical invasivo através da desregulação dos genes de fragmentação proliferação do cancro do colo do útero, com o aumento dos níveis de expressão média de 123 genes conhecidos únicos, incluindo RRM2 [ ,,,0],32]. Os níveis de expressão médios destes genes foram mais elevados em tumores de cancro do colo do útero com uma recidiva precoce do que nos tumores com um curso favorável. RRM2 também tem sido relatada como sendo um biomarcador prognóstico em cancros colo-rectais [33]. Wang et al. descobriu que a sobrevivência de pacientes com um nível baixo de mRNA RRM2 é significativamente superiores aos dos pacientes com níveis elevados de cancro do ovário [31]. Por Cox análise de modelo de risco proporcional, o risco de mortalidade para os pacientes com elevados níveis de expressão de mRNA RRM2 era 2.553 vezes maior do que para aqueles com expressões baixas. No entanto, apenas invasão estromal profunda é um fator prognóstico independente para pacientes com câncer de colo uterino por meio de análise multivariada no estudo atual. Muitos estudos têm apoiado que estromal invasão é um poderoso preditor independente de sobrevida global para o paciente com câncer cervical [34] – [39].

Em pacientes que recebem tratamento contendo cisplatina, aqueles cujos tecidos câncer apresentou uma RRM2 positiva expressão parecia ter pior prognóstico do que aqueles com uma expressão RRM2 negativo. As células cancerosas são mais sensíveis ao efeito citotóxico de inibição RNR do que as células normais, devido ao aumento da necessidade de dNTPs para a proliferação e diminuição da capacidade de adaptação e de baixa capacidade de resposta a sinais reguladores. Deste modo, esta enzima tem sido desde há muito considerado como sendo um excelente alvo para a quimioterapia do cancro [3], [40]. Uma vez que a actividade dependente de ciclo celular de RNR é regulada pelo nível de RRM2 [8], [21], o papel de RRM2 é muito importante.

Existem várias limitações para este estudo. O tamanho da amostra dos pacientes que receberam o tratamento com cisplatina no CCRT ou protocolos de quimioterapia adjuvante foi muito pequena. A maioria dos doentes com cancro cervical tinha fase I ou II, e, por conseguinte, apenas alguns pacientes receberam tratamento contendo cisplatina. Apenas 3 pacientes com expressões RRM2 negativos receberam terapia adjuvante relacionadas com a cisplatina e todos eles tiveram melhor prognóstico. Isto também implica que os pacientes com câncer cervical cujos tecidos câncer exibiu uma expressão RRM2 negativo tiveram melhor prognóstico, e, portanto, o número desses pacientes que receberam terapia contendo cisplatina foi muito limitada. Além disso, muitos fatores de confusão teria de ser modificada, incluindo a profundidade do estroma invasão, o grau do tumor, tamanho do tumor, invasão vaginal ou parametrial, metástases em linfonodos e protocolos de quimioterapia. Nós não poderia, portanto, analisar a influência da expressão RRM2 sobre os pacientes que receberam cisplatina com uma significância estatística. Mais estudos são necessários para definir a influência da RRM2 sobre o efeito exato da cisplatina.

Até o momento, poucos estudos têm investigado a implicação de RRM2 em câncer cervical. Nossos resultados sugerem que RRM2 poderia ser um novo marcador molecular para o diagnóstico e resultados clínicos de cancro cervical. Ele está envolvido na carcinogénese do colo do útero e prevê sobrevivência pobre, e pode ser um alvo terapêutico potencial no tratamento, incluindo a cisplatina.