Abstract

resistência à quimioterapia observada em pacientes com câncer colorretal (CRC) pode estar relacionada com a presença de células-tronco cancerosas (CSCs), mas o mecanismo (s) subjacente permanecem obscuros. fibroblastos associados a carcinoma (FAC) estão intimamente envolvidos na recorrência do tumor, e orientando-as aumenta quimio-sensibilidade. Nós investigamos se fibroblastos podem aumentar CSCs mediando assim a resistência à quimioterapia. CSCs foram isolados a partir de qualquer paciente xenoenxertos-derivado ou linhas celulares de CRC com base na expressão de CD133. Em primeiro lugar, os CSCs foram encontrados para ser inerentemente resistentes à morte celular induzida por quimioterapia. Além disso, o meio condicionado derivado de fibroblastos (CM) promovido percentagem, clonogenicidade e o crescimento do tumor de CSCs (isto é, CD133 + e TOP-GFP +) aquando do tratamento com 5-fluorouracilo (5-FU) ou oxaliplatina (OXA). Novas investigações exibiu que exossomos, isoladas de CM, semelhante levou os efeitos acima. A inibição da secreção de exossoma diminuiu a percentagem de crescimento, e tumor de clonogenicidade CSCs. Ao todo, os nossos resultados sugerem que, além de segmentação CSCs, novas estratégias terapêuticas que bloqueiam a secreção de FAC antes mesmo de quimioterapia devem ser desenvolvidos para obter melhores benefícios clínicos em CRCs avançados

Citation:. Hu Y, Yan C, Mu L, Huang K, Li X, D Tao, et al. (2015) exossomas fibroblastos derivados Contribuir para chemoresistance através de células-tronco cancerosas Priming no câncer colorretal. PLoS ONE 10 (5): e0125625. doi: 10.1371 /journal.pone.0125625

Editor do Academic: Christopher Heeschen, Espanhol Centro Nacional do Câncer (CNIO), ESPANHA

Recebido: 04 de janeiro de 2015; Aceito: 24 de março de 2015; Publicado em: 04 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Hu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (. nos 81172065, 81272660), Programa de New Century excelentes talentos em University (No. NCET-12- 0208), Fundação de Pesquisa Científica para os Retornados ultramarinos estudiosos chineses, Ministério de Educação do Estado (No. JYBHG201002), os Fundos investigação fundamental para as universidades Central (Hust, No.01-18-540005), Tongji Fundos hospital para os Retornados cientistas no exterior e destacados cientistas Jovens (2012yq004) (todos para JCQ). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, assim como a mortalidade tem vindo a aumentar nas últimas décadas [1]. Quimioterapias não melhoraram dramaticamente os resultados clínicos de pacientes com recidiva ou metastático CRC. Uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes resistência no CRC é imperativo para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas mais eficazes que podem beneficiar pacientes com CCR.

CRC é heterogênea, manifestando morfologias celulares variadas e apresentações histopatológicos. A evidência experimental para a existência de células-tronco cancerosas (CSCs) no CRC foi recentemente mostrado usando amostras de tumores primários humanos CRC [2, 3]. CSCs são hipótese de ser intrinsecamente resistentes à quimioterapia. Os CRCs recorrentes após tratamento de quimioterapia são frequentemente enriquecidos para as células que expressam marcadores CSC tais como ABCB5 [2, 4]. No entanto, os mecanismos subjacentes ainda estão sendo definidos.

fibroblastos Carcinoma-associados (FAC) estão intimamente envolvidos na manutenção e progressão tumoral. FAC também são relatados para desempenhar papéis importantes na regulação da sensibilidade do tumor a uma variedade de quimioterapias, orientando-as e diminui drasticamente o quimiorresistência [5, 6]. Aqui, primeiro, confirmar que a quimioterapia preferencialmente alvos não-CSCs devido à resistência autônoma celular de CSCs, e ainda descobrir que FAC CSCs de primeira linha e aumentar a resistência à droga após a quimioterapia através de exossomos CAF derivados.

Material e Métodos

Ética Declaração

amostras de tecido de adenocarcinoma colorretal foram obtidos de pacientes que foram submetidos a procedimentos cirúrgicos no Hospital Tongji de Tongji Medical College, Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os sujeitos de pesquisa e todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia (IRB ID: 20141106) e foram conduzidas de acordo com os princípios da Declaração de Helsinki .

O anticorpo e reagentes

monoclonais, CD133 anti-humana e anticorpos anti-EpCAM humanos rato foram comprados da Miltenyi Biotec (Sede, Alemanha). O anticorpo anti-α-SMA foi obtido da Dako (Dinamarca). Anti-FAP foi comprado de Abcam (Cambridge, Reino Unido) e anti-vimentina foi adquirido a Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Anti-Wnt3a e anti-beta-actina foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (CA, EUA). Cabra Alexa Fluor 488 conjugado com IgG anti-ratinho foi obtido a partir de Jackson ImmunoResearch (Pensilvânia, EUA). GW4869, 5-fluorouracilo (5-FU) e oxaliplatina (OXA) foram adquiridos a Sigma (St. Louis, EUA). Matrigel foi obtido a partir B.D. (Franklin Lakes, NJ).

As linhas celulares e de cultura de células

As células humanas de câncer de cólon (SW620) e células de fibroblastos humanos derivados de tecidos normais do cólon (18Co) foram adquiridos da American Type Culture Collection (Manassas VA). fibroblastos associada a cancro (FAC) foram isoladas a partir de espécimes de cancro colorrectal. células SW620, células 18Co e FAC derivadas de tumores primários foram cultivados em meio DMEM (Invitrogen, California, EUA) suplementado com (Life Technologies, NY, USA) de FBS 10% com um C incubadora humidificada a 37 ºC com uma atmosfera de 5% de CO

2 e 95% de ar.

Preparação de suspensões de células isoladas a partir de tumores

tumores colorectais primários ou tumores de xenoenxerto foram picados completamente para o tamanho de um milímetro

3 e, em seguida, suspenso em meio DMEM /F12 (Invitrogen, California, EUA) contendo 1,5 mg /ml de colagenase ⅳ (Invitrogen, California, EUA), 20 ug /ml de hialuronidase (Sigma, St. Louis, EUA), 1% de penicilina /estreptomicina (Life Technologies, NY , EUA) e 1,25 mg /mL de anfotericina B (Sigma, St. Louis, EUA) a 37 ° C durante 1 hora. Após a digestão, os tecidos foram lavados com PBS e filtradas através de uma malha de 40μm (BD Falcon, CA, EUA). Para eliminar as células vermelhas do sangue, as células foram incubadas em tampão de lise de glóbulos vermelhos (eBioscience, Califórnia, EUA) em gelo durante 10 minutos e lavadas duas vezes com PBS. As células foram então ressuspensas em PBS para experimentos.

O isolamento da FAC e estabelecimento de tumores de xenoenxerto CRC (XhCRC)

Para isolar FAC, as células individuais obtidos a partir de um paciente do sexo feminino com Duke B adenocarcinoma colorretal foram cultivadas em DMEM com 10% de FBS. Depois incubou-se durante 3 horas, as células não aderentes foram lavadas com PBS, deixando as células aderentes que consistia principalmente em macrófagos, células epiteliais e fibroblastos. Após cultura durante vários dias, os macrófagos e células epiteliais morreram, deixando as células que eram do tipo fibroblastos e consistentemente α-SMA, vimentina e FAP positivo. culturas de fibroblastos primários foram utilizados para experiências até à passagem 10. Para estabelecer modelo de tumor xenoenxerto CRC, as células colorectais primários individuais de câncer derivadas de um paciente do sexo feminino com Duke C adenocarcinoma colorretal foram implantados no dorso bilaterais de NOD fêmea /SCID.

de células activadas por fluorescência (FACS) e purificação de CD133

+/- células CRC

a FACS foi realizada de acordo com as instruções do fabricante, utilizando um classificador de células FACS Aria II (BD, Biosciences, CA , EUA). Para separar CD133

+ e CD133

– células /lo em células SW620, as células foram marcadas com anticorpos CD133 anti-humanos de rato PE /APC-conjugado. Geralmente, apenas a parte superior (CD133

+) e inferior (CD133

– /lo) 10-20% das células foram purificados fora. Para separar CD133

+ e CD133

– /células Lo em xenoenxertos, tumores XhCRC foram dissociadas de células isoladas como descrito acima e, em seguida, coradas com rato APC conjugada rato CD133 e conjugado com PE anti-humano EpCAM anti-humano anticorpos, e EpCAM

+ CD133

+ e EpCAM

+ CD133

– /células lo CRC foram purificados a

análise morte celular

a morte celular de. CSCs e não CSCs foi avaliada usando a contagem celular Kit-8 (Dojindo, Japão). Resumidamente, as células foram semeadas em meio completo a 3000 células /poço em placas de 96 poços. Depois de 12 horas após sementeira, as células foram tratadas com 5-FU (1