Sumário

Uma estratégia potencial para o diagnóstico de câncer de pulmão, a principal causa de morte relacionada ao câncer, é identificar assinaturas metabólicas (biomarcadores) da doença. Embora os dados suporta a hipótese de que os compostos voláteis pode ser detectado na respiração de pacientes com câncer de pulmão pelo olfato ou através de técnicas bioanalíticos, a análise das amostras de ar é pesado e tecnicamente desafiador, limitando assim a sua aplicabilidade. A hipótese aqui explorada é que as variações em compostos orgânicos voláteis de baixo peso molecular ( “odorantes”) na urina pode ser utilizado como biomarcador para o cancro do pulmão. Para demonstrar a presença e estruturas químicas de biomarcadores voláteis, estudamos o comportamento e metabolômica de constituintes voláteis de urina guiada por olfativa mouse. ratinhos sensor pode ser treinados para discriminar entre odores de ratos com e sem tumores experimentais que demonstram que a odorantes voláteis são suficientes para identificar os ratinhos portadores de tumor. Consistente com este resultado, as análises químicas dos produtos voláteis urinário demonstrado que as quantidades de vários compostos foram dramaticamente diferente entre ratos e de tumor de controlo. Usando análise de componentes principais e de aprendizagem de máquina supervisionado, que discriminou com precisão entre grupos de tumores e de controlo, um resultado que foi cruzada validado com novos grupos de teste. Embora não foram compartilhadas diferenças entre animais experimentais e de controlo nos dois modelos de tumor, também encontramos diferenças químicas entre esses modelos, demonstrando especificidade à base de tumor. O sucesso desses estudos fornece uma demonstração romance de prova de princípio do diagnóstico de tumor de pulmão através de odores voláteis urinário. Este trabalho deve fornecer um impulso para pesquisas semelhantes para os biomarcadores de diagnóstico voláteis na urina de pacientes com câncer de pulmão humanos

Citation:. Matsumura K, opiekun M, Oka H, ​​Vachani A, Albelda SM, Yamazaki K, et al . (2010) compostos voláteis urinários como biomarcadores para o câncer pulmonar: Um estudo de prova de princípio Usando Odor Signatures no mouse modelos de câncer pulmonar. PLoS ONE 5 (1): e8819. doi: 10.1371 /journal.pone.0008819

editor: Xiaoping Pan, East Carolina University, Estados Unidos da América

Recebido: 15 Agosto, 2009; Aceite: 16 de dezembro de 2009; Publicação: 27 de janeiro de 2010

Direitos de autor: © 2009 Matsumura et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por Panasonic Corporation. Como indicado na secção interesse competindo, um funcionário da Panasonic, Dr. H. Oka, ajudou a conceber a idéia original e revisão do manuscrito. Nenhum outro papel nesta pesquisa foi desempenhado pelo Dr. Oka e Panasonic

Conflito de interesses:. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Panasonic Corporation. Os autores declaram não haver outros interesses concorrentes. Não existem patentes ou patentes pendentes com base no trabalho e não há produtos decorrentes dos trabalhos em desenvolvimento. Nenhum dos autores, além de um co-autor que é empregado por Panasonic (Dr. Oka), temos relações financeiras que poderiam ser percebidas como relevantes, incluindo a propriedade de ações, acordos de consultoria, ou bolsas de viagem ou honorários. Dr. Oka ajudou a conceber a idéia original para este trabalho e revisão do manuscrito, mas os outros co-autores projetaram o estudo, realizado isso, analisaram os dados e escreveu o manuscrito.

Introdução

O cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em quase todo o mundo [1]. O único tratamento que que é alcançada uma elevada taxa de cura é a ressecção cirúrgica da doença precoce (antes de ocorrer a disseminação metastática). Uma vez que apenas cerca de 25% dos casos são diagnosticados, nesta fase inicial, são urgentemente necessárias técnicas de diagnóstico precoce eficazes.

imagem do tórax agressivo e precoce de pacientes de alto risco está emergindo como a abordagem dominante para o diagnóstico precoce, apesar de grandes estudos para validar esta abordagem ainda estão em curso [2], [3], [4]. Infelizmente, apesar de imagem é bastante sensível, é também relativamente não específico. Estudos recentes têm mostrado que entre 5-26% dos pacientes com alto risco de fumar têm nódulos pulmonares detectáveis ​​por rastreio CT, no entanto, apenas uma média de cerca de 4% (com um intervalo de 2-11%) de estes nódulos são malignos [5]. Claramente ressecção cirúrgica de todos esses nódulos não é prático nem desejável. Abordagens para determinar quais nódulos devem ser removidos são, portanto, necessários. Uma estratégia atraente seria combinar uma técnica de imagem sensível com um biomarcador de cancro do pulmão para aumentar a especificidade [6], [7], [8]. Porque a incidência de câncer de pulmão nesta “população nódulo” é significativamente maior do que em populações atuais ou ex-fumadores, biomarcadores, neste contexto, não exigiria extremamente altas sensibilidades e especificidades necessárias para triagem populacional. Outra utilização para tal um biomarcador pode ser a de seguir o curso do tumor após o tratamento.

Com o desenvolvimento de técnicas de alto rendimento para a descoberta de biomarcador [9], o campo de biomarcadores de cancro do pulmão recentemente expandiu substancialmente. candidatos biomarcadores actuais de sangue, expectoração, urina e incluem muitas classes de moléculas, incluindo proteínas, antigénios de tumores, anticorpos anti-tumorais, péptidos específicos do tipo de célula, vários produtos metabólicos, e fenómenos epigenética, tais como ADN-hiper metilados, ARN, e específica a expressão do gene [10]. No entanto, nenhum biomarcador identificado até à data tem sido demonstrado que têm suficiente sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade a ser considerado suficiente para o uso para detectar e monitorar o desenvolvimento do câncer de pulmão.

Outra classe de biomarcadores para o câncer pulmonar pode ser de baixo peso molecular Compostos orgânicos voláteis. Estas moléculas, que podem ser percebidos como odores (especialmente por animais), foram mostrados para funcionar como “assinaturas” que transmitem informações sociais, emocionais e de saúde para outros membros da espécie [11]. Pode haver duas fontes de marcadores voláteis em pacientes com câncer de pulmão. Estudos têm demonstrado que as linhas celulares de cancro de pulmão pode libertar compostos orgânicos voláteis específicas

in vitro

[12]. A presença de um tumor em crescimento também poderia induzir metabólica específica ou alterações nutricionais que poderia alterar a produção ou libertação de tais compostos [6].

A “hipótese volátil” para câncer de pulmão que levou a uma série de estudos examinando o utilitário de análise destes compostos no ar expirado utilizando quer animais (tais como cães) [13] ou técnicas bioquímicas sofisticadas [14], [15]. Alguns desses estudos têm mostrado promessa. Por exemplo, um estudo recente a partir do grupo Chen [16], utilizando micro-extracção em fase sólida, seguido por cromatografia em fase gasosa mostrou que o 1-butanol e 3-hidroxi-2-butanona foram encontrados em concentrações significativamente mais elevadas na respiração de pacientes com cancro do pulmão comparado com os controlos. Dragonieri et ai. usou um “nariz eletrônico” e foram capazes de discriminar pacientes com câncer de pulmão versus aqueles com doença pulmonar obstrutiva crônica com relativamente alta sensibilidade e especificidade [17].

Infelizmente, coleta, manuseio, armazenamento, concentrando-se e analisando respiração amostras é complicado, tecnicamente desafiador, e, portanto, pode não ser fácil de aplicar amplamente. Uma solução parcial para estes problemas seria a utilização de uma fonte muito mais conveniente de voláteis, tais como amostras de urina, embora a urina, como a respiração, irá incluir não só voláteis endógenos, mas também aqueles exógenas a partir de fontes tais como a dieta eo ambiente. A este respeito, de Willis et al. (2004) relataram que os cães podem ser treinados para distinguir pacientes com cancro da bexiga com base no odor da urina com mais sucesso do que seria esperado apenas pelo acaso [18]. Infelizmente, um estudo de acompanhamento por Gordon ET1 al. [19] não foi capaz de reproduzir estes resultados em amostras de urina de pacientes com câncer de mama e de próstata.

Com base nestas considerações, a hipótese explorada neste trabalho é que as variações no pequeno peso molecular de compostos orgânicos voláteis ( “Fragrância “) na urina pode ser utilizado como biomarcador para o cancro do pulmão. Uma das dificuldades principais na tentativa de identificar inicialmente biomarcadores voláteis de pacientes humanos é a grande variação que pode ser devido a variáveis ​​não controladas, tais como as diferenças genéticas e dietéticas, uso pessoal de produtos de cuidados e outras variáveis ​​ambientais que possam ter impacto voláteis odor corporal. A observação de que os cães podem, aparentemente, filtrar essas distrações potenciais e focar a assinatura da doença (ver acima) sugere que podem existir biomarcadores potencialmente úteis.

À luz destes desafios, nós eleito para exercer um animal mais altamente controlado abordagem do modelo [20], [21], onde muitas das variáveis ​​que tornam o trabalho paciente tão difícil pode ser controlada (Figura 1A). A nossa estratégia foi a primeira demonstram que os ratos podem ser treinados para discriminar amostras de urina de ratos com tumores de ratinhos de controlo pelo odor sozinho. Uma vez que tinha estabelecido isso era possível, nós então utilizado perfil metabólico (em fase sólida-microextração, seguido por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa) para mostrar que poderíamos identificar padrões específicos de compostos voláteis na urina que poderão distinguir ratos portadores de tumores dos animais de controlo .

(A) Visão de procedimento experimental. Nós empregamos rato olfactiva comportamento guiado (esquerda) e metabolômica (à direita) se aproxima. (B) As células LKR e células LLC foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos machos adultos e o tamanho do tumor foi medido semanalmente. Cada ponto de tempo mostra a média ± SEM tamanho do tumor. linha sólida: dados reais; linha pontilhada: curva equipado com função cúbica; LKR: y = 0,092 * x

3 – 2,8 * x

2 + 38 * x – 18, LLC: y = 0,16 * x

3 – 0,83 * x

2 + 3,5 * x – 4. rato urina foi coletada individualmente uma vez por dia e foi usado para análise química e por bioensaio durante os períodos indicados: para LKR – dias 15-24 e 25-37 para a formação e dias 2-7, 9-14, 15-20 e 25-37 para a generalização; Para LLC – Dias 17-26 para a formação e Dias 1-8, 9-16 e 17-26 para a generalização. (C) Boxplot dos escores de generalização para bioensaios e as correlações entre os testes. As caixas azuis representam os quartis inferior e superior. A barra horizontal vermelha em cada caixa indica a mediana. A linha tracejada representa o intervalo de observações. O sinal de mais (+) marca observações extremas outlier. *;

P Art 0,01, **;

P Art 0,001, ***;

P Art 0,0001 em comparação com a hipótese nula de um 50% pontuação generalização. Da esquerda, LKR-treinados rato urina generalização para LKR urina do rato (Formação 1, Figura 1C-i); LKR- treinados rato generalização urina para LKR urina do rato (Training 2, Figura 1C-ii); LLC treinado rato urina generalização para LLC rato urina (Figura 1C-iii); rato urina generalização treinou-LKR para LLC rato urina (Figura 1C-iv); LLC treinado rato urina generalização para LKR urina do rato (Figura 1C-v).

Resultados

Mouse modelos de câncer de pulmão

Os tumores de pulmão derivado de células de rato linhas têm semelhanças na morfologia, histopatologia e características moleculares com adenocarcinomas de pulmão humano e pode servir primeiros como modelos úteis [22]. Foram utilizadas duas linhas celulares de cancro de pulmão de rato, LKR que foi derivado de um animal transgénico que expressa mutado Kras e LLC, o carcinoma pulmonar de Lewis que surgiu espontaneamente. Os tumores foram induzidos por inoculação de cada uma destas linhas celulares em diferentes grupos de ratinhos (ratinhos de controlo foram injectados com o veículo, solução salina, sobre a mesma programação). As curvas de crescimento do tumor para estas duas linhas celulares apresentaram padrões semelhantes (Figura 1B). Com base em curvas de crescimento do tumor, foram coletadas amostras de urina que se estendeu estágios de crescimento do tumor para bioensaios e para análises químicas mais tarde.

Detecção olfativa de urinária Odor

Nós treinamos ratos sensor (ver métodos) para discriminar entre os odores de amostras rato urina coletadas de ratos LKR-injectados com tumores grandes (dias de injeção de células 25-37 pós) em comparação com ratos de controlo geneticamente idênticos sem tumores. Quando esta foi bem-sucedida, foi testada para determinar se esta aprendizagem generalizado para as fases iniciais do desenvolvimento do tumor. Como mostrado na Figura 1C-I, os ratinhos treinados distintos com sucesso entre urinas colhidas a partir de ratinhos com tumores em 25-37, 15-20 e 9-14 dias após a injecção, mas não se generalize a tumores em fases muito precoces (Dias 1-7 ). Em seguida, nós treinamos mais estes mesmos ratos sensor utilizando urinas coletadas nos dias 15-24 após a injeção. Embora estes ratos generalizada esta formação a novos amostras coletadas de ratos com tumores do mesmo tamanho, eles não fazê-lo por urinas coletadas nos dias 9-14 ou 1-7 (Figura 1C-ii). As experiências de controlo verificou que os ratos treinados para não fez distinção entre ratos injectados e não injectados antes de injecções, o que demonstra que não houve viés na urina do rato original ou o aparelho Y-maze.

Para investigar a generalidade deste resultado, nós treinamos um grupo separado de ratos sensores de discriminar urinas dos ratos com- e sem tumores LLC-induzidos. O padrão de resultados foi quase idêntico ao que com tumores induzidos por LKR (Figura 1C-III).

próxima perguntado se os odores associados com os tumores LKR e LLC foram perceptualmente semelhante, por meio de testes os ratinhos treinados em amostras de urina de ratos com vs. ratinhos de controlo do modelo animal diferente do que eles tinham sido treinados por diante. Isto é, foi perguntado se os ratos treinados para discriminar urinas dos ratos com e sem tumores induzidos LKR reconheceria (generalizar esta resposta a) ratinhos portadores de tumor LLC e vice-versa. A resposta foi afirmativa (Figura 1C-vi e -v). Estes resultados mostram que os tumores induzidos por estas linhas celulares de cancro produzir comuns. (Embora não idênticos; ver abaixo) biomarcadores voláteis que podem ser reconhecidos pelos sistemas olfactivos de ratinhos

Caracterização de compostos voláteis urinário

a seguir, caracteriza-se a natureza da variação química distinguir os ratinhos com tumores de aqueles sem por análise de compostos voláteis urinário com fase sólida-microextracção, seguido por cromatografia gasosa acoplada com espectrometria de massa. Do total de cromatogramas típicos de iões (TICs) um grande conjunto diverso de picos podem ser distinguidos (Figura S1). Quarenta e sete picos foram seleccionados para a identificação das TIC com base no seu ter suficientemente grandes alturas de pico e tiques não sobrepostos, conforme determinado por inspecção visual. Como pode ser visto na Tabela 1 e S1, os picos foram composta por uma variedade de estruturas químicas e são potencialmente envolvida em várias funções biológicas, por exemplo em comunicação de feromonas (2-heptanona, 3,4-desidrogenase

exo

-brevicomin e 2-

seg

-butil-4,5-di-hidrotiazole, 6-hidroxi-6-metil-3-heptanona,

β

-farnesene [23]). Também foram identificados compostos previamente relatados na urina humana (nitrometano, sulfona dimetil,

o

-toluidina, ácido 2-etil-hexanóico [24]).

A seguir, utilizadas análises quantitativas destes 47 picos para determinar se os ratos com e sem tumores experimentalmente induzidas poderiam ser distinguidas. Variação nas alturas dos picos em bruto mostrou claramente as diferenças nas quantidades relativas de vários compostos com base na presença ou ausência de tipos tumorais e de cancro (Figura 2A e Figura S2). Observamos mudanças relativamente consistentes para muitos picos e para ambos os grupos tumorais com o padrão mais comum sendo uma diminuição da produção (down-regulation) nos grupos de tumor e quer um aumento da produção (aumento da regulação) ou a mudança insignificante nos grupos placebo (Figura S3). Por exemplo, pico de 13 (5-hepeten-2-ona) foi regulada para baixo drasticamente como consequência da presença do tumor (Figura 2B). Deste modo, uma diminuição da regulação geral de compostos voláteis pode ser uma característica comum do crescimento do tumor. No entanto, houve outros padrões de mudança para uma minoria de compostos voláteis. Por exemplo, a produção de (ácido 2-etil hexanóico) 37 pico foi elevada em ambos os grupos de tumor. Alterações em outros picos dependia tipos de cancro (e /ou estirpe de ratinho). Peak 29 (acetofenona) foi sub-regulação no grupo LKR-tumoral e aumento da regulação no grupo LLC-tumor enquanto a maior foi 33 sub-regulação apenas no grupo tumor LKR. A trama matriz da imagem (Figura 2C) mostra claramente os efeitos diferenciais gerais de crescimento do tumor.

(a) Comparação entre a fase inicial e fase tardia de 4 picos ilustrativos seleccionados a partir de 47 picos analisados. eixo vertical indica a intensidade (quantidade) de TIC; linhas verticais ao redor média indicam SEM em cada ponto de amostragem. O azul representa a fase inicial enquanto que o vermelho representa a fase tardia. eixo horizontal indica o tempo de retenção. (B) enredo Bar da intensidade de 4 picos ilustrativos seleccionados a partir dos 47 picos analisados. pico de intensidade média é representada em cada pico. As barras vermelhas representam grupos tumorais; barras azuis representam grupos de controle. Um fundo azul pálido indica uma diferença significativa em

P Art 0,0001 entre os grupos de tumores e de controlo. (C) intensidade crua de 47 analisados ​​picos obtida subtraindo o período de início do período posterior (n = 25 para cada um dos 4 grupos). cinza mais escuro significa o pico aumentou após o desenvolvimento do tumor enquanto que o cinza mais claro significa o pico diminuiu seguir o desenvolvimento do tumor.

Discriminação de Tumor e placebo Grupos em

A seguir, procedeu à criação de perfil metabolômica para estatisticamente discriminar entre grupos e identificar os picos característicos. Para este fim, combinou duas abordagens diferentes: análise de componentes principais (PCA) e máquina de vetor de suporte (SVM). A primeira, APC, permite que a estrutura de um conjunto de dados para ditar a separação das amostras em grupos com base na semelhança global em valores de pico, sem conhecimento prévio da identidade da amostra. A parcela de pontuações de PCA calculados a partir dos valores normalizados dos 47 picos mostrou uma separação distinta do perfil química entre os grupos de tumor e os grupos de placebo em ambas as linhas celulares de cancro (Figura 3A e 3B). Em segundo lugar, foi utilizada uma abordagem de aprendizado de máquina supervisionado baseado no SVM para determinar o limite entre grupos tumorais e grupos placebo. Este algoritmo considerado o primeiro de dois componentes principais, PC1 e PC2, para criar descrições de amostras neste espaço tridimensional alta, e, em seguida, definido um hiperplà melhor que separa as amostras a partir das duas classes. O classificador SVM separadas com sucesso as amostras dentro do tumor e placebo categorias (exibidos no contorno bem com a cor de azul para vermelho na Figura 3A e 3B). O SVM classificadas com sucesso a maioria dos indivíduos que dão uma exactidão de classificação de 94% com uma sensibilidade de 88% e uma especificidade de 100% (LKR) e uma precisão de 94% com uma sensibilidade de 100% e especificidade de 88% (LLC). Notavelmente, apenas 3 dos ratos 50 individuais em nosso conjunto de teste foram classificados erroneamente. Assim, os picos seleccionados contêm elementos químicos que distinguem tumor de ratinhos que receberam placebo.

A separação dos grupos tumorais e placebo por Princípio Análise de Componentes (PCA) e sua determinação de limite de Support Vector Machine (SVM) são mostrados em A (LKR ) e B (LLC). Os círculos representam os indivíduos de grupos tumorais e triângulos representam indivíduos de grupos placebo (vetores de suporte: círculos sólidos e triângulos). O contorno cor de fundo, que vão do vermelho ao azul, indica a probabilidade de classe para diferentes regiões do avião.

Cross Validação e Combinação essencial de Peaks

Para validar estas análises, empregaram um método de validação cruzada de 10 vezes usando todas as 25 amostras. Para posterior análise, foram selecionados 11 picos dos 47 picos originais que diferiam entre os grupos tumorais e placebo com um

P Art 0,0001 (Tabela 1). Nós treinamos o classificador SVM através da aplicação de todas as combinações logicamente possíveis, sem repetições destes 11 picos para cada um dos dois sistemas modelo (LKR e LLC). O desempenho generalização dos classificadores SVM empregando diferentes conjuntos de grupos de pico foi ilustrado na receiver operating espaço característica (ROC). Não existe um único pico classificadas com sucesso com uma precisão superior a 95%. No entanto, a classificação com vários pares de picos resultou em uma exactidão de até 98 ± 2% para LKR e 100% para a LLC (Tabela 2-I, -II e Tabela S2, S4 Figura), confirmando que melhor generalização depende de uma combinação de picos. Em análises posteriores (dados não mostrados) descobrimos que SVM teve desempenho superior ao Fisher Análise Discriminante, que usou métodos de aprendizagem não supervisionada. Assim, os clusters pico característico pode diferenciar de forma confiável grupos tumorais de grupos placebo e pode ter potencial diagnóstico.

Para avaliar o poder de generalização dos clusters de pico para um novo grupo, criamos conjuntos de treinamento independentes (13 de as 25 amostras) e conjuntos de teste (manteve-se 12 amostras). Os classificadores SVM treinados com os 11 conjuntos de pico selecionados do conjunto de treinamento gerado uma melhor combinação de picos, com uma precisão de 95% para LKR e de 100% para LLC para testar conjuntos (Tabela 2-iii, -v e Tabela S3, S5 Figura ).

Embora as linhas celulares LKR e LLC são diferentes sistemas modelo e que foram injectadas em diferentes estirpes de ratos consanguíneos (provável que se diferenciaram em odores corporais), os nossos estudos comportamentais sugeriu que partilhavam odores comuns indicativos da presença ou a ausência de tumores. Isto também se verificou ser o caso nas análises metabolômicos. O grupo de picos (cluster) que melhor previu estado LLC a partir dos dados LKR como determinado por SVM (Tabela 2-iv) tinha uma precisão de 98%. Por outro lado, o grupo de picos que melhor preditos LKR de LLC (Tabela 2-VI) tinha uma precisão de 91%. Apenas um pico (# 22; ver Tabela 2-iv, -vi) era comum a estes dois conjuntos de agrupamentos de previsão. Classificação por outros clusters de pico também gerou alta precisão do diagnóstico (95%), com potencial diagnóstico substancial (Figura S6).

Interativo Efeito de Tumores e linhas celulares

Mesmo que houvesse semelhanças entre os dois modelos de tumor, mais análises estatísticas demonstraram também que os efeitos dos dois modelos de tumor nos perfis metabólicos não eram idênticos. As interacções entre duas linhas diferentes de células (LKR e LLC) e do tumor vs. placebo foi analisada com 2-análises de variância (grupos de tumores e de placebo para cada um dos dois modelos de tumor) para cada um dos 47 picos (Figura 4 e S7 ). A interação significativa indica especificidade tumor. Das 47 análises separadas, a interação w’as significativa (

P Art 0,05) em 11 casos (Tabela S3). Para controlar falsos positivos devido ao teste 47 picos, restringimos consideração a 4 picos (N.º 1, 7, 29 e 33) com

P Art 0,002. Estas interacções são ilustradas na Figura 4 onde, por exemplo, pico 29 mostra nenhuma diferença entre o tumor e o placebo (

P

= 0,0387), mas uma grande diferença entre os modelos de tumor (

P

= 0,0002) . Existe uma especificidade suficiente para distinguir entre os perfis voláteis dos dois tipos de tumor.

intensidade normalizada (no eixo vertical) dos quatro picos (A-D) em que um ANOVA de duas vias indicadas significativa (

P Art 0,002) interações que indicam diferenciação entre os dois modelos de tumor. O eixo horizontal de cada um dos painéis 4 (A-D) indica as duas fases, cedo – antes do desenvolvimento do tumor significativo sobre a esquerda e depois – após o desenvolvimento de tumores de tamanho significativo. Vermelho: tumor, Azul: placebo, Circle: LKR, Star:. LLC

Discussão

A identificação de biomarcadores voláteis na urina para o diagnóstico da doença é uma área de grande promessa, no entanto, é baseado em pesquisa com seres humanos antes limitado. Os dados deste papel são consistentes com a hipótese de que os compostos voláteis diagnosticamente úteis são produzidos em pacientes com cancro do pulmão e secretada na urina, proporcionando assim suporte para esta abordagem de diagnóstico no contexto de cancro do pulmão.

Especificamente, os nossos estudos mostraram que olfacto animal em espécies como o rato (que tem um sistema olfactivo sensível [25], [26]), pode ter sucesso de diagnóstico na detecção de assinaturas do cancro do pulmão na urina. Mais importante, nós fomos capazes de imitar essa capacidade usando técnicas bioanalytic. Isto sugere que será possível criar um sensor biomimética com base no conhecimento do sistema olfactivo para o rastreio de substâncias odoríferas de diagnóstico que pode ser prático para aplicações generalizadas [27], [28], [29], [30]. Com efeito, as leveduras geneticamente modificadas que expressam um receptor olfactivo e o seu sistema de transdução de sinal tenham sido mostrado para ser capaz de detectar 2,4-dinitrotolueno, um composto de diagnóstico de explosivos [31]. olfacto artificial com um epitélio e modelo de polímero glomérulos poderia detectar odores imitando assim um sistema olfativo biológica [32]. Em última análise, tais sensores poderia levar ao desenvolvimento de kits de testes comercialmente disponíveis. No entanto, parece também que o perfil metabólico (em fase sólida-microextração, seguido por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa) é uma alternativa viável, que deve ser mais explorado.

A origem metabólica de muitos dos biomarcadores de diagnóstico que identificado não é conhecida e não foi possível identificar características químicas comuns. Em vez disso, eles tiveram suas origens em qualquer uma variedade de caminhos bioquímicos endógenos ou exógenos a partir de () fontes ambientais. Estes últimos compostos (por exemplo,

o

-toluidina, e ácido 2-etil-hexanóico) são susceptíveis de ser úteis para o diagnóstico. Entre os metabolitos endógenos, 2-heptanona, uma feromona, está relacionado com o aumento da concentração em ratos estressadas, e foi observado na urina humana [33]. 6-hidroxi-6-metil-3-heptanona tem também sido anteriormente identificado na urina de rato, apesar de podermos encontrar nenhum relatório deste composto em urina humana. A variação observada de cetonas como uma função do crescimento do tumor sugere que as vias de ketogenesic podem estar envolvidos nestes modelos de cancro do pulmão. seria necessária mais investigação para determinar qual destes metabolitos de diagnóstico são de origem do tumor e originárias de processos metabólicos normais e são ou jusante ou sobre-regulada pelos tumores.

A infra-regulação comum observamos seguinte o desenvolvimento do tumor em muitos dos compostos é notável. A maioria dos biomarcadores relatados por outros investigadores foram sobre-regulada. Uma explicação para esses diferentes resultados podem residir com estratégias de detecção utilizados por outras pessoas para identificar biomarcadores. Em algumas investigações, pode haver um viés em direção a uma pesquisa para a novela (e, portanto, regulado para cima) compostos biomarcadores enquanto os nossos métodos não tinha tal viés. Outra possibilidade é que esta frequentes para baixo-regulação resultados de efeitos complexos do tumor no metabolismo do animal

Embora SVM encontrados conjuntos de picos que previa entre os dois modelos de câncer (LKR a LLC e vice-versa:. Tabela 2) com alta precisão, os aglomerados foram principalmente diferente para a previsão nas duas direcções. Este resultado parece ser incompatível com os estudos de treino de animais que indicaram que os ratos treinados para discriminar em um dos modelos de tumor generalizadas essa resposta sem mais treinamento para o outro modelo aprendido. Isto implica que haja um conjunto de compostos voláteis (Fragrância) comuns aos dois modelos de tumor que diferenciam a partir de ratinhos não-tumorais. Uma provável explicação para essa aparente anomalia é que as combinações de componentes voláteis que identificamos com classificadores SVM não são os mesmos que os ratos são cueing em on durante o treinamento e teste; talvez existam outros componentes em comum com os dois modelos que ainda não identificados. Se este for o caso, uma das seguintes desafios será identificar estes novos biomarcadores. Alternativamente, notamos que havia um composto que era comum a previsão em ambos os sentidos (# 22) e não podemos excluir a possibilidade de que era este composto os ratos usados ​​para fazer a distinção em ambos os casos.

Um consideração importante para qualquer ferramenta de diagnóstico prática é a sua capacidade para discriminar entre os diferentes tipos de doenças. Embora os dois modelos de cancro do pulmão têm claramente semelhanças nos perfis voláteis, eles também têm diferenças suficientes que possam ser discriminados em análises metabolômicos (Figura 4). Esta capacidade de discriminar entre modelos de rato estreitamente relacionados de câncer de pulmão implica que tipos específicos de câncer podem ser passíveis de diferenciação diagnóstica por meio de análises de perfis voláteis como ilustrado na pesquisa atual.

Os trabalhos futuros com modelos animais poderia prosseguir ao longo de três linhas convergentes. Primeiro, é importante monitorar as mudanças no desenvolvimento de marcadores em fases anteriores do desenvolvimento do tumor. Não só isto é relevante para determinar o quão cedo marcadores de diagnóstico pode ser detectado mas poderia lançar luz sobre os potenciais mecanismos subjacentes mudanças na voláteis, como consequência da progressão do tumor. Em segundo lugar, uma variedade de diferentes tipos de tumor deve ser investigada, para além dos dois mais estreitamente relacionados descritos aqui. Isso também poderia fornecer pistas importantes quanto ao mecanismo. Em terceiro lugar, os estudos in vitro em células tumorais será crucial para a compreensão dos mecanismos.

Em resumo, fomos capazes, pela primeira vez para identificar assinaturas químicas voláteis na urina de rato modelos de câncer de pulmão usando rigorosa experimental comportamental e analítico técnicas. A importância deste estudo é que ele estabelece a viabilidade do uso voláteis urinário para detectar câncer de pulmão. A capacidade de facilmente recolher e armazenar amostras de urina será uma grande vantagem dessa abordagem sobre a análise volátil no ar exalado. Embora este estudo tem levantado muitas dúvidas sobre a identidade e origem dos compostos detectados em nossos modelos de ratos, não estamos planejando a prosseguir nesta direcção. Em vez disso, vemos neste estudo como uma prova importante do principal para o valor de estudar voláteis de urina usando técnicas bioquímicas e de bioinformática no diagnóstico de câncer de pulmão humano (e talvez outros tipos de câncer). Assim, começamos estudos clínicos com pacientes humanos. Estes estudos irão abordar questões-chave sobre sensibilidade, especificidade, o tamanho dos tumores que podem ser detectados com precisão, os mecanismos subjacentes as mudanças observadas nos perfis voláteis, a capacidade de generalizar entre os diferentes tipos de cancros do pulmão, e o impacto do tabagismo atual ou anterior .

Materiais e Métodos

linhas celulares de cancro do pulmão

o Kras induzida por câncer de pulmão murino (LKR) e carcinoma de células do pulmão de Lewis (LLC) linhas celulares foram adquiridos a partir do ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA).