Abstract

O câncer de próstata (PCA) é a segunda principal causa de mortalidade relacionada ao câncer, depois do câncer de pulmão, nos homens dos países desenvolvidos. Na sua fase inicial, o crescimento do tumor primário é dependente de androgénios, deste modo, geralmente podem ser controlados por terapia de privação de androgénio (ADT). Eventualmente, no entanto, a doença progride para o cancro da próstata resistente à castração (CRPC), uma forma letal em necessidade de tratamentos mais eficazes. receptores acoplados à proteína G (GPCRs) compreendem uma grande clã de proteínas de superfície celular que têm sido implicados como alvos terapêuticos em crescimento CaP e progressão. Os resultados aqui apresentados fornecem evidência intrigante de um papel para o GPR158 membro da família glutamato recém caracterizado pelo crescimento APC e progressão. Descobrimos que GPR158 promove a proliferação de células CaP independente de receptor de androgénio funcionalidade (AR), o que requer a sua localização no núcleo da célula. Isto sugere que GPR158 age por mecanismos diferentes de outros GPCRs. expressão GPR158 é estimulada por andrógenos e GPR158 estimula a expressão AR, o que implica um potencial para sensibilizar tumores para condições de baixa de andrógeno durante a ADT através de um ciclo de feedback positivo. Além disso, encontramos a expressão GPR158 se correlaciona com um neuroendócrino (NE) fenótipo diferenciação e promove a formação de colónia independente de ancoragem o que implica um papel para GPR158 na progressão terapêutico e formação de tumores. expressão GPR158 foi aumentada na frente de invasão de tumores de próstata que se formou no geneticamente definido condicional

Pten

modelo de camundongo knockout, e co-localizada com expressão AR elevada no núcleo da célula. A análise de Kaplan-Meier em um conjunto de dados a partir do portal do genoma do câncer Memorial Sloan Kettering mostrou que a expressão aumentada GPR158 em tumores está associado a sobrevida livre de doença inferior. Nossos resultados sugerem fortemente que os produtos farmacêuticos destinados atividades GPR158 poderia representar um novo e abordagem inovadora para a prevenção e gestão de CRPC

Citation:. Patel N, Itakura T, Jeong S, Liao CP, Roy-Burman P, Zandi E, et al. (2015) Expressão e papel funcional da Orphan Receptor GPR158 no crescimento do cancro da próstata e progressão. PLoS ONE 10 (2): e0117758. doi: 10.1371 /journal.pone.0117758

Editor do Academic: Craig N. Robson, Instituto Norte para Pesquisa do Câncer, REINO UNIDO

Recebido: 07 de agosto de 2014; Aceito: 23 de dezembro de 2014; Publicação: 18 de fevereiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Patel et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of bolsas de saúde [R01-EY09828] para MEF e [R01-CA136924] para GAC. O prêmio Robert E. e maio R. Wright Foundation para NP e MEF também prestou apoio para a realização deste estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e ter os seguintes interesses concorrentes. Nitin Patel e M. Elizabeth Fini são co-inventores em um provisória Pedido de Patente US intitulado “GPR158 como um novo alvo para terapia de câncer de próstata”, aplicada pela University of Southern California (USC). Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

G receptores acoplados à proteína (GPCRs) compreendem um grande clã de proteínas de superfície celular que realizar diversas funções celulares. GPCRs detectar informação sobre o ambiente e tipicamente transduzir um sinal para a célula por ligação e activação das proteínas G heterotriméricas em cima do ligando extracelular de ligação [1]. Os membros deste clã têm sido amplamente explorado para descoberta de drogas e uma grande fração dos medicamentos actualmente utilizados nos GPCRs alvo de mercado [2]. GPCRs são classificados em sete famílias através de análise filogenética de sua característica definidora: O domínio de sete transmembrana (7TM) [1]. A família glutamato GPCR contém 7 receptores órfãos, três pertencentes ao ramo receptor do ácido gama-aminobutírico: GPR156, GPR158 e GPR179 [3,4]. GPR179 foi recentemente demonstrado ser necessário para a função da célula bipolar despolarizante na retina, e mutações causam completa cegueira nocturna estacionária congénita autossómica recessiva [5,6]. Duas publicações recentes fornecem muito a primeira caracterização de GPR158 [7,8]. A primeira expressão GPR158 identificado nos neurónios bipolares da retina e demonstrado um papel incomum como uma proteína de andaime membrana plasmática, a funcionar para inibir a sinalização por GPCR que se acoplam com a família inibidora de proteínas Galpha por ligação a Gbeta5 e recrutamento de membros da família R7 de GTPase Activar proteínas (BPA) para a membrana do plasma [7]. A segunda publicação foi do nosso laboratório [8]. Identificamos expressão GPR158 em células de rede trabecular (TBM) nas vias de drenagem do humor aquoso do olho e seu papel na regulação da função de barreira celular, possivelmente contribuindo para a fisiopatologia da hipertensão ocular induzida por esteróides e glaucoma.

Procura outra possíveis papéis para GPR158, identificamos um estudo publicado que mostra microarray GPR158 como um dos genes regulados positivamente em tumores metastáticos ablação resistente androgénio, em comparação com tumores da próstata primários [9]. Outro estudo microarray de expressão gênica mostrou a regulação negativa de GPR158 por retirada de estrogênio em células de câncer de mama sensível ao estrogénio humano, ou pelo tamoxifeno tratamento (anti-estrógeno) [10]. Talvez não por coincidência, ambos os tipos de câncer envolvem a resposta aos hormônios esteróides alterada. O câncer de próstata (PCA) é a segunda principal causa de mortalidade relacionada ao câncer depois do câncer de pulmão em homens de países desenvolvidos [11]. Inicialmente, a proliferação de células CaP depende de andrógenos, assim, a terapia de privação de andrógeno (ADT) é o principal tratamento para pacientes com localmente avançado CaP. ADT fornece remissão da doença em mais de 90% dos pacientes, no entanto a duração da resposta é tipicamente de 2-3 anos. Apesar do tratamento ADT, o PCA metastático e retorna doença recorrente após falha de tratamentos localizados [12], um processo conhecido como CaP resistente à castração (CRPC). Em geral, os pacientes CRPC metastático tem um tempo médio de sobrevivência de apenas 16-18 meses e que a doença permanece incurável [13].

É amplamente reconhecido que CRPC desenvolve através de vários mecanismos, incluindo receptor de andrógeno (AR) vias dependentes tais como a amplificação e sobre-expressão de AR [14]; síntese de andrógenos locais [15]; expressão alterada de proteínas co-activador AR e co-repressores; e vias AR-independentes tais como os percursos de sobrevivência alternativos [16]. A segmentação da via de AR foi mostrado para oferecer a abordagem mais viável para os novos agentes terapêuticos uma vez que AR permanece activa em CRPC [17]. Outro foco terapêutico possível para a terapia PCA é o fenótipo de células neuroendócrinas (NE). Este tipo de célula ocorre em focos dispersa dentro de adenocarcinoma prostático, semelhante à sua distribuição dentro das células epiteliais do ducto da próstata normais. No entanto, a densidade de células de NE é muitas vezes maior em carcinomas da próstata do que em tecido normal, e estudos mostraram que a diferenciação NE (NED) é enriquecido em tumores de alto grau e de fase alta, e estreitamente associada com o aparecimento da CRPC [18 -20]. células epiteliais da próstata são acreditados para transdiferenciam para células NE, que são mostrados para ser diferente da população pequena de células NE presentes na próstata normal, [18-20]. células NE pode promover a proliferação de células de adenocarcinoma adjacentes num estado carente de androgénio, levando a CRPC [21], o qual é suportado pelas observações de maior índice de proliferação de células CaP proximais às células NE, em comparação com as células cancerosas distal [22, 23]. Além disso, estudos de cultura de células tenham demonstrado que neuro-hormonas e neuropeptídeos secretadas por células NE pode suportar o crescimento independente de androgénios de células CaP [24,25]. No entanto, a origem exacta e os factores causadores de NED permanecem desconhecidos. Portanto, a identificação de novos genes e mecanismos moleculares em ligar estas múltiplas vias responsáveis ​​pela patogênese da CRPC é extremamente necessárias para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas.

PCA é tipicamente associada com alterações genéticas envolvendo sensibilidade androgênica ea AR [26] . Neste relatório, nós investigamos a expressão, regulação molecular, localização subcelular e papel funcional de GPR158 usando um conjunto de quatro linhas de células humanas APC com diferentes alterações na AR resultando em vários graus de andrógeno-responsividade, andrógeno-sensibilidade e expressão AR. Nós combinamos isso com uma análise do rato modelo APC e bioinformática de conjuntos de dados CaP humanos. Nossos resultados sugerem que a elevação de expressão GPR158 é um evento oncogénico importante que estimula a proliferação de células CaP e progressão e, portanto, pode representar um alvo terapêutico inovador.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

células epiteliais da próstata humana primárias (PHPECs) foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e mantidas, de acordo com as suas instruções, utilizando o meio basal das células epiteliais da próstata contendo kit de crescimento celular. Quatro linhas celulares de CaP humanas mantidas em um dos nossos laboratórios (Coetzee) foram utilizados nestes estudos: LNCaP, C4-2B, PC-3 e DU145, todos obtidos originalmente a partir do ATCC. células LNCaP e C4-2B foram cultivadas em meio RPMI completo, enquanto DU145 e células PC-3 foram cultivadas em meio DMEM (Gibco-BRL, Bethesda, MA), ambos contendo 10% de soro fetal de vitelo (FCS) a 5% de CO

2 a 37 ° C. As células foram divididas a cada 3 dias.

A linha de células de LNCaP foi estabelecida a partir de um nó de linfa lesão metastática de adenocarcinoma prostático humano. células LNCaP expressar o Ar que transporta a mutação T877A comum no domínio de ligação ao ligando, criando especificidade de ligação esteróide ampla. Eles são responsivos aos andrógenos, exibindo estimulação do crescimento quando tratados com andrógenos, e eles também são andrógeno-dependentes, passando por paragem do crescimento após a retirada de andrógenos [27-29]. As células foram C4-2B derivada de uma metástase óssea que cresceram em ratos nus após a inoculação com as células, C4-2 resistente à castração derivado de LNCaP [30,31]. Assim como as células LNCaP, células C4-2B são responsivos aos andrógenos. Consistente com isto, eles retêm um AR funcional, embora ele exibe menor afinidade para andrógenos que a AR nas células LNCaP [32]. No entanto, ao contrário das células LNCaP, células C4-2B são andrógeno-insensitive, porque após a retirada de andrógenos que não se submetem a parada do crescimento [33]. As linhas celulares DU145 PC-3 e foram estabelecidas a partir de adenocarcinoma da próstata humano, para o cérebro ou metastático do osso, respectivamente. As linhas de PC-3 e DU145 de células utilizadas neste estudo foram previamente caracterizados por um dos nossos laboratórios (Coetzee) [34]. Ambas as linhas são andrógeno-nonresponsive e andrógeno-insensitive. O PC-3

AR + sub-linha empregue neste estudo expressa níveis baixos de mRNA e proteína de AR. Embora tal não resulte na proteína funcional de androgénio suficiente para conferir responsividade, AR expressão ectópica consistentemente eliciada uma resposta transactivação muito maior neste sub-linha do que no PC-3

AR sub-linha. As células DU145 são AR negativo. Realizamos nossa própria western blot para confirmar a ausência ou presença de proteína AR nessas duas linhas (S1 Fig.).

Tratamento de PHPEC, LNCaP e C4-2B células com o andrógeno, dihidrotestosterona (DHT, 10nM ), foi realizada em meios de cultura contendo soro despojado-carvão a 10% (CSS) para esgotar androgénios. Para os estudos de fome andrógenos, LNCaP, células PC-3, DU145 e foram cultivadas em 10% de CSS

Reagentes e o oligonucleótido iniciadores

Os reagentes utilizados no estudo foram comprados como se segue:. LTX lipofectamina com reagente PLUS (Invitrogen, Carlsbad, CA); os anticorpos primários para a AR, antigénio específico da próstata (PSA), neurónio enolase específica (NSE), receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e do factor de transcrição Sp1, e rábano anticorpos secundários conjugados com peroxidase (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-domínio intracelular (ICD) e o domínio extracelular de anti-(ECD) GPR158 anticorpos e anticorpos anti-alfa-tubulina (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO); Anti-beta actina anticorpo (Abcam, Cambridge, Reino Unido); high-Fidelity DNA polimerase, Phusion (Finnzymes Inc., Woburn, MA); oligonucleotídeos iniciadores (Valuegene Inc, San Diego, CA); carvão despojado de soro fetal bovino (Atlanta Biologicals Inc., Lawrenceville, GA). Todos os outros reagentes foram adquiridos de Sigma. A Tabela 1 proporciona as sequências de todos os oligonucleótidos iniciadores utilizados neste estudo. Para experiências knockdown, foi utilizado um conjunto de três oligonucleotídeos projetados siRNA (GenePharma Co. Ltd, Shanghai, China), cuja actividade foi caracterizada anteriormente [8].

Quantitativa em Tempo Real reverso transcrição-PCR (qRT-PCR)

O RNA total isolado a partir de linhas celulares de APC com o ARN total Aurum Mini kit (Bio-Rad, Hercules, CA) foi submetido a análise de qRT-PCR utilizando iScript um passo RT- kit de PCR com SYBR Green (Bio-Rad) em CFX96 real-Time PCR Detection System toque (Bio-Rad), de acordo com as instruções do fabricante. valores de quantificação relativa de genes de interesse foram calculados como 2

-ΔΔCt pelo método comparativo Ct, onde ΔΔCt = (ARNm alvo Ct do gene de referência tratada sample- Ct da amostra tratada) – (Ct-alvo de ARNm de controlo amostra-Ct gene de referência da amostra de controlo). Utilizou-se a beta-actina ou GAPDH como gene de referência. Os iniciadores utilizados para a estimativa de GPR158, AR, PSA e expressão de NSE estão apresentados na Tabela 1.

Análise Western Blot

Os lisados ​​celulares totais foram preparados utilizando o ensaio de radio-imunoprecipitação (RIPA) de tampão de lise (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 0,1% de SDS, 0,5% de desoxicolato de sódio, 1% de NP-40) cravado com um cocktail de inibidores de protease, durante 20 minutos, seguido por centrifugação a 10.000 g durante 10 min. Os sobrenadantes foram recolhidos e as proteínas nos extractos foram separados por SDS-PAGE sem ferver as amostras e transferido para membranas de PVDF. As membranas foram sondadas com o anticorpo primário contra proteína de interesse e foram desenvolvidos por quimioluminescência com uma solução de reagentes Luminol intensificador e uma solução de peróxido (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, Reino Unido) e as imagens foram capturadas com sistema de imagem Fujifilm (LAS-4000; Fujifilm, Tóquio, Japão). carga de proteína foi monitorizada por meio de extracção e reprobing da membrana com anticorpo de beta-actina.

construções de expressão

três construções de expressão (GPR158-pcDNA3.1 (+), GPR158 GPR158 e-GFP-NLS -M1 + 2-GFP) utilizado para estes estudos foram descritos anteriormente [8]. Também gerou uma outra construção de fusão GPR158-GFP, designado como GPR158: Sc (AA 1-665), com toda a eliminação ICD utilizando iniciadores apropriados listados na Tabela 1.

Transient transfecção

A As células indicadas foram transfectadas com plasmídeos de expressão ou construções de siRNA ou plasmídeos repórter do promotor, utilizando o reagente Lipofectamina LTX de acordo com as instruções do fornecedor. Resumidamente, 1-2 × 10

5 células /cavidade em 2 ml de meio completo foram semeadas em placas de seis poços e cultivadas até 70-80% de confluência. ADN (2? G) foi diluído em 500 uL de Opti-MEM I + Plus reagente (2 mL), incubados durante 5 min, foi adicionado LTX Lipofectamina (4,5 ul) e incubou-se durante 30 min. meio celular foi substituído com antibióticos frescos 2 mL de meio livre e a mistura foi adicionada, e incubada durante 6 horas. A seguir à incubação, os complexos foram substituídos com meio de crescimento completo. Aos 3 dias pós-transfecção, as células foram processadas para análise quer qRT-PCR ou blotting ou célula de contagem ocidental.

Lentivírus Produção e transdução celular

ADNc GPR158 foi sub-clonado a partir do pcDNA 3.1 (+), vector de expressão acima descrito, no vector de expressão de lentivírus pSLIK (Addgene, Cambridge, MA). A produção e a infecção por lentivírus foi realizada como descrito [35]. Resumidamente, o empacotamento virai foi realizada em culas 293T HEK, após co-transfecção do pSLIK-GPR158, dois plasmídeos de empacotamento pMDLg /pRRE e pRSVREV, e G de VSV plasmídeo envelope usando Lipofectamine 2000. Os vírus foram colhidas 72 horas após a transfecção, e o partículas virais são concentradas. As células LNCaP foram infectadas a uma MOI de baixo para assegurar 30% de frequência de infecção e as células estáveis ​​(Lenti-GPR158) foram gerados com a selecção de higromicina a 400 ug /mL para 4-semanas. Para a indução de GPR158, as células LNCaP estáveis ​​foram tratados com 100 e 500 ng /ml de doxiciclina (Dox) durante 72 horas. As células LNCaP infectadas com partículas virais geradas com apenas vector pSLIK (Lenti-vector) foram usadas como um controlo negativo. Após 3 dias de indução Dox, as células foram sujeitas a qualquer mancha ou células contagem ocidental ou ensaio de proteína de fraccionamento subcelular ou ensaio de formação de colónia em agar mole.

Fraccionamento subcelular

fraccionamento subcelular foi efectuada utilizando o kit de fraccionamento subcelular da proteína de acordo com as instruções dos fabricantes (Thermo Scientific Inc, Rockford, IL). Este kit foi mostrado para isolar citoplasmática, membrana, solúvel nuclear, a cromatina ligado e do citoesqueleto fracções de pureza suficiente para a localização de proteínas e de redistribuição estudos [36]. Resumidamente, uma separação por fases de compartimentos celulares a partir de 3 × 10

6 de células indicadas foi realizada após a aplicação do citoplasmática fornecido, membrana, solúveis em água, tampões de extracção ligado a cromatina e proteína do citoesqueleto nucleares. A concentração de proteína em cada fração foi estimada utilizando o kit estimativa de proteína BCA (Thermo Scientific Inc.) e a quantidade indicada de proteínas foi submetido a transferência de western.

Formação de Colónias Ensaio

O lenti- GPR158 ou lenti-vector linhas de células LNCaP foram usadas para o ensaio de formação de colónia. Resumidamente, as células foram plaqueadas numa placa de 12 poços (5.000 células /poço). As células foram suspensas em fenol livre de RPMI-1640 contendo vermelho 10% de FBS e 0,48% de agar, e sobreposta sobre uma camada sólida do mesmo meio contendo 0,8% de agar. As células foram induzidas no meio acima contendo 100 ng /mL Dox, ou deixada sem tratamento, com reposição suave dos seus meios de comunicação a cada 3 dias. Após 2 semanas de incubação, a placa foi corado com 0,005% de violeta cristal (Merck Chemicals Inc, Gibbstown, NJ), descorados durante a noite com PBS e as colónias foram contadas sob o microscópio e fotografado no × 20 ampliação.

imuno-histoquímica (IHC) Análise na condicional

Pten

knockout mouse

o condicional

Pten

modelo de camundongo knockout foi criado na Universidade do Sul da Califórnia por dois dos co-autores do neste estudo [37]. análise IHC de GPR158 e de expressão AR foi realizada em todos os três (ventral, dorsolateral e anterior) lóbulos derivado da próstata de um 10 meses de idade condicional homozigoto

Pten

rato knockout (

Pten

– /-) e um controle pareados por idade correspondente (

Pten

+ /+

). Resumidamente, os tecidos da próstata foram fixadas em formaldeído a 4% e os blocos de amostras foram cortadas em 5 mm de espessura, desparafinados em xileno e re-hidratadas utilizando um gradiente decrescente de etanol seguido por lavagem com bidestilada H

20. Para recuperar a antigenicidade, as lâminas foram incubadas com tampão de 10 mM de citrato (pH 6,0), lavadas com tampão de fosfato 0,1 M, bloquearam-se com peróxido de hidrogénio a 0,3% em metanol durante 15 min e com soro de cabra a 5% em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram incubadas com anticorpo anti-CID GPR158 (1: 100) ou anticorpo anti-AR (1: 200) em soro de cabra a 1% a 4 ° C durante a noite, seguido por incubação com anticorpo secundário biotinilado anti-coelho (Vector Laboratories, Burlingame , CA) durante 1 h e estreptavidina peroxidase de rábano (Vector Laboratories) durante 30 min e, em seguida visualizados por kit de DAB (Vector Laboratories). As lâminas foram subsequentemente contrastadas com 5% (w /v) de hematoxilina de Harris. As lâminas contendo secções de parafina da próstata a partir de sujeitos humanos normais e PCA foram fornecidos pelo núcleo e processados ​​utilizando o procedimento acima.

Análise estatística

Os resultados são expressos como a média ± erro padrão de a média (sE) o significado das diferenças nos valores médios entre amostras não tratadas e tratadas foi determinada pelo teste t de Student após determinar que os dados atender a uma distribuição normal.

Resultados

Efeitos GPR158 na Proliferação celular

para investigar o significado da expressão GPR158 para APC, foi realizada uma série de experiências usando linhas de células humanas APC com diferentes alterações na AR, resultando em vários graus de andrógeno-responsividade, andrógeno-sensibilidade e AR expressão, tal como descrito na secção Materiais e Métodos. Primeiro, avaliou os níveis de ARNm de GPR158 e proteína endógena por PCR quantitativo em tempo real e Western blotting, respectivamente. O rápido crescimento, linhas de androgénio-insensível DU145 e PC-3 (tempo de duplicação 1,5-2 dias) expressaram níveis mais elevados de ARNm de GPR158 (Fig. 1A) e de proteína (Fig. 1B), em comparação com as células de crescimento mais lento da linha LNCaP e o seu derivado C4-2B (tempo de duplicação de 2-3 dias). O nível de proteína nas células GPR158 mais rápido crescimento foi de aproximadamente 2-3 vezes mais elevada em comparação com as células de forma mais lenta de crescimento.

(a) a análise de RT-PCR da expressão de ARNm de GPR158 em linhas celulares de CaP indicados (B) análise de transferência de Western para a detecção de proteína GPR158 GPR158 utilizando anticorpo anti-CDI em lisados ​​de células inteiras de linhas celulares de CaP indicados. A mesma membrana foi sondada para a beta-actina, que serviu como um controlo de carga. A linha vertical indica reposicionado pistas de gel a partir da mesma membrana para coincidir com o fim de exemplo da Fig. 1A. (C, D, E) Todas as quatro linhas celulares indicadas CaP foram transfectadas a 70% de confluência com o plasmídeo de expressão GPR158 ou pcDNA3.1 vazio (+) vector (C e D) ou qualquer GPR158 ARNsi de controlo ou ARNsi mexidos (E), como indicada usando o reagente Lipofectamine LTX e incubadas em meio de crescimento durante 3 dias em placas de cultura de 6 poços. (C, E) Após 3 dias, as células tripsinizadas foram contadas utilizando o corante azul de tripano numa câmara de hemocitómetro. (D) transferência de Western para a detecção de GPR158 em lisados ​​de células inteiras a partir de células isoladas transfectadas com os plasmídeos indicados, utilizando anticorpo anti-CID GPR158. (F) O ARN total foi isolado a partir de células DU145, que foram transfectadas com a concentração indicada de GPR158 quer ARNsi de controlo ou ARNsi mexidos para análise dos níveis de ARNm de GPR158 por qRT-PCR. GAPDH foi o controle de referência interna. (C, E, F) Os dados mostram significa ± SE de 3 experiências independentes, cada uma realizada em duplicado. *** P 0,001; ** P 0,01; * P 0,05; ns, p . .05

Para avaliar o possível papel biológico de GPR158 na regulação da proliferação celular de células CaP humanos, realizamos transfecções transitórias com o vector de expressão de mamífero GPR158 descrito anteriormente [8]. As linhas celulares transfectadas com vector sozinho foram usadas como controlo. O efeito sobre a proliferação celular foi quantificada após 3 dias de transfecção. Transient sobre-expressão de GPR158 em células do LNCaP, C4-2B e linhas DU145 conduziu a uma taxa significativamente superior de proliferação celular em 3,88, 2,15 e 2,77 vezes, respectivamente, em comparação com células transfectadas com o vector vazio (Fig. 1C ). Transient sobre-expressão de GPR158 mostrou apenas um aumento marginal na proliferação de células PC-3, no entanto, este foi o mais rápida proliferação das quatro linhas celulares sem GPR158 sobre-expressão, levantando a possibilidade de que a taxa de proliferação pode já ser máxima . A sobre-expressão de GPR158 aos 3 dias pós-transfecção foi confirmada em lisados ​​de células inteiras por transferência Western; um claro aumento nos níveis de proteína GPR158 foi observada em todas as linhas celulares (Fig. 1D).

Para avaliar o papel de GPR158 endógena na proliferação de células APC, foi realizada a experiência inversa por sub-regulação de GPR158 através da abordagem de siRNA. Nós previamente relatado a caracterização de um pool de três oligonucleótidos de ARNsi, demonstrando 80-90% knockdown da expressão da proteína GPR158 em células PC-3 de 100 nM, de um modo reprodutível [8]. Nós transfectadas cada uma das quatro linhas celulares de APC com 100 nM de ARNsi esta piscina. Depois de 3 dias de transfecção, foi observada inibição significativa do crescimento (aproximadamente 50%) em todas as quatro linhas de células, em comparação com o seu respectivo siARN mexidos transfectadas células de controlo (Fig. 1E). Confirmou-se o knockdown dose-dependente da expressão de ARNm de GPR158 por transfecção da piscina siRNA, com aproximadamente 90% de inibição a 100 nM de ARNsi em células DU145 (Fig. 1F) e cerca de 75-90% nas outras linhas de células (dados não mostrado).

Em conjunto, estes resultados indicam que o nível de proteína endógena GPR158 expressão controla a taxa de proliferação de células APC, independentemente do androgénio-responsividade, androgénio-sensibilidade ou estado AR-expressão da linha de células humana CaP usado.

Efeitos de um andrógeno no GPR158 expressão

para descobrir fatores que regulam a expressão GPR158, que procurou a aplicação NextBio “fármaco Atlas” [38] que encontra compostos e tratamentos significativamente correlacionados a um gene com resultados classificados em ordem de significância estatística. A nossa busca usando “GPR158”, como a consulta identificou o andrógeno, DHT como o mais importante e o primeiro na lista de compostos correlacionados. Os resultados revelaram 7 estudos independentes realizadas utilizando células LNCaP e todos os estudos mostraram um aumento da expressão de mRNA GPR158 com o tratamento com DHT na gama de 1,28-3,57 vezes (S2 Fig.).

Para determinar experimentalmente se GPR158 é um gene andrógeno responsivo, realizamos experimentos curso de tempo de tratamento DHT, comparando PHPECs responsivos aos andrógenos e andrógeno-sensíveis e células LNCaP e andrógeno-sensível, mas andrógeno

células C4-2B insensível

. Os resultados representativos são mostrados na Fig. 2. Em células PHPECs e LNCaP, GPR158 ARNm e os níveis de proteína aumentou 3-4 vezes com o tratamento com DHT em 24 horas (Fig. 2, A, B, E e F). Em contraste, o tratamento com DHT não teve efeito sobre níveis de ARNm de GPR158 e de proteína nas células C4-2B (Fig. 2, C e G). Ambos os níveis de ARNm e proteína para o antigénio específico da próstata (PSA), um gene alvo AR bem estudado, aumentou significativamente em PHPEC, LNCaP e células C4-2B tratados com DHT. Semelhante para os relatórios publicados, observaram-se também a estabilização da proteína AR nas células LNCaP estimuladas por DHT em 12 horas em células LNCaP PHPEC e [39], mas não em células C4-2B (Fig. 2, E, F e G). Mais importante, verificou-se que o antagonista de AR, bicalutamida inibiu o aumento mediada por DHT no ARNm de GPR158 e os níveis de proteína e também foi observada uma inibição completa da expressão de PSA em PHPEC (Fig. 2, D e H). ARNm de GPR158 e os níveis de proteína foram reduzidos após a inanição de androgénio por incubação de PHPEC em meios contendo 10% de CSS durante a noite. Com base nestes resultados, concluímos que GPR158 é um gene andrógeno-responsivo.

(AC e EG) As células das linhas indicadas foram incubados em meio contendo 10% de CSS para andrógeno fome durante a noite (0 ponto de tempo), seguido por tratamento com DHT (10 nM) durante os períodos de tempo indicados. O ARN total (A-C) ou os lisados ​​celulares (E-G) foram isoladas e submetidas a qRT-PCR e Western blotting, respectivamente para estimar AR, PSA, GPR158 e expressão da beta-actina. (D e H) PHPEC foram cultivadas em meio contendo FCS a 10% ou 10% de CSS, tratada com DHT (10 nM) sozinho durante 24 horas ou pré-incubadas com bicalutamida (10 uM) durante 1 hr antes de DHT tratamento em meio contendo 10 % CSS. O ARN total ou toda a célula lisados ​​foram isolados e qRT-PCR e transferência de Western foi executada, respectivamente, para detectar GPR158, AR, a PSA e da beta-actina (D) O nível de ARNm dos genes indicados acima foi considerado 1 em células cultivadas em 10% de FCS para o cálculo da diferença de dobragem relativa destes genes em outras condições experimentais. (AH) Os dados representam três experiências independentes.

Efeitos de GPR158 sobre AR Expressão

As LNCaP /C4-2B características da transição de andrógeno-dependência ao ser humano exibição CaP modelo de progressão andrógeno insensibilidade [32,40], eo AR desempenha um papel crucial neste processo [41]. FIG. 3 mostra os resultados da nossa análise dos efeitos sobre a expressão de GPR158 AR. Transient sobre-expressão de GPR158 em células LNCaP aumentada, e silenciamento de GPR158 endógena reduzida, o ARNm para o AR, bem como para a PSA (Fig. 3A). Em ambas as células LNCaP e C4-2B, a sobre-expressão de GPR158 aumentou significativamente os níveis de AR e de proteína do PSA, enquanto knockdown de GPR158 (redução de 90%) reduziu significativamente os níveis de proteína AR e PSA (Fig. 3, B e C). Juntos, estes resultados indicam que GPR158 estimula AR e PSA expressão.

LNCaP (A, B, C) e C4-2B (B e C) foram transfectadas transientemente utilizando o reagente Lipofectamina LTX com qualquer GPR158 plasmídeo ou vector de expressão (A e B) ou seja GPR158 ou siRNA controlo scrambled siRNA (A e C). Após 3 dias de transfecção, foram usados ​​total isolado de ARN e de células de proteína de lisados ​​de qRT-PCR (A) e Western blotting (B e C), respectivamente, para a análise de GPR158, AR, PSA e ARNm β-actina e expressão de proteína. Os dados representam duas experiências independentes realizadas em duplicado.

Efeitos dose-dependente de GPR158

Para investigar mais o papel de GPR158 na regulação da proliferação celular e expressão do gene AR, criamos a linha de células lenti-GPR158 LNCaP. Esta é uma sub-linha de células LNCaP estavelmente transformada com um lentivírus que expressa GPR158 sob o controlo de Dox. O sistema de lentivírus Dox-indutível permite a regulação apertada da expressão GPR158 de uma forma dependente da dose. As células LNCaP foram escolhidos para este modelo porque expressam os níveis mais baixos GPR158 endógenos. Recentemente, foi demonstrado que Dox altera os perfis metabólicos e proliferação de células de LNCaP em concentrações mais elevadas [42], um efeito que foi confirmada (dados não mostrados). Assim, em todas as experiências com esta linha de células, que compara os resultados obtidos com a linha celular LNCaP lenti-GPR158 aos obtidos utilizando culturas paralelas de células LNCaP parentais tratados com as mesmas doses de Dox.

fig. 4 mostra resultados representativos de experimentos utilizando a linha de células lenti-GPR158 LNCaP. Tratamento de lenti-GPR158 LNCaP com Dox durante 3 dias induzidas GPR158 expressão de uma forma dependente da dose, em comparação com células não tratadas (Fig. 4A). Nós consistentemente observado um aumento de aproximadamente 3 vezes e de 6 vezes nos níveis de proteína GPR158 após tratamento com Dox a 100 ng /mL e 500 ng /ml, respectivamente, durante 3 dias (Fig. 4a).