Abstract

Tratamento de

EGFR

-mutant não-pequenas pacientes com câncer de pulmão de células com o erlotinib inibidores da tirosina quinase ou resultados gefitinib em altas taxas de resposta e sobrevida livre de progressão prolongada. Apesar do desenvolvimento de abordagens de detecção de mutação sensível, uma validação completa destes em um ambiente clínico tem sido até agora inexistente. Foi realizada, em um ambiente clínico, uma validação sistemática de didesoxi sequenciamento ‘Sanger “e pyrosequencing contra sequenciamento paralelo em massa como um dos mais sensíveis tecnologias de detecção de mutação disponíveis. anotação mutacional de amostras de tumores de pulmão clínicos revelaram que de todos os pacientes com uma resposta confirmado para

EGFR

inibição, única sequenciamento paralelo em massa detectado todas as mutações relevantes. Em contraste, a sequenciação didesoxi perdido quatro respondedores e respondedores pyrosequencing perdeu duas, indicando uma falta de sensibilidade dramática de sequenciação de didesoxi, o que é amplamente aplicada para este fim. Além disso, a quantificação precisa de alelos mutantes revelou uma baixa correlação (r

2 = 0,27) das estimativas histopatológicos de conteúdo tumor e frequência de alelos mutantes, questionando assim a utilização de histopatologia para a estratificação de espécimes para procedimentos analíticos individuais. Nossos resultados sugerem que a sensibilidade analítica reforçada é criticamente necessário para identificar corretamente os pacientes que responderam ao

EGFR

inibição. Mais amplamente, nossos resultados enfatizam a necessidade de uma avaliação exaustiva de todas detecção de mutações métodos contra sequenciamento paralelo em massa como um pré-requisito para qualquer aplicação clínica

Citation:. Querings S, Altmüller J, Ansén S, Zander T, Seidel D , Gabler F, et al. (2011) Avaliação comparativa da mutação Diagnostics na Clínica Lung Cancer espécimes. PLoS ONE 6 (5): e19601. doi: 10.1371 /journal.pone.0019601

editor: Markus Schuelke, Charité Universitätsmedizin Berlim, NeuroCure Centro de Pesquisa Clínica, Alemanha |

Recebido: 07 de dezembro de 2010; Aceito: 02 de abril de 2011; Publicado em: 05 de maio de 2011

Direitos de autor: © 2011 Querings et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Aid alemão do cancro, como parte dos Centros de Excelência em programa de Oncologia para o Centro de Integrado de Oncologia Köln – Bonn e pelo Ministério Federal Alemão de Ciência e Educação (BMBF) como parte do programa nacional Genome Research Network (NGFNplus , concede 01GS08100 e 01GS08101) para Jürgen Wolf, Peter Nürnberg e Thomas romano. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

interesses concorrentes:. Roman K. Thomas recebeu apoio de pesquisa da AstraZeneca e recebeu palestra ou consultoria taxas de Roche , Boehringer Ingelheim, Johnson Johnson, AstraZeneca, Lilly, Merck, Atlas Biolabs e Sanofi-Aventis. Jürgen Lobo recebeu apoio para pesquisa e serviu como consultor para a Roche e AstraZeneca. apoio à pesquisa mencionados nesta seção não foi utilizado para a realização deste estudo. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

Inicialmente limitada a tumores raros, como crônica leucemia mielóide (LMC) ou tumores estromais gastrointestinais (GIST), o sucesso do tratamento de quinases activadas mutacionalmente com inibidores de cinase atingiu o grupo dos tumores frequentes “sólidos” e assim profundamente alterado oncologia clínica. Tratamento de pacientes que sofrem de

EGFR

cancros -mutant com

EGFR

inibidores leva a resposta objectiva [1], [2], [3], a uma duplicação na sobrevida livre de progressão, em comparação à quimioterapia padrão e para a sobrevivência global a longo [4], [5]. pares semelhantes de lesões genômicas e medicamentos direcionados são

BRAF

mutação e

BRAF

de inibição [6]

PARP

de inibição e

BRCA1 /BRCA2

mutações [7 ], [8] ou

PDGFRA

/

KIT

mutação e imatinib [9]. À luz dos actuais esforços para sequenciar sistematicamente os genomas de todos os principais tipos de tumor (https://www.icgc.org/ou www.cancergenome.nih.gov), a lista de tumores geneticamente definidas que são suscetíveis a uma terapêutica específica intervenção é provável expandir dramaticamente nos próximos anos. Juntas, estas observações sugerem a necessidade de crescimento rápido para detecção da mutação sensível e preciso em amostras clínicas como parte do atendimento clínico de rotina.

Infelizmente, apesar de parecer trivial, aplicação clínica de detecção de mutações encontra ambos os problemas relacionados com Amostra-e metodológicas : em primeiro lugar, a maioria das amostras clínicas disponíveis são fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) biópsias de pequeno porte, ou espécimes citológicos normalmente produzindo quantidades limitadas de DNA de baixa qualidade, os quais afetam seriamente amplificação por PCR e análises subsequentes. Além disso, a composição do tumor, bem como vários tipos de células não neoplásicas afectam a detecção de mutações somáticas específicas do tumor em um fundo de não-mutante, alelos “de tipo selvagem”. Em segundo lugar, as abordagens convencionais de sequenciação falta de sensibilidade para a detecção de tais alelos raros.

Vários métodos foram estabelecidos para oferecer uma detecção sensível de mutação, incluindo toda a extracção de ADN, amplificação por PCR e análise de mutações por sequenciação subsequente ou ensaios baseados em genotipagem [ ,,,0],10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19]. Em vários casos, o enriquecimento de células de tumor é conseguida a detecção de mutações antes, por exemplo, por microdissecação assistida por laser de espécimes de tumores [15], [17]. Infelizmente, há uma falta quase universal da validação da detecção de mutações clinicamente relevante abordagens em contextos clínicos contra uma abordagem padrão ouro sensível.

Temos recentemente introduzido sequenciamento paralelo em massa para a detecção de mutações em espécimes clínicos cancro [20]. Tais abordagens são amplamente considerado para proporcionar a maior sensibilidade actualmente disponíveis para esta finalidade, devido à capacidade de provar alelos mutantes raras em um fundo predominante de alelos de tipo selvagem em todos os espécimes de tumores [20]. Além disso, esta abordagem não é restrita a uma selecção a priori de mutações consideradas relevantes. Portanto, sequenciamento paralelo em massa é ideal para validar outras metodologias de detecção de mutação.

Neste estudo, temos validado duas abordagens de detecção de mutação baseado em sequenciamento (dideoxy- e pyrosequencing) contra o sequenciamento paralelo em um ambiente clínico, tendo em conta o conteúdo da célula do tumor, bem como a qualidade eo tipo de tecido (por exemplo, FF, FFPE) de cada amostra.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Este estudo foi aprovado pelo Comitê da Faculdade de Medicina da Universidade de Colónia de Ética e todos os pacientes deram consentimento informado por escrito. Um subgrupo de pacientes (n = 9) participaram do julgamento ERLOPET (NCT00568841).

amostras tumorais e linhas celulares

Neste estudo, analisamos 24 amostras tumorais obtidas de 22 pacientes ( Tabela 1). Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética local e todos os pacientes deram consentimento informado por escrito. Um subgrupo de pacientes (n = 9) participaram do julgamento ERLOPET (NCT00568841). espécimes de tumores foram avaliados por um patologista de referência para determinar o teor de células de tumor para dissecção posterior de áreas com maior teor de célula de tumor. linhas celulares de NSCLC ancorando diferente

EGFR

e

KRAS

mutações foram obtidas e cultivadas como descrito previamente (quadro suplementar S1) [21]. O ADN genómico de todas as amostras de tumores e linhas celulares foi extraído utilizando Gentra Gene Pure Kit de tecido (Qiagen) seguido de quantificação do ADN, utilizando reagentes Picogreen dsDNA (Invitrogen).

PCR e sequenciação didesoxi directa

EGFR

exon18-21 e

KRAS

exão 2 e 3 foram amplificados por PCR e genes específicos pares de primers externa e interna (Tabela complementar S2). iniciadores internos estão equipados com a sequência de iniciador de M13 para facilitar a sequenciação. Para as reacções de PCR externos, foi utilizado 5-10 ng (40-60 ng de ADN de baixa qualidade) de ADN genómico. As reacções de PCR foram realizadas num volume total de 50 ul (0,2 uM de cada iniciador, MgCl 2 mM de

2, 200 uM de cada dNTP e 1,25 U HotStarTaq

Além disso

DNA Polymerase Kit (Qiagen)) e as seguintes condições de ciclo: 95 ° C durante 5 min, 30 ciclos a 95 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 1 min e extensão final a 72 ° C durante 10 min. Após ExoSap-TI (Corporação USB) Os produtos de PCR foram bidireccional tratamento sequenciado usando os iniciadores de sequenciação M13-e Big Dye Terminator mistura versão 3.1 (Applied Biosystems) em ABI 3730 (Applied Biosystems). eletroferogramas sequenciação foram analisados ​​por inspeção visual do eletroferogramas e por Mutation Surveyor 2,03 Software (SoftGenetics). análise do comprimento do fragmento de

EGFR

exão 19 foi realizada através de PCR padrão (para-hex-ctggatccagaaggtgaga e Rev-ccacacagcaaagcagaaac) resultando em produtos de amplificação de 118 pb (Ta = 59 ° C) para o tipo selvagem exão 19 . Os produtos de PCR foram analisados ​​em ABI 3700 sequenciador de DNA e marcado por software GeneMarker (SoftGenetics).

pyrosequencing ensaios

Nós projetamos cinco pyrosequencing diferente [22] ensaios para análise de sequenciação de

EGFR

exão 19-21 e

KRAS

exão 2 e 3 (Tabela complementar S3). DNA modelo (6 ng de ADN genómico ou produtos de PCR externos) foi amplificada utilizando HotStarTaq

Além disso

DNA Polymerase Kit (Qiagen) e protocolo padrão (0,2 mM de cada iniciador, dNTPs 160 mM, 2 U enzima) e as condições de ciclismo (45 ciclos e Ta = 59 ° C para a

EGFR

exão 19, Ta = 60 ° C para a

KRAS

exão 2, Ta = 63 ° C para a

EGFR

exão 20, Ta = 61 ° C para a

EGFR

exão 21 e

KRAS

exão 3 e Ta = 60 ° C para a

KRAS

exão 2). Os iniciadores de PCR foram biotinilados reversa para análise posterior pyrosequencing. reações pyrosequencing foram realizadas no instrumento PSQ HS96A utilizando reagentes PSQ HS96A SNP e software de análise pyrosequencing SNP (Biotage AB, Uppsala, Suécia, agora chamado PyroMark ™ Q96MD pela Qiagen). Para estudos de sensibilidade, quantificados produtos de PCR de

EGFR

células -mutant ou

KRAS

células -mutant foram diluídas com o tipo selvagem

EGFR

ou de tipo selvagem

KRAS

amplicons, respectivamente. Pyrosequencing sinais de dados em bruto foram normalizados utilizando sinais de tipo selvagem conhecidos. Significativa chamada mutação foi determinada a partir de ruído experimental pela análise estatística dos dados brutos usando T-test (p≤0,05).

Massively sequenciamento paralelo análise

sequenciamento paralelo em massa foi realizada utilizando o GS FLX Padrão ou química GS FLX de titânio de acordo com protocolos padrão (Roche). bibliotecas amplicon foram gerados utilizando produtos de PCR externos como modelos e protocolos padrão e das condições do regime Faststart Hifi PCR (Roche) (Recurso S4 Tabela). Utilizou-se, em média, 340.000 pérolas por prazo rendendo 80,000-120,000 lê no total e uma cobertura amplicon variando de 600 × 1500 × com um comprimento médio amplicon de 250-300 pb cobrindo todo o exão. Todas as leituras foram alinhados com chromsome 7 e 12 do genoma de referência (hg18) usando BWA [23]. Finalmente, em linha lê foram visualizados e analisados ​​pelo Integrative Genomics Viewer (https://www.broadinstitute.org/igv/). O teste t de Student foi utilizado para comparação da frequência de leitura relativo entre

EGFR mutado

e os tumores de tipo selvagem. Nós definir a taxa de erro de sequenciação para 0,1% em áreas sem homopolímeros [24]. O limiar para a detecção de alelos mutados significativa foi definido usando uma distribuição de Poisson da taxa de erro conhecidos tendo em conta a cobertura levando a um limite de detecção entre 0,3 e 0,5% de alelos mutantes.

Resultados

pacientes e amostras tumorais

de setembro de 2008 a abril de 2009, analisamos pacientes com diagnóstico histológico de CPNPC para a presença de mutações nos exons 18-21 de

EGFR Comprar e exons 2 e 3 do

KRAS

. Os pacientes incluídos neste estudo a análise de mutação não são representativos para a prevalência de tais mutações em NSCLC como eles foram enriquecidos para os casos com maior probabilidade de ser

EGFR

mutação-positiva com base na análise histológica e características clínicas (por exemplo, pulmão adenocarcinoma in nunca ou luz ex-fumantes). Neste estudo de benchmarking, analisamos 24 tumores de 22 pacientes (Tabela 1) para uma comparação sistemática do desempenho de detecção de mutação do dideoxy- convencional e pyrosequencing contra uma das tecnologias de seqüenciamento mais sensível, maciçamente sequenciamento paralelo [20]. O conteúdo das células de tumor de cada uma destas amostras foi estimado por um patologista e variou de 5% a até 95%. As amostras clínicas fixado em formol e (FFPE) blocos de tecido de tumor embebidas em parafina, bem como biópsias (FF) fresco congelado ou lâminas citológicas obtidas a partir de derrames pleurais composto (Tabela 1).

A detecção de mutações clinicamente relevantes por métodos de sensibilidade diferente

Nós realizada pela primeira vez ( “Sanger”) sequenciação convencional baseada em terminação da cadeia didesoxi-nucleotide em todos estes espécimes porque, apesar das suas limitações, este método ainda é a abordagem mais amplamente utilizado para detecção da mutação em amostras clínicas. Determinou-se a sensibilidade desta técnica de sequenciação para a gama de 20-30% dos alelos mutados por mistura de produtos de PCR de

KRAS

linhas de células do tipo selvagem e -mutant (Recurso Fig. S1). A triagem de mutações de 24 amostras de tumores por sequenciação didesoxi revelou eliminações curtas em-frame de nucleotídeos em

EGFR

exão 19 (Tabela 1, Fig. 1A e 1B) em oito amostras e apenas uma amostra (caso 03) abrigava a L858R mutação pontual no exão 21 do

EGFR

(Tabela 1). Além disso, três amostras (caso 19, 24 e 30) tinham mutações em exon 2 do

KRAS

gene (Tabela 1).

A análise de sequenciação de

EGFR

exão 19 foi realizada por sequenciação didesoxi (eletroferogramas nos painéis à esquerda), pyrosequencing (pyrogams nos painéis de média) e sequenciamento paralelo em massa (programas no painel à direita). (A) do tipo selvagem

EGFR

exão 19 detectado por todas as três técnicas de sequenciamento; mutação (B) L747_A750del, P753S detectado por todas as três técnicas de sequenciamento; (C) E746_A750del (Del-1A) mutação identificada por pyrosequencing e sequenciamento paralelo em massa; (D) E746_A750del (Del-1B), apenas detectada por sequenciamento paralelo em massa. del, supressão; Mut, mutação; WT, de tipo selvagem. As setas indicam a posição dos sinais específicos de mutação esperados.

Estamos próximos testaram se pyrosequencing convencional [22] foi capaz de confirmar mutações encontradas por didesoxi sequenciamento e se mutações adicionais podem ser encontradas por este método na coorte de paciente testados. Pyrosequencing oferece detecção quantitativa rentável de variantes de sequências e foi mostrado anteriormente para permitir sensível

KRAS

detecção de mutações no cancro colorectal [12], [25], [26]. A sensibilidade aumentada para a detecção de variantes raros é devido à geração de sinais de não interferência, individuais para os alelos mutantes e de tipo selvagem. Nós estabelecemos ensaios pyrosequencing sensíveis (5-10% alelo mutante), reprodutíveis e lineares para os hotspots de mutação mais proeminentes no

EGFR

e

KRAS

(Recurso Fig. S2, S3, S4, S5 , S6, S7, S8, S9, S10). Pirossequenciao confirmado todas as mutações detectadas por sequenciação de didesoxi (Tabela 1). No entanto, também detectou quatro mutações adicionais em nossa coorte de amostra que tinha sido perdidas por sequenciação didesoxi (Tabela 1, Fig. 1C e Suplementar Fig. S3A, S6B, S9A). Por exemplo, foi detectada a mutação de resistência erlotinib, T790M, na amostra de tumor 10 (teor de células de tumor de 80%) obtidos no momento da recaída (Recurso Fig. S6B) e esta amostra também transportam a eliminação L747_S752del_P753S inicialmente detectado por sequenciação de didesoxi (Tabela 1 e Fig. S4C). Encontramos ainda uma substituição G12a não detectados anteriormente no exão 2 de

KRAS

na amostra de 11 (50% conteúdo da célula tumoral, Suplementar Fig. S9A) e confirmou esta mutação por subclonagem de

KRAS

exão 2 amplicões e de sequenciação didesoxi posteriores (dados não mostrados).

EGFR

exão 19 pirogramas de amostra 27 (células de tumor de 40%) e de amostras de 05 células tumorais (50%) exibiram sinais de fluorescência indicativas quanto à presença de mutações que foram significativamente acima do nível de ruído experimental (Fig. 1C e suplementar Fig. S3A). Fragmento de comprimento análises de

EGFR

exão 19 produtos de PCR validado esta eliminação na amostra 27 (Recurso Fig. S11).

Finalmente, foram empregados massivamente paralela baseada em array pyrosequencing-by-síntese [ ,,,0],20] para validar os resultados obtidos por mutação didesoxi convencional e pyrosequencing. Nós sequenciaram todos os 24 espécimes para um rendimento médio de 1.079 × e uma cobertura mínima de 600 × por exão e espécime. A análise dos dados confirmou a presença de

EGFR

e

KRAS

mutações em 13 amostras inicialmente identificado por ambos, a sequenciação didesoxi e pyrosequencing (Tabela 1). Além disso, sequenciamento paralelo em massa também validou as quatro mutações adicionais que foram recentemente detectados por pyrosequencing sensível:

EGFR

exão 19 eliminações na amostra 05 e 27, a mutação G12a de

KRAS

na amostra 11 e a mutação T790M da

EGFR

na amostra de 10 (Tabela 1). A natureza paralela desta abordagem sequenciamento permitiu quantificação e identificação dessas variantes de baixa frequência preciso. Especificamente, identificou-se a mutação do exão 19 da amostra 05 a ser um de 9 pb deleção em enquadramento que codifica o aminoácido de substituição de eliminação E746_R748del_A750, a uma frequência de 11% de 1315 lê-se (Tabela 1). Além disso, quantificado uma deleção de 12 pb (E746_A750) a ocorrer a uma frequência de 11% de 854 lê na amostra 27 (Fig. 1C). A substituição G12a na amostra 11 estava presente em 21% dos 1358 lê e a mutação de resistência T790M na amostra de 10 ocorreu com uma frequência de 20% de 909 lê (Tabela 1).

Além de validar o anteriormente mutações detectadas sequenciamento paralelo identificados

EGFR

exão 19 eliminações em amostra de 31 e 13-a, que eram indistinguíveis de ruído experimental, tanto didesoxi convencional e análises pyrosequencing. sequenciação paralela permitiu a detecção de um E746_A750del na amostra 31 a uma frequência de 6% de 1081 lê-se (Tabela 1 e Fig. 1D). Notavelmente, esta amostra tinha sido estimado para conter células de tumor de 60% por histopatologia (Tabela 1). Da mesma forma, flowgrams 13a de amostra (células tumorais 5%) revelou uma supressão de 12 pb (L747_A750del_T751P) a uma frequência de, aproximadamente, 8% de 658 lê-se (Tabela 1). Esta mutação foi idêntico ao que já foi detectado por sequenciação de didesoxi em uma outra amostra do mesmo paciente (amostras 13b) com um teor mais elevado de tumor (70%), obtidos no momento da recaída (Tabela 1). Assim, além de validar todas as outras mutações que tinham sido chamados por sequenciação didesoxi (n = 12) e pyrosequencing (n = 16), sequenciamento paralelo em massa identificadas duas amostras mais mutantes que haviam sido perdidas pelos outros dois métodos devido à sensibilidade insuficiente . (Tabela 1 e suplementar Tabela S5)

a seguir analisados ​​de alta qualidade 454 sequenciamento lê (pontuação Phred 30) com o objetivo de detectar mutações T790M que ocorrem em baixa frequência em espécimes obtidos antes da terapia. O exão 20 foi coberta com uma profundidade média de 1018 lê na região do codão 790. em doentes cujos tumores tinham uma deleção do exão 19 ou L858R observou-se um significativamente mais elevado (p = 0,03) número de leituras contendo a mutação em comparação com a T790M pacientes com tipo selvagem

EGFR

(EGFR mut: média = 2,5 /1000; gama 0-7,5 /1000; EGFR em peso:. significa 0,8 /1000 (0-2.3 /1000) Notamos que essas freqüências alélicas estão em o intervalo do limite tecnológico de precisão. no entanto, o número de leituras com T790M foi acima do limiar para a mutação ligando em 27% das amostras com a deleção do exão 19 ou L858R mas em nenhuma amostra sem

EGFR

mutação (Recurso Fig. S12).

em conjunto, sequenciamento paralelo em massa identificou um total de 18 mutações no

EGFR

e

KRAS

resultando em uma sensibilidade de 67% para didesoxi sequenciamento e 89% para pyrosequencing (Tabela 1 e suplementar Tabela S5). Apesar do tamanho limitado do nosso conjunto de amostras, estes resultados sublinham a dramática falta de sensibilidade de sequenciação didesoxi na detecção de mutações clínica.

sensibilidade da detecção da mutação como uma função do conteúdo da célula de tumor

conteúdo de célula de tumor é um parâmetro crítico para o desempenho da detecção de mutações no cancro [20] e é a base para o enriquecimento de células de tumor à base de microdissecação. Por isso, procurou-se analisar o desempenho dos três métodos de análise de mutação como uma função do conteúdo de célula tumoral histopatologicamente estimado. O conteúdo médio do tumor de amostras identificadas como sendo mutantes por sequenciação de didesoxi foi de 78% (intervalo de 35-95%) e 71% (intervalo de 35-95%), no caso de pyrosequencing (Fig. 2A). Todas as amostras, em que didesoxi sequenciamento tinha perdido mutações, continha 80% de células tumorais ou menos. Em contraste, as amostras em que havia perdido pyrosequencing mutações tinha 60% de teor de tumor ou menos (Fig. 2A).

(A) A correlação entre o conteúdo celular de tumor estimado e a frequência real dos alelos mutados determinada por massivamente , os dados de sequenciamento paralelo. Preto, mutações detectadas por didesoxi e pyrosequencing; Verdes, mutações detectadas por pyrosequencing, mas perdeu por sequenciação didesoxi; Vermelho, mutações detectadas apenas por sequenciamento paralelo. (B) Sensibilidade de sequenciação didesoxi, pyrosequencing e sequenciamento paralelo em massa em pacientes com resposta clínica confirmou ao tratamento com erlotinib.

A seguir, avaliou a correlação entre o conteúdo da célula tumoral e frequência de alelos mutados, conforme determinado por sequenciamento paralelo em massa (Fig. 2A). Observou-se uma baixa correlação entre a freqüência do alelo determinação analítica eo conteúdo da célula tumoral (

r

2

= 0,27,

p

= 0,029). Notavelmente, os limites de detecção dos diferentes abordagens determinada por contagem do mutante e de tipo selvagem alelos detectados por sequenciação maciçamente paralelo nos tumores primários foram muito semelhantes às observadas no alelo experiências de mistura inicial (Figs complementares. S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10): 29% para a sequenciação didesoxi e 11% para pyrosequencing (Tabela 1 e Fig 2A).. As frequências alélicas de mutações encontradas por pyrosequencing mas não variou de sequenciação didesoxi entre 11% e 21% (Fig. 2A). As mutações detectadas apenas por sequenciação massivamente paralela ocorreu a frequências de alelos inferiores a 10% (Tabela 1 e Fig. 2A). Surpreendentemente, o conteúdo do tumor nestes casos haviam sido estimada em 60% e 5%, respectivamente. Assim, as estimativas histopatológicos de conteúdo de células tumorais não são preditivos da frequência de alelos mutantes, enquanto a capacidade de detectar mutações é limitada pela freqüência do alelo, mas não pelo conteúdo da célula tumoral.

mutações EGFR e evolução clínica

análises anteriores da associação de

mutações EGFR

e benefícios clínicos induzidos pelo

EGFR

inibição, ocasionalmente, tem produzido resultados inconsistentes em que alguns estudos têm relatado falta de tal associação [ ,,,0],27], [28], [29] Tais inconsistências pode resultar da falha para detectar mutações com sensibilidade e precisão suficiente. Importante, em nossa coorte, única sequenciamento paralelo em massa foi capaz de detectar um sensibilizante

EGFR

mutação no

todas as

pacientes que tinham experimentado uma resposta parcial (de acordo com os critérios RECIST) após o tratamento com erlotinib ( A Fig. 2B). Em contrapartida, apenas 7 dos 11 pacientes com PR confirmou foram detectados por sequenciação didesoxi e 9 de 11 foram identificados por pyrosequencing (Fig. 2B). Assim, apesar da reduzida dimensão do nosso grupo de pacientes, estes resultados suportam a noção de que as diferenças dramáticas na sensibilidade distorcer fortemente a associação entre a presença de

EGFR

mutações ea resposta ao erlotinib. Os pacientes com

EGFR

-wild do tipo tumores e

KRAS

tumores -mutant que receberam erlotinib exibiu doença estável ou progressiva (Tabela 1), de acordo com relatórios anteriores [30].

Discussão

Aqui, mostramos como a sensibilidade limitada de métodos que são amplamente aplicados para diagnósticos clínicos de mutação poderia levar a uma imprecisão fundamental na estratificação genética do paciente. Em particular, a baixa sensibilidade de sequenciação didesoxi levou a erros de diagnóstico em 6 dos 24 espécimes de cancro do pulmão. Se a presença de um

EGFR

mutação tinha sido o critério de inclusão para o tratamento com

EGFR

inibidores, quatro pacientes que não receberam o tratamento correto. Assim, apesar da reduzida dimensão do nosso conjunto de amostras, estes resultados sublinham a insuficiência de sequenciação didesoxi para diagnóstico de mutações do gene do cancro clínicos. Por outro lado, pyrosequencing convencional oferecida sensibilidade melhorada com apenas dois pacientes que estão sendo diagnosticadas. Além disso, sequenciamento paralelo em massa de forma robusta e precisa identificadas todas as mutações presentes no conjunto de dados. Nós ainda mostrar que de sequenciação em paralelo pode detectar mutações preexistentes T790M em uma fracção de 27% de

EGFR

[31]. Estes resultados suportam a conclusão de que sequenciamento paralelo em massa é a tecnologia mais sensível disponível atualmente em diagnósticos clínicos de mutação e sugerem que pyrosequencing pode ser uma alternativa para didesoxi sequenciamento.

Enquanto muitas técnicas surgiram ao longo dos últimos anos para combinar a sempre crescente necessidade de fornecer mutação clínico preciso análises para oncologistas, nenhum destes têm sido sistematicamente aferidos sequenciamento paralelo em massa, o método com maior sensibilidade para a detecção de mutações clínica até à data. Extrapolando a diferenças, tais como os observados neste estudo para o grande número de pacientes com cancro em todo o mundo indicam que muitos pacientes estão a ser mal diagnosticados cada ano. Assim, cuidadosamente desenvolveu abordagens de diagnóstico (incluindo a validação completa contra o sequenciamento paralelo em massa) vai ajudar visando um tratamento eficaz para a população paciente certo.

Microdissecção tem sido amplamente aplicada para aumentar a fração de células tumorais numa dada amostra, a fim para aumentar a sensibilidade de sequenciação didesoxi. Identificação de áreas ricas em tumores é um pré-requisito para tal procedimento. Encontramos, no entanto, apenas uma baixa correlação de conteúdo de células tumorais e frequência de alelos mutantes. Assumimos que uma pesquisa de rotina nas lâminas histopatológicas não pode estimar com precisão o grau de “contaminação” do alelo mutante por células espectadoras saudáveis ​​(tecido pulmonar normal, por exemplo), que obscurecem a frequência do alelo mutante. Assim, microdissection só pode resgatar parcialmente a sensibilidade limitada de sequenciação didesoxi e deve, portanto, ser validado cuidadosamente contra o sequenciamento paralelo em massa.

Outro tema frequentemente discutido é a questão de saber se a genotipagem ou seqüenciamento pode ser a estratégia ideal para clínica detecção de mutações no câncer. Mesmo que os nossos resultados sugerem que pyrosequencing é um método sensível, preciso e de baixo custo para analisar a vasta maioria das amostras com um teor de 20-70% do tumor, outros métodos, incluindo os que se baseiam na genotipagem, pode executar igualmente bem. No caso de mutações hot-spot já conhecidos bloqueados ácido nucleico abordagens (LNA) são capazes de detectar os alelos mutantes que ocorrem a frequências tão baixas como 0,1% [14], [16]. Outras técnicas que podem ter valor na aplicação clínica incluem imuno-histoquímica usando

EGFR

anticorpos específicos para a mutação [32] ou a aplicação de modelos moleculares acoplados por imagem fluorescente [33]. No entanto, é importante ter em mente que a incapacidade intrínseca dos métodos de genotipagem para cobrir todas as mutações relevantes clinicamente, adiciona a qualquer insensibilidade analítica. Com base nestas considerações, somos a favor de detecção da mutação baseada em sequenciação sobre genotipagem. Embora o tamanho da amostra é demasiado limitado para calcular de forma abrangente sensibilidade e especificidade de detecção de mutações, acreditamos que a inferioridade impressionante de sequenciamento Sanger convencional para detectar mutações de oncogenes terapeuticamente relevantes é de considerável interesse para patologistas moleculares e oncologistas clínicos.

em resumo, nós mostramos como tecnologias de sequenciamento com sensibilidade inferior pode não conseguir detectar mutações de oncogenes clinicamente relevantes em pacientes com câncer. Concluímos, portanto, que qualquer novo método para diagnóstico de mutação clínicos devem ser cuidadosamente validados contra sequenciamento paralelo em massa, a fim de fornecer uma análise genética correta, como base para a terapia molecularmente alvo.

Informações de Apoio

Figura S1. estudo

Sensibilidade de sequenciação didesoxi e pirossequencia�o. Diferentes misturas de produtos de PCR de tipo selvagem ou mutante de linhas celulares de NSCLC G12S foram usadas para determinar o limite de sensibilidade de sequenciação didesoxi (~20-30%) e pyrosequencing (~ 5%). sinais específicos de mutação são marcados por asteriscos na eletroferogramas didesoxi (painéis à esquerda) e setas vermelhas em programas (painéis da direita). Mut, mutação; . WT, do tipo selvagem

doi: 10.1371 /journal.pone.0019601.s001

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Figura S2.

sensibilidade e testes de linearidade do

ensaio pyrosequencing EGFR

exon 19. Misturas de E746_A750del (Del-1-A) e os produtos de PCR mutante-tipo selvagem de linhas celulares de NSCLC foram utilizados para analisar o limite de detecção da mutação e a linearidade do ensaio. O ensaio não é sensível a um mínimo de 5 a 10% dos alelos mutantes. sinais específicos de mutação são marcadas por setas vermelhas. del, supressão; Mut, mutação; . WT, do tipo selvagem

doi: 10.1371 /journal.pone.0019601.s002

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Figura S3. análise

pirossequencia�o de

EGFR

exon 19 em amostras de tumores NSCLC. (A)

EGFR

exão 19 eliminação identificado em amostra com o conteúdo da célula tumoral de 50% que anteriormente não foi identificado por sequenciação didesoxi; (B) Não detecção da mutação significativa na 13a amostra com um teor de células tumorais de 5%. posição esperada de sinais específicos de mutação é marcado pela seta vermelha. del, supressão; Mut, mutação; . WT, do tipo selvagem

doi: 10.1371 /journal.pone.0019601.s003

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Figura S4.

pirogramas de

EGFR

exão 19 mutantes amostras de linha celular e tumores NSCLC. (A) mutação Del-B na linha celular HCC827; (B-D) amostras de tumor com um teor de célula tumoral elevada permitindo caracterização exacta da mutação individual;