Abstract

Fundo

Actual gestão dos pacientes diagnosticados com câncer de próstata (PCA) é muito eficaz; no entanto, a recorrência do tumor com Castro resistente do cancro da próstata (CRPC) e subsequente metástase levam a resultados de sobrevivência pobres, sugerindo que existe uma necessidade premente de romance entendimento mecanicista da recorrência do tumor, o que seria fundamental para a concepção de novas terapias. A recorrência e metástase do CaP estão intimamente ligados com a biologia das células-tronco do câncer de próstata ou de células iniciadoras de câncer que é uma reminiscência da aquisição de epitelial para mesenquimal Transição (EMT) fenótipo. A evidência crescente sugere que as células EMT-tipo compartilham muitas características biológicas com câncer de células estaminais-like.

Metodologia /Principais Achados

Neste estudo, descobrimos que as células APC com EMT fenótipo exibido de haste como características celulares caracterizadas pelo aumento da expressão de Sox2, Nanog, Oct4, Lin28B e /ou Notch1, consistente com aprimorada clonogênica e esfera (prostasphere) -forming capacidade e tumorigenecity em camundongos, que foi associado com a diminuição da expressão de miR-200 e /ou let-7 família. Reversão de EMT por re-expressão de miR-200 capacidade de formação de prostasphere inibida de células de EMT-tipo e reduziu a expressão de Notch1 e Lin28B. Down-regulação da Lin28B aumentou let-7 expressão, que era consistente com capacidade de auto-renovação reprimida.

Conclusões /Significado

Estes resultados sugerem que miR-200 desempenhou um papel fundamental na ligação entre o características do câncer de células estaminais-como com assinaturas de células EMT-como em APC. eliminação selectiva de cancro de células estaminais do tipo por reversão do fenótipo de EMT mesenquimais-epiteliais de transição (TEM) fenótipo utilizando novos agentes seriam úteis para a prevenção da recorrência de tumores, especialmente através da eliminação das células que estão a “causa raiz” de desenvolvimento de tumor e recorrência

Citation:. Kong D, Banerjee S, Ahmad A, Li Y, Wang Z, Sethi S, et al. (2010) epitelial para mesenquimal transição é Mecanicamente Relacionada com assinaturas Stem celular em células de câncer de próstata. PLoS ONE 5 (8): e12445. doi: 10.1371 /journal.pone.0012445

editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de junho de 2010; Aceito: 06 de agosto de 2010; Publicação: 27 de agosto de 2010

Direitos de autor: © 2010 Kong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por uma bolsa da National Cancer Institute, National Institutes of Health (NIH) (5R01CA083695-08 a FHS) (https://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Novas evidências sugerem que a maioria dos tumores sólidos, incluindo o cancro da próstata (PCA) pode surgir a partir de células-tronco do câncer [1]. As células estaminais são as células do cancro dentro de um tumor que possuem a capacidade de auto-renovação e capacidade de iniciação do tumor, e se diferenciam em linhagens de células cancerosas heterogéneas que compreendem de uma massa tumoral. Estas células de iniciação do tumor poderia fornecer um reservatório para as células que causam a recorrência do tumor após a terapia. Wang et al. mostraram que a origem das células PCA é a partir das células estaminais epiteliais luminais diferenciadas [2]. No entanto, há um maior grau de heterogeneidade fenotipica de células em APC, especialmente dentro de metástases. Metástases muitas vezes incluir células raras que são fenotipicamente indiferenciada [3], sugerindo que as células de metástases de iniciação podem não ser as únicas células que são derivadas de células luminais positivas receptoras de andrógenos. Embora origem das células CaP precisa ser totalmente elucidado, uma série de evidência crescente sugere que as células de iniciação de tumor ou cancro de células estaminais desempenhar um papel fundamental na progressão e recorrência de CaP de castrar cancro resistente a próstata (CRPC) e suas metástases subsequentes.

estudos recentes têm indicado que as células somáticas podem ser reprogramado em células estaminais embrionárias pluripotentes-como por co-expressão de marcadores de células estaminais, como pluripotência Oct4, Sox2, Nanog e Lin28 [4], [5], que levanta a possibilidade de que combinada expressão de factores associados a células estaminais e oncogenes especiais também pode induzir um estado não diferenciado em células cancerosas. Curiosamente, as linhas celulares derivadas a partir de espécies de CaP humanos mostrou fenótipo epitelial. No entanto, a imortalização dessas células por hTERT mostrou a expressão de marcadores de células estaminais pluripotência, incluindo Oct4, Nonag, e Sox2 [6], o que poderia ser associado com a progressão da doença porque a sobre-expressão de Oct4, Sox2, Nanog e c-myc sido encontrado em tumores pouco diferenciados [7]. Jeter et ai. demonstraram que knock-down Nanog de CaP em células diminuiu significativamente o crescimento clonogénico longo prazo e inibiu o crescimento tumoral [8]. Oct4 também tem sido demonstrado que desempenham papéis importantes na progressão de CaP [9].

epitelial para mesenquimal (EMT) é um processo fundamental para a morfogénese durante o desenvolvimento embrionário, mas mais recentemente também tem sido implicado em a conversão da fase inicial de tumores em tumores malignos invasivos [10]. A progressão da maioria dos carcinomas em relação a malignidade está associada com a perda de diferenciação epitelial e comutando para o fenótipo mesenquimal, que é acompanhado por aumento da motilidade celular e invasão. Estudos recentes têm demonstrado que EMT desempenha um papel crítico, não só na metástase tumoral, mas também em recidiva tumoral que se acredita ser firmemente ligada com a biologia de cancro de células estaminais ou células do tipo de cancro de iniciação [11] – [13]. No entanto, os mecanismos através dos quais as células EMT gerar as células estaminais do tipo permanecem por ser elucidados. Os microRNAs (miRNAs) estão emergindo como master reguladores de diferenciação celular e envolvidos na aquisição de EMT fenótipo durante a progressão tumoral [14]. Duas famílias evolutivos conservados, miR-200 e deixe-7 foram mostrados para regular os processos de diferenciação durante o desenvolvimento. Curiosamente, estudos recentes mostraram também que o miR-200 família não só poderia regular os processos de EMT, visando E-box vinculativo ZEB1 proteína e ZEB2 [15], mas também foi associado com assinaturas de células estaminais-como através da regulação da expressão de Bmi1 [ ,,,0],16], [17]. Deixe-7 família de pequenos RNAs tem sido mostrada a agir como um supressor de tumor, através de direccionamento de Ras, grupo de alta mobilidade A2 (HMGA2) e c-myc, e diminuição da expressão let-7 tem sido associada com o aumento da tumorigenicidade e mau prognóstico do paciente. Mais importante, os membros da família Deixe-7 regular a auto-renovação das células de câncer de mama [18], que está associado com o fenótipo de células-tronco. Estudos recentes também têm documentado que lin28B poderia bloquear a acumulação de madura let-7 [19], que por sua vez regula “stemness” inibindo a auto-renovação, as características celulares de células-tronco do tipo de câncer associados com a recorrência do tumor. Acredita-se que a recorrência de CaP estar fortemente relacionada com a biologia das células-tronco do câncer de próstata ou de células iniciadoras de câncer [11], [20], [21], enquanto cada vez mais evidências têm mostrado que as células com EMT induzidas por diferentes fatores são ricos fonte de células-tronco do cancro, do [12], [13], [22], [23].

Portanto, é importante identificar quais os factores que poderiam induzir EMT e como as células EMT poderia tornar-se um recurso para o cancro de células estaminais semelhante, o que reforça ainda mais o papel de factores tais mecanicista para o desenvolvimento de terapias novas e específicas para as CRPC. Estudos têm demonstrado que a sinalização de factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) contribui para EMT [24], [25]. Recentemente, nós e outros têm mostrado que o PDGF-D poderia regular a invasão de células do cancro e angiogénese, que foi consistente com a aquisição do fenótipo EMT [26] – [30]. Curiosamente, o aumento da expressão de PDGF-D também foi encontrado em CaP humano [31], o que sugere que o PDGF-D pode desempenhar um papel importante na progressão do CaP humano contribuído por EMT-fenotípica ou cancro de células estaminais semelhante. Neste estudo, descobrimos que PDGF-D sobre-expressando células PC3 adquiriu fenótipo EMT e as características de células estaminais-como compartilhados caracterizadas pelo aumento da expressão de marcadores de células-tronco, como Notch1, Sox2, Nanog, Oct4 e Lin28B, que era consistente com Enhanced clonogénicas, prostasphere-capacidade de formação, bem como aumento da tumorigenicidade em ratinhos. Concomitantemente, encontramos Arcap

células M com EMT fenótipo também compartilhou assinaturas de células estaminais-como caracterizadas por aumento da expressão do fator de transcrição Notch1 e reforçada clonogênica, capacidade de formação de prostasphere em comparação com células de controlo (Arcap

Células E) com epitelial fenótipo. Estas células do tipo EMT também mostrou a diminuição da expressão de miR-200 ou deixar-7, e a reversão de EMT forçando expressão de miR-200 capacidade clonogénico e formando-prostasphere significativamente inibido, o que foi consistente com a inibição da expressão de Notch1 e Lin28B. Além disso, knock-down de Lin28B aumentou acentuadamente let-7 expressão, sugerindo que miR-200 e deixe-7 poderia agir como um alvo para a prevenção da recorrência de tumores e metástases em CaP.

Resultados

capacidade clonogénicas foi aumentada em PC3 PDGF-D e Arcap

M com células EMT fenótipo

Os resultados da análise de transferência de Western e a morfologia das células, bem como os dados publicados demonstraram que a sobre-expressão de PDGF -D induzida fenótipo EMT em células PC3 [26], [28] (Fig. 1A), o que era consistente com os níveis mais elevados de PDGF-D em lisados ​​celulares e meio condicionado (CM) de células PC3 PDGF-D, em comparação com PC3 Neo células (Fig. S1A e S1B). Arcap

M células possuindo morfologia mesenquimal mostraram um aumento da expressão de marcadores mesenquimais e a diminuição da expressão de marcadores epiteliais, em comparação com Arcap

de células E com fenótipo epitelial (Fig. 1B). Para determinar se as células com o fenótipo de EMT poderia ter características de células estaminais semelhante, foi realizada ensaio clonogénico. Descobrimos que a capacidade clonogénicas foi significativamente aumentada em células PC3 PDGF-D, em comparação com células PC3 neo (Fig. 1C, painel esquerdo). FIG. 1C, painel direito, indicou ainda que as células PC3 PDGF-D mostraram um aumento de 11 vezes no número de colónias relativamente a células PC3 Neo. Arcap

células M também exibiu um aumento da capacidade clonogénico mostrando aumento de 3 vezes no número de colónias em comparação com Arcap

células E (Fig. 1D). ensaio de agar mole, também conhecido como ensaio de crescimento independente de ancoragem, foi realizada. células PC3 PDGF-D mostraram aumento dramático no potencial clonogénico em comparação com células PC3 neo (Fig. 1E, painel esquerdo). FIG. 1E, painel direito, mostrou claramente os números de colónias geradas a partir de células por campo microscópico (40 X) PC3 Neo e PC3 PDGF-D. Estes resultados demonstraram um aumento na capacidade de células clonogénicas EMT

(A) Fotografias de células foram mostrados:. Células PC3 Neo exibida forma arredondada de células epiteliais e células PC3 PDGF-D exibiram um fenótipo de tipo fibroblástico (painel esquerdo , ampliação original, 200 X). A análise Western blot mostrou a expressão de repressores de transcrição associadas a EMT, e mesenquimais, assim como marcadores de células epiteliais em PC3 Neo e PC3 PDGF-D (painel da direita, a passagem 10 a 20). (B) A morfologia do Arcap

M e Arcap

células E foi mostrado (painel esquerdo) análise da mancha .western indicados a ZEB1 aumentou, vimentina e Notch1 expressão e diminuição da expressão de E-caderina em Arcap

células M comparação com Arcap

E (painel direito). (C) e (D) a partir de fotografias de colónias Neo e PC3 PC3 PDGF-D ou Arcap

M e Arcap

E foram mostradas (painel da esquerda). Os números de colónias foram contadas e os dados foram apresentados como números de colónias relativas de PC3 Neo ou Arcap

E concebido como um (painel da direita). (E) As colónias cultivadas em agar mole foram fotografados (painel esquerdo, bar, 200 mm). Os números de colónias foram contadas sob um microscópio de contraste de fase. Os dados foram apresentados como números de colónias por campo (painel da direita). ** P 0,01 em comparação com Neo ou Arcap

células E (N: células PC3 Neo, D: células PC3 PDGF-D, p10: passagem 10, E-cad: E-caderina)

capacidade de auto-renovação foi aumentada em células EMT

para continuar a determinar se as células com EMT fenótipo poderia mostrar características de células estaminais-like, testamos formadoras de esfera (denominado como prostasphere) a capacidade de PC3 PDGF- células D comparado com PC3, bem como Neo Arcap

M em comparação com células Arcap

e células quando cultivadas em culturas em suspensão, que é um

in vitro

medida das características de células estaminais semelhante. Descobrimos que as células PC3 PDGF-D mostraram um aumento significativo na capacidade para formar prostaspheres em relação a células PC3 neo (Fig. 2A e 2B). Os prostaspheres PC3 a partir de neo eram menos do que 100 um de diâmetro depois de 6 dias, enquanto que 40% das células PC3 prostaspheres de PDGF-D foram de 100-200 um, 20% das células PC3 prostaspheres de PDGF-D eram superiores a 200 uM (Fig. 2C). Para confirmar ainda se os prostaspheres são a progénie de células individuais, em vez de os agregados de múltiplas células, os prostaspheres (P1) foram recolhidas e as células foram plaqueadas a uma célula por poço numa placa de 96 poços com baixo fixação Ultra. Após 12 dias, verificou-se que uma a duas novas prostaspheres foram gerados a partir de células única PC3 PDGF-D, enquanto que apenas 20% de células únicas de PC3 Neo gerado novas prostaspheres (P2, Fig. 2D). Arcap

células M também exibiu um aumento da capacidade de formação de prostasphere (Fig. 2E e 2F), sugerindo que as células com o fenótipo de EMT adquiriram o aumento da capacidade de auto-renovação. Com base nestes resultados, novas experiências mecanicistas foram focado usando células PC3 PDGF-D em comparação com células PC3 Neo e comparados com Arcap

M e Arcap

células E sempre que justificado.

(A) Prostaspheres de células PC3 Neo e PC3 PDGF-D foram fotografadas e mostrado (de barras, 100 um). (B) O número de prostaspheres foram contados sob microscópio. (C) Prostaspheres foram fotografadas e o tamanho de prostaspheres de diâmetro foi medido utilizando o software de programa de análise de imagem Scion. (D) A prostaspheres (P1) foram recolhidas e re-plaqueadas a uma densidade de uma célula por cavidade em placas de 96 poços com baixo fixação Ultra. Após 12 dias de incubação, o número de prostaspheres (P2) foram contadas sob um microscópio de contraste de fase. (E) Os números de prostaspheres de Arcap

E e Arcap

células M foram contados sob microscópio. (F) Prostaspheres de Arcap

E e Arcap

células M foram fotografados e exibidos (bar, 100 mm). ** P 0,01 em comparação com

células E Neo ou Arcap. (Neo: células PC3 Neo, PDGF-D: células PC3 PDGF-D)

perfil de expressão gênica de marcadores de células-tronco em células com EMT fenótipo

para descobrir os genes que regulam e mantêm o fenótipo de células-tronco de células PC3 PDGF-D ter assinaturas EMT, realizamos microarray para determinar perfis de expressão gênica de células PC3 PDGF-D em comparação com PC3 Neo células. Descobrimos que as células PC3 PDGF-D mostraram alterações dramáticas na expressão dos genes associados com o fenótipo de EMT (Tabela S1). Curiosamente, factores de transcrição Sox2, Nanog, Oct4 e Lin28B, conhecido por ser suficiente para reprogramar células somáticas humanas rato ou células-tronco indiferenciadas, pluripotentes, verificou-se ser significativamente aumentada em células PC3 PDGF-D, em comparação com as células PC3 Neo. Concomitantemente, os alvos a jusante desses fatores de transcrição como Zic2, Zic3, Sall2 e Sall4 também foram significativamente up-regulada (Tabela S2). Para confirmar ainda mais os resultados de análises de expressão de genes de microarranjos, temos conduzido em tempo real de RT-PCR e análise por Western blot dos genes seleccionados. Os resultados de tempo real de RT-PCR mostrou 2 para aumento de mil vezes nos níveis de ARNm destes factores de transcrição e os seus alvos a jusante em células PC3 PDGF-D (Fig. 3A). A análise por Western blot demonstrou também que as expressões proteína de Sox2, Nanog, Stat3, e Lin28B Oct4 eram significativamente maiores nas células PC3 PDGF-D, em comparação com células PC3 Neo de passagem 10 à passagem 20 (Fig. 3B).

(A) A expressão de genes aos níveis de mRNA para Oct4, Nanog, a família de genes Sox e Lin28B em células PC3 Neo e PC3 PDGF-D foram determinadas usando tempo real de RT-PCR. (B) Os resultados de Western blot mostrou que as expressões de Oct4 Sox2, Nanog, Stat3 e Lin28B foram significativamente aumentados em células PC3 PDGF-D. (C) em tempo real de RT-PCR foi utilizada para quantificar a expressão de ARNm de EED, EZH2 e Suz12a. Os níveis de ARNm relativos foram normalizadas para GAPDH. (D) Os resultados de Western blot mostrou que a expressão de EZH2 foi significativamente aumentada em células PC3 PDGF-D. (E) Os níveis de ARNm dos factores de sinalização de Notch em PC3 Neo e células PC3 PDGF-D foram determinadas usando tempo real de RT-PCR. (F) Os resultados de Western blot mostrou que as expressões de Notch e ligandos Notch foram significativamente aumentados em células PC3 PDGF-D. GAPDH foi usada para controlo de carga de proteína. (N: células PC3 Neo, D: células PC3 PDGF-D, p10: passagem 10).

proteínas grupo Polycomb são conhecidos por estar envolvidos na regulação da repressão do gene através de modificações da cromatina, que é essencial para a manutenção das células estaminais embrionárias e adultas, [33] [32]. Polycomb complexo repressor 2 (PRC2) contém subunidades e funções Suz12, EZH2, EED e RBAP nas células estaminais embrionárias e adultos para reprimir genes de desenvolvimento que são preferencialmente activados durante a diferenciação. Além disso, outros estudos mostraram que os genes-alvo são co-PRC2 ocupada pelos reguladores de células estaminais tal como Oct4, Sox2 e Nanog [34]. Durante a análise dos nossos dados de microarray de dados, verificou-se que os níveis de EZH2 e ARNm Suz12a foram aumentados em células PC3 PDGF-D, em comparação com as células PC3 neo (Tabela S2), que foram posteriormente confirmados por tempo real de RT-PCR (Fig. 3C). Além disso, os níveis de proteína de EZH2 foi significativamente sobre-regulada em células PC3 PDGF-D relativamente a células PC3 neo (Fig. 3D) e estes resultados sugerem claramente que as características do tipo de EMT de células PC3 PDGF-D são consistentes com a assinaturas de células estaminais ou cancro de células estaminais-like.

sinalização Notch tem sido demonstrado que desempenham papéis importantes em pluripotência e auto-renovação da capacidade de ambas as células estaminais embrionárias e adultos [35], [36]. Os resultados dos nossos dados de microarray mostrou que os níveis de mRNA de Notch, ligandos de Notch, Delta-like, irregulares, bem como Notch alvos a jusante, tais como Hes e Ei eram significativamente maiores nas células PC3 PDGF-D, em comparação com as células PC3 Neo (Tabela S2) . em tempo real de RT-PCR mostrou aumento de 2 a 350 vezes nos níveis de ARNm de genes Notch (Fig. 3E), que foram confirmados por análise de Western blot, conforme mostrado na Fig. 3F. Da mesma forma, também encontramos aumento significativo do nível de expressão de Notch1 em Arcap

células M, em comparação com Arcap

células E (Fig. 1B, painel da direita).

miR-200b e miR-200c expressão ligados assinaturas de células-tronco cancerosas com EMT fenótipo

em nossos estudos anteriores, verificou-se significativa diminuição da regulação de miR-200 família em células PC3 PDGF-D com EMT fenótipo [28], que foi consistente com os nossos dados miRNA microarray (Tabela S3). Para revelar se expressões de miR-200 da família estão associados com assinaturas de células-tronco, células PC3 PDGF-D foram transfectadas com miR-200a, miR-200b e miR-200c. Verificou-se que a transfecção de miR-200b e 200c-miR reversão induzida de EMT para MET fenótipo (Fig. 4A). Mais importante ainda, a re-expressão de miR-200b e 200c-miR inibiu significativamente a capacidade de formação de prostasphere de células PC3 PDGF-D (Fig. 4B). Além disso, o tamanho de prostaspheres também foi reduzida em células PC3 PDGF-D transfectadas com miR-200b e 200c-miR em comparação com a transfecção com controlo miARN (Fig. S2A e S2B). No entanto, a transfecção de células PC3 PDGF-D com miR-200a não teve nenhum efeito sobre a capacidade de formação de prostasphere mas aumentou o tamanho de prostaspheres em comparação com o controlo (Fig. 4B, a Fig. S2A e a Fig. S2B). Estes resultados sugerem que o miR-200b e 200c-miR mas não miR-200a inibe a auto-renovação das células PC3 de PDGF-D, controlando expressão dos genes alvo de miR-200b e miR-200c. Assim, avaliou-se a expressão dos alvos putativos de miR-200b e miR-200 ° C, tais como de Notch1, Bmi1 e lin28B em células PC3 PDGF-D transfectadas com a família de miR-200, porque o miR-200b e miR-200c têm três ou um putativo sites na 3’UTR de Lin28B, Bmi1 mRNA (Fig. S3) e mRNA Notch1 vinculativo. A transfecção de miR-200b e 200c-miR reduziu drasticamente a expressão de Notch1 e lin28B, mas não teve nenhum efeito sobre a expressão de Bmi1 (Fig. 4C). A expressão de ZEB1 verificou-se ser sub-regulada pela expressão forçada de miR-200b e miR-200c (Fig. 4C), que foi consistente com a reversão do fenótipo de EMT (Fig 4A). Também descobriram que a expressão de miR-200c foi reprimida em

células Arcap M comparação com Arcap

células E (Fig. 4D). Além disso, a re-expressão de miR-200c em Arcap

M células por transfecção com precursores pré-miR-200C marcadamente reduzida a capacidade de formação de prostasphere em comparação com a transfecção com miARN de controlo (Fig. 4E). Estes resultados eram consistentes com a infra-regulação da expressão de Notch1 e reversão de EMT fenótipo que caracterizada pelo aumento da expressão de E-caderina e a diminuição da expressão de ZEB1, bem como as alterações da morfologia celular em Arcap

células M transfectadas com pré-miR-200c precursores (Fig. 4F e Fig. 4G).

células PC3 PDGF-D foram transfectadas com pré-miR-200. 3 dias após a transfecção, as células foram divididas e transfectadas repetidamente com pré-miR-200 a cada 3-4 dias durante 14 dias. (A) Fotografias de células são mostradas: a transfecção de células PC3 PDGF-D com pré-miR-200 para 14 dias, o miR-200b e 200c-miR invertida células EMT a morfologia das células TEM. (B) As células foram recolhidas para a geração de prostaspheres depois de 14 dias de pré-transfecção com miR-200. MiR-200b e miR-200c reduziu o número de prostaspheres. (C) Western Blot demonstrando que Notch1, Lin28B e expressões ZEB1 foram regulados negativamente em células PC3 PDGF-D transfectadas com miR-200b e miR-200c. (D) O nível de miR-200c diminuiu significativamente em Arcap

M usando em tempo real RT-PCR. (E) A transfecção de pré-miR-200c após 6 dias reduziu a capacidade de formação de prostasphere em Arcap

células M (Bar: 100 m). (F) de Western blot mostrou que a re-expressão de miR-200c por transfecção de pré-miR-200 ° C aumentou a expressão de E-caderina e reprimido expressão de ZEB1 e Notch1 em Arcap

células M, o que consistente com a mudança de mesenquimal a morfologia das células epiteliais (L). *, P 0,05 comparado com o controlo; **, P 0,01 comparado com o controlo. (Con: controle, 200a: pré-miR-200a, 200b: pré-miR-200b, 200c: pré-miR-200c, E-cad: E-caderina)

Down-regulação. de Notch1 de miR-200 foi parcialmente responsáveis ​​pela inibição da capacidade colonogenic e formando-prostasphere de células PC3 PDGF-D

o miR-200b e 200c-miR tem um sítios de ligação na 3’UTR de Notch1 (Fig. 5A). Para determinar se o alvo é de Notch1 directa de miR-200b e miR-200c, analisou-se a actividade da 3 ‘UTR de Notch1 em PC3 Neo e células PC3 PDGF-D transfectadas com 3? UTR de Notch1 plasmídeo de luciferase bem como PC3 PDGF -D células co-transfectadas com 3? UTR de Notch1 plasmídeo de luciferase e miR-200b ou miR-200c. Descobrimos que a actividade de 3 ‘UTR de Notch1 de luciferase foi significativamente aumentada em células PC3 PDGF-D, em comparação com células PC3 Neo devido a níveis mais baixos de miR-200b e 200c-miR em células PC3 PDGF-D. Além disso, a re-expressão de miR-200b ou 200c miR-reduziu dramaticamente a actividade de 3 ‘UTR de Notch1 de luciferase em células PC3 PDGF-D, enquanto re-expressão de miR-200a com uma sequência de base da semente diferente de miR-200b e miR-200c não teve efeitos sobre a actividade da 3’UTR de Notch1 luciferase (Fig. 5B). Estes resultados sugerem que o miR-200b e 200c de miR-regular a expressão de Notch1 por ligação a 3’UTR do ARNm de Notch1. Para determinar se Notch1 desempenhou um papel importante na manutenção das células estaminais, que tratado as células PC3 PDGF-D com DAPT, um inibidor γ-secretase que inibe a activação de Notch. comprimento total Notch1 é geralmente muito baixa, devido à sua clivagem por muitas enzimas nestas células; No entanto, descobrimos que a expressão de comprimento completo de Notch1 foi ligeiramente mais nas células tratadas γ-secretase. Nós também descobrimos que DAPT reduziu significativamente a capacidade clonogênica de células PC3 PDGF-D (Fig. 5C, painel superior), que era consistente com os dados de Western blot mostrando que o tratamento DAPT inibida forma ativa de Notch1 (Fig. 5C, painel inferior). Além disso, a transfecção de Notch1 siARN reprimido dramaticamente a capacidade de formação de prostasphere de células PC3 PDGF-D (Fig. 5D e 5E), o que foi consistente com a regulação negativa da expressão da proteína de Notch1 (Fig. 5F). Estes resultados sugerem que miR-200 mediada down-regulação da Notch1 foi parcialmente responsável pela capacidade de auto-renovação e crescimento colonogenic de EMT-like células com características de células-tronco.

(A) conservada, previu sítios de ligação para o sequências de semente de miR-200b e 200c-mir na 3’UTR do ARNm de Notch1. (B) miR-200b e 200c-miR inibiu a actividade da luciferase de Notch1 3’UTR. **, P 0,01 em comparação com células de controlo Neo; #, P 0,01 em comparação com células de controlo de PDGF-D. (C) DAPT tratamento, um inibidor γ-secretase, a capacidade reduzida em células clonogénicas PC3 PDGF-D (painel superior) .western blot mostrando que o tratamento reduziu DAPT forma activa de Notch1 de maneira dose-dependente (painel inferior). (D) e (E) que mostra que a transfecção de Notch1 siARN após 9 dias reprimiu a capacidade de formação de prostasphere em células PDGF-D PC3 (Barra: 100 um), o que é consistente com a regulação negativa da expressão de Notch1 (F). **, P 0,01 comparado com o controlo. (Neo: células PC3 Neo, PDGF-D: células PC3 PDGF-D, Con: controle, 200a: pré-miR-200a, 200b: pré-miR-200b, 200C: pré-miR-200c)

Lin28B inibiu a produção de let-7, que regulamenta a auto-renovação, controlando a expressão de Sox2, Nanog e Oct4

Nossos resultados apresentados acima mostrou que o miR-200b e miR-200c inibida expressão lin28B (Fig. 4C), que é conhecido por se ligar a principal pré-let-7 ARN deixou-7 e e inibe a acumulação de madura let-7 miARN [19]. Os resultados dos nossos dados de microarray de miARN mostraram que todos os membros da família deixou-7 foram significativamente reduzidos em células PC3 PDGF-D (Tabela S3). Estes resultados foram confirmados por ensaio em tempo real de RT-PCR (Fig. 6A). Knock-down de Lin28B por siRNA aumentou fortemente amadurecer let-7 expressões (Fig 6B.); sugerindo lin28B madura regulada let-7 expressão em células PC3 PDGF-D. É bem sabido que a família deixou-7 desempenha um papel crítico na regulação da auto-renovação das células estaminais embrionárias e a haste-como células de cancro da mama [18], [37]. Para determinar se deixe-7 podia controlar auto-renovação das células PC3 PDGF-D, foi realizado o ensaio de formação de esfera. Re-expressão de selecionada família let-7, como deixá-7a, deixe-7b, deixe-7d ou a combinação dos deixe-7a, deixe-7b e deixe-7d capacidade de formação de prostasphere marcadamente inibido (Fig. 6C e 6D) e simultaneamente reduziu o tamanho dos prostaspheres (Fig. 6c, e S4A S4B). Uma vez que inibe a acumulação de Lin28B madura let-7 pela ligação a pré-let-7 ARN e bloqueando assim o processamento de pré-let-7 ARN, células PC3 PDGF-D com elevado nível de Lin28B foram co-transfectadas com pré-let- 7 e Lin28B siRNA. Descobrimos que os números de prostasphere a partir de células co-transfectadas com pré-let-7 e Lin28B ARNip eram menos do que a transfecção com o pré-let-7 sozinho (Figura 6D.); No entanto, excepto para deixá-7d, não houve diferença no tamanho entre prostasphere pré-let-7 sozinha e co-transfecção com pré-let-7 e Lin28B siRNA (Fig. 6C, e S4A S4B). Estes resultados foram consistentes com os dados da análise de mancha de Western mostrando que a re-expressão de let-7 expressão Sox2 e Nanog significativamente inibida em células PC3 PDGF-D por transfecção de pré-let-7a, pré-let-7b ou co- transfecção de pré-let-7a, pré-let-7b ou pré-let-7d com Lin28B siRNA. Transfecção de pré-let-7d sozinho foi capaz de inibir a expressão de Lin28B e Oct4, mas teve efeitos marginais sobre Sox2 e expressão Nanog (Fig. 6E).

(A) Os níveis para deixá-7 família em células PC3 Neo e PC3 PDGF-D foram determinadas usando em tempo real RT-PCR. (B) em tempo real de RT-PCR foi utilizada para quantificar a expressão de deixá-7 em células PC3 PDGF-D transfectadas com ARNsi Lin28B durante 3 dias. (C) Fotomicrografias mostrando prostaspheres gerados a partir de células PC3 PDGF-D transfectadas com pré-let-7 ou a combinação dos pré-let-7 e Lin28B siRNA 14 dias após a transfecção (Bar: 100 m). (D) As células foram recolhidas para o ensaio após 14 dias de transfecção formando-prostasphere. Deixe-7a, deixe-7b, deixe-7d e combinação de Let-7a, deixe-7b, deixe-7d, bem como co-transfecção com let-7 e Lin28B siRNA diminuiu o número de prostaspheres. (E) Os resultados de Western blot mostrou a expressão de Lin28B, Sox2, Nanog e Oct4 em células PC3 PDGF-D transfectadas com pré-let-7 ou co-transfectadas com pré-let-7 e Lin28B siRNA após 9 dias transfecção. *, P 0,05 comparado com o controlo; **, P 0,01 comparado com o controlo. (Con: controle, uma: pré-let-7a, abd: combinação de pré-let-7a, pré-let-7a, pré-let-7d, al: combinação de pré-let-7a e Lin28B siRNA, Lin28B- sI: Lin28B siRNA, Neo: células PC3 Neo, PDGF-D:. células PC3 PDGF-D)

Sox2, Nanog, Oct4 e Lin28B foram necessários para a auto-renovação das células PC3 PDGF-D

Temos demonstrado que a família deixe-7 regulada auto-renovação e inibiu Sox2, Nanog, Oct4 e expressão Lin28B em células PC3 PDGF-D com EMT fenótipo. A fim de avaliar o link mecanicista destas moléculas (Sox2, Nanog, Oct4 e Lin28B) com a capacidade de auto-renovação das células PC3 PDGF-D, que derrubou a expressão de Sox2, Nanog, Oct4 e Lin28B por siRNA transfecção utilizando Sox2 , Nanog, Oct4 e Lin28B siRNA específico. Descobrimos que knock-down de Sox2, Nanog, Oct4 e Lin28B significativamente reprimido capacidade de formação de prostasphere (Fig. 7A). Além disso, as células PC3 PDGF-D transfectadas com Sox2, Nanog, Oct4 e Lin28B siARN mostrou significativamente o aumento do número de prostaspheres em tamanho menor (30-50 uM) em comparação com a concomitante transfectadas com ARNsi de controlo, com um decréscimo no número de prostaspheres com 50 uM de diâmetro (fig. 7B). Estes resultados foram consistentes com os resultados de expressão de proteína, como mostrado na Fig. 7C, o que sugere que Sox2, Nanog, Oct4 e Lin28B são necessários para a auto-renovação das células PC3 de PDGF-D.

(A), as suspensões de células individuais de PC3 PDGF-D transfectadas com Sox2, Nanog, Oct4 e Lin28B siRNA e incubou-se durante 24 h foram plaqueadas em poços de ultra baixa aderentes da placa de 6 poços a 2000 células /poço. Após 3 dias, o número de prostaspheres foram contados sob o microscópio. (C).