Sumário

Geralmente, a maior parte do cancro do ovário não pode ser detectado até grande escala e metástase remota ocorre, o que é a principal causa de mortalidade elevada no cancro do ovário. Portanto, é urgente descobrir biomarcadores relacionados com metástase para a detecção de câncer de ovário em estágio de metástase oculta. glicosilação alterado é uma característica universal de malignidade e certos tipos de estruturas de glicano são marcadores bem conhecidos para progressões tumorais. Assim, este estudo teve como objetivo revelar mudanças específicas de

N-glicanos

no secretome do câncer de ovário metastático. Nós empregamos uma abordagem glycomics quantitativa com base na marcação metabólica isótopo estável para comparar o diferencial

N

-glycosylation de secretome entre uma linha de células de cancro do ovário SKOV3 e sua alta metastático derivado SKOV3-ip. Curiosamente, entre total de 17

N

glicanos identificados, o

N

glicanos com bisecting GlcNAc foram todos significativamente diminuída em SKOV3-ip em comparação com SKOV3. Esta alteração na bissectriz glicoformas GlcNAc, bem como a sua associação com o correspondente comportamento metastático do cancro do ovário foi ainda validado no glycotransferase com várias técnicas incluindo a PCR em tempo real, transferência de Western, ensaio Transwell, lectina blotting e análise imuno-histoquímica. Este estudo ilustrado

N

alterações glicanos relacionados com metástase no câncer de ovário secretome

in vitro

, pela primeira vez, que é uma fonte valiosa para a descoberta de biomarcadores também. Além disso,

N

glicanos com bisecting GlcNAc lançar luz sobre a detecção de câncer de ovário em estágio de metástase peritoneal precoce, que podem, consequentemente, melhorar o prognóstico de pacientes com câncer ovariano

Citation:. Zhang X, Wang Y, Y Qian, Wu X, Zhang Z, Liu X, et al. (2014) Discovery of Specific Metástase-Related

N-glicanos

Alterações no epitelial de ovário Cancer Based on Quantitative Glycomics. PLoS ONE 9 (2): e87978. doi: 10.1371 /journal.pone.0087978

editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de setembro de 2013; Aceito: 02 de janeiro de 2014; Publicação: 06 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Programa Nacional de Pesquisa básica da China (973 Programa) (2012CB8221004, 2013CB910503), High-tech Nacional R Programa D (Programa 863) (2012AA020203) e do fundo de ciência natural Nacional (31.100.586, 31010103906, 30930025, 31170766, 81272879, 81302258), o principal projeto de Shanghai Academic Disciplina (B117), e Xangai projecto ênfase da pesquisa fundamental (11JC1401502). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do ovário

epitelial é a neoplasia maligna ginecológica mais letal em todo o mundo [1], [2]. De acordo com um relatório recente da American Cancer Society, cerca de 22.240 novos casos serão diagnosticados com câncer de ovário em 2013, enquanto quase 14.030 vai sucumbir a esta doença [3]. Actualmente, ultrassonografia pélvica e teste de soro CA125 servir como principais rotinas de detecção [4], [5], [6], [7], que são eficazes em alguns casos. No entanto, a maioria de câncer de ovário pode ainda não ser diagnosticada até que o tumor tem progredido a um estágio avançado, apresentando em grande escala ou metástases à distância. Na clínica, o padrão mais comuns das metástases do cancro do ovário é reconhecido como implante peritoneal [8]. Devido ao fato de que os sites primeiros metástase peritoneal são geralmente muito pequeno para ser detectado macroscopicamente [4], [9], a taxa de sobrevivência de cinco anos sofre sempre esse diagnóstico terminal pobres e testemunhas uma diminuição dramática quando grande escala metástase peritoneal ocorre, desde cerca de 90% na fase I a 2-80% no estádio II-IV [4], [10], [11]. Portanto, é necessário descobrir biomarcadores relacionados com metástases que poderiam auxiliar na detecção de câncer de ovário tão cedo quanto possível, em vez de, até a ampla disseminação do tumor fora dos ovários.

A glicosilação é um dos post mais prevalente -translational modificações que produz vários tipos de glicanos que são frequentemente ligados a proteínas. Glicanos participar de grandes eventos fisiopatologia durante progressões de tumor [12], [13], [14]. de glicosilação alterado é uma característica universal de malignidade, e algumas destas alterações, contribuir para processos metastáticos [12], [15]. Por exemplo, o aumento da actividade ou expressão de

N

V -acetylglucosaminyltransferase (MGAT5) e β-1, 6-GlcNAc ramificada

N-glicanos

tem sido encontrado em tumores altamente metastáticos, tais como cólon , cancros hepáticos e da mama [16], [17], [18], [19], [20]. Além disso, a alteração na sialilação foi reportado contribuir para a metástase de tumor nestas células assim [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27]. Além disso, outros padrões de glicosilação aberrante, incluindo núcleo-fucose, GlcNAc bissectora

N-glicanos foram

conhecido por estar associado com a metástase de muitas células malignas [28], [29], [30], [31], [32]. Por conseguinte, as aberrações associados ao cancro em estruturas de glicano proporcionar uma base racional convincente para nova descoberta biomarcadores [33].

No caso de cancro do ovário, glicosilação aberrante tem sido descrita em vários estudos, incluindo principalmente o aumento silylaiton e fucosilação do

O

-Conectado glicanos, níveis mais elevados de biantenária

N

glicanos -Conectado, fucosila�o núcleo elevada, e que atravessa

N

glicosilação -Conectado [34]. Actualmente, o papel da glicosilação modificação de jogo nas metástases do cancro do ovário, também tem sido indicada em vários estudos. Por exemplo, mesothelin-MUC16 ligação que facilita a metástase peritoneal de ovário tem sido demonstrado

N-glicanos

dependentes [35]. A capacidade de células de adesão ao hialuronano em linhas celulares de carcinoma do ovário pode ser alterada através da remoção de porções hidrato de carbono a partir das superfícies de células [36]. Estes estudos sugeriram o envolvimento de glicanos nos processos de metástases, enquanto que exata

N-glicano

alterações associadas com metástases do cancro do ovário em permaneceram obscuros, tais como os da superfície celular e secretada glicoproteínas celulares. Tendo em conta que mudanças na estrutura de glicanos específicos em secretome de células de câncer podem ser potenciais biomarcadores para o diagnóstico não-invasivo [37], neste estudo, nós nos concentramos em revelar a

N

alteração -glycosylation associada à metástase em glicoproteínas secretado pelo ovário células cancerosas.

glycomics quantitativas baseadas em espectrometria de massa (MS) tem provado ser uma ferramenta promissora e poderosa para identificar alterações globais de glicanos entre diferentes amostras biológicas [38], [39], [40], que inclui estratégias livres da etiqueta e estratégias de rotulagem isótopo estável. O primeiro é muito mais simples, enquanto o último é mais robusto. Um método glycomics quantitativa baseada na incorporação metabólica de marcadores de isótopos estáveis ​​(detecção isotópica de açúcar aminados com glutamina, IDAWG) foi recentemente relatada [41]. Neste método, as células marcados diferencialmente podem ser misturados em conjunto no início do fluxo de trabalho, o que minimiza qualquer enviesamento potencial introduzido durante o processamento da amostra e oferecer um método fiável quantificação [39], [42]. No nosso estudo, diferente da análise glycomics quantitativa de glicoproteínas da superfície celular utilizando IDAWG relatado anteriormente, foi empregue o método glycomics quantitativos com base na incorporação metabólica de marcadores de isótopos estáveis ​​para diferencial

N

-glycosylation análise de secretoma entre duas células de cancro do ovário linhas, SKOV3 e sua alta metastático derivado SKOV3-ip. Subsequentemente, metástase-associado

N-glicano

alterações no cancro do ovário descoberto por este método glycomics foram ainda validado pelo nível glycotransferase com diferentes técnicas de biologia molecular, incluindo-PCR em tempo real, transferência de Western, blotting lectina, e ensaio Transwell A análise imuno-histoquímica. O fluxo de trabalho total em nosso estudo foi mostrado na Figura 1. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira tentativa de revelar a visão global do

N

alterações glicanos relacionadas com metástases em secretome de células de cancro do ovário. Além disso, entre estas alterações, diminuir em bissector modificação GlcNAc e a sua correspondente glycotransferase (manosil (beta-1,4 -) – glicoproteína beta-1,4-N- acetilglucosaminiltransferase, MGAT3) expressão foi demonstrada estar relacionada com maior potencial metastático. Este estudo forneceu insights sobre descoberta de biomarcador associado a metástases, o que poderia ajudar na detecção de metástases peritoneal precoce do câncer de ovário, e, finalmente, melhorar o diagnóstico de câncer de ovário.

Materiais e Métodos

Cultura de células e Isótopos estáveis ​​Labeling

Serous linha de células de cancro do ovário Metabolic SKOV3 e sua alta metastático derivado SKOV3-ip foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC). Estas duas linhas de células de cancro do ovário foram cultivadas em meios de células RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen). A linha celular 293T foi obtida a partir do Institute of Cell Biology Academic Sinica (Xangai, China). As células 293T foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo soro fetal bovino a 10%. Todas as células foram cultivadas com 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 incubadora. Para experiências de marcação de isótopos estáveis, as células foram cultivadas durante pelo menos seis duplicações no meio RPMI1640 com soro bovino fetal a 10%, contendo 20 mM de L-glutamina (quer

14N ou amide-

15N-Gln) para conseguir completa incorporação de

N

glicanos marcados [41]. Amide-

15N-Gln (98% de pureza) foi adquirido a partir de Cambridge Isotopes, Inc. (Andover, MA, EUA).

O sobrenadante Aquisição

Seis milhões de células marcadas foram semeadas em 55 cm

2 placas de cultura de células e mantidos durante a noite para a fixação de células em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 20 mM de L-glutamina (quer

14N ou amide-

15N-Gln). Após 12 h, o meio de cultura foi removido, e as células foram lavadas por 3 vezes com solução salina tamponada com fosfato. E, em seguida, 10 ml de meio RPMI 1640 isento de vermelho isento de soro, com fenol 20 mM de L-glutamina (quer

14N ou amide-

15N) foram adicionados a cada prato. Após incubação durante 48 h, o meio condicionado foi recolhido e filtrado através de um PVDF Durapore de 0,22 um de membrana (Millipore, Billerica, MA, EUA). Antes, durante e após a privação de soro, a viabilidade das células cancerosas foi avaliada usando o ensaio de exclusão com corante azul de tripano. As concentrações de proteína de meios condicionados foram determinados utilizando um kit de ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). O meio condicionado com uma quantidade igual de proteínas obtidos a partir de SKOV3 e SKOV3-ip foram misturados. Subsequentemente, as misturas foram concentradas por Amicon Ultra-15, 3000 de peso molecular de corte (MWCO) de unidades de filtro centrífugos (Millipore, Billerica, MA, EUA) com excesso de sal para remover glycomics quantitativos. Todas as amostras foram armazenadas a -80 ° C até à sua utilização.

Release e Purificação de N-glicanos de secretada Proteome

O

N

liberação glicano -Conectado e purificação foram realizada como previamente descrito com modificações de menor importância [43]. Alíquotas da solução de proteína misto (100 L) foram diluídos com um volume igual de tampão de desnaturação constituído por 200 mM de NH

4HCO

3 (Sigma-Aldrich, Alemanha) contendo 20 mM de mdithiothreitol (Sigma-Aldrich, Alemanha). As amostras foram aquecidas durante 10 min em banho de água a 95 ° C. Depois de as amostras desnaturadas arrefecida para a temperatura ambiente, 1 mL de PNGase F (New England Biolabs, Inc., EUA) foi adicionado a cada amostra seguido de incubação durante a noite a 37 ° C. Subsequentemente, as proteínas desglicosiladas foram precipitados pela adição de 600 ul de etanol gelado armazenados a -80 ° C durante 2 h. Após centrifugação a 14.000 x g, durante 30 min a 4 ° C, o sobrenadante foi recolhido e secou-se por centrifugação a vácuo. Os glicanos libertados foram ainda purificados e dessalinizado utilizando um gráfico de carbono poroso Extração de Fase Sólida (PGC-SPE). Para este fim, os microcolunas PGC foram embalados com pó de carvão poroso gráfico e preparados utilizando pontas GELoader como descritos antes [44]. Os microcolunas foram pré-condicionados com 6 volumes de coluna de 0,1% (v /v) de ácido trifluoroacético (TFA), em 80% de acetonitrilo (ACN) /H

2O (v /v) e equilibrou-se com igual volume de água. Posteriormente, as amostras foram aplicadas às colunas repetidamente durante 5 vezes para conseguir adsorção glicanos completa. Subsequentemente, os microcolunas foram lavadas com aproximadamente 10 volumes de coluna de água para remover os sais e o tampão. Glicanos foram eluídas com 25% (v /v) de ACN contendo 0,05% (v /v) de TFA. Cada amostra foi depois dividida em dois aliquotas iguais e liofilizada num liofilizador de vácuo (Martin Christ GmbH, Osterode, Alemanha). Uma alíquota igual de cada amostra foi armazenada a -80 ° C até análise posterior. Outra alíquota igual de cada amostra foi permetilado.

permetilação de

N

glicanos

N

glicanos foram permetilado usando um procedimento publicado anteriormente com menor modificações [45]. Resumidamente, secou-se

N-glicanos

foram suspensos em 200 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO), e adicionou-se aproximadamente 20 mg de NaOH em pó. Depois a lama foi misturada vigorosamente, 100 mL de CH

3I foi adicionado e a incubação seguinte foi realizada num banho de ultra-sons durante 30 min. A reacção foi extinta por adição de 1 ml de água, e o excesso de CH

3I foi removido sob uma corrente de azoto. Subsequentemente, 1 ml de clorofórmio adicionou-se com agitação forte. Após separação de fases, a fase aquosa foi eliminada, enquanto a fase de clorofórmio inferior foi lavada 10 vezes com 1 ml de H

2O e secou-se para baixo sob uma corrente de azoto numa chaminé para assistida por matriz com dessorção por laser /espectrometria de massa de ionização (MALDI MS) análise.

MALDI MS análise

a análise por espectrometria de massa MALDI foi realizada em AXIMA Ressonância MALDI QIT TOF MS (Shimadzu Corp., Kyoto, Japão) com um laser de nitrogênio 337 nm. Todas as amostras foram analisadas a uma voltagem de aceleração de 20 kV no modo de ião positivo e reflectrão. CID foi realizada a uma energia de colisão de 4 keV com árgon como gás de colisão. O instrumento foi calibrado externamente por TOFMix ™ (LaserBio Labs, França) contendo oito péptidos padrão de calibração. Antes da análise por MS, glicanos unpermethylated foram reconstituídos em uma alíquota de 5 ul de 0,1% (volume /volume, v /v) de TFA em 50% de ACN /H

2O (v /v) e permetilado glicanos foram reconstituídas numa 5-ul alíquota de 50% de metanol. Cada uma das amostras (1 mL) foi descoberto num alvo MALDI e deixou-se secar ao ar à temperatura ambiente. Depois, 1 mL de 2,5-di-hidroxibenzóico matriz de ácido (DHB, Sigma-Aldrich, Alemanha), na concentração de 12,5 mg mL

-1 em ACN a 50% em água (v /v) contendo 0,1% de TFA foi adicionado sobre a camada de amostra e secou-se sob condições ambientais. Cada amostra foi flagrado em triplicado. Dois disparos de laser foram criados para gerar um perfil e 200 perfis foram acumulados a partir de diferentes pontos de irradiação com laser em um arquivo para cada ponto de amostra. Para a comparação dos

N

glicanos de secretomes das duas células de cancro do ovário, uma mistura 01:01 de

14N- e

amostras marcado com 15N foi inicialmente obtido através de mistura uma quantidade igual de proteínas de partida. E a mistura foi analisada (três repetições) para determinar as mudanças relativas nas abundâncias de

N

glicanos entre linha de células de cancro do ovário SKOV3 e sua alta metastático derivado SKOV3-ip. Todas as estruturas propostas de glicanos identificados foram interpretados com base manualmente em seus

m /z

valores de acordo com serveral literaturas publicados anteriormente [46], [47], GlycoWorkbench [48], Glycan Mass Spectral banco de dados [49], como bem como GlycoBase (Versão 2, https://glycobase.nibrt.ie/glycobase.html).

Quantitative PCR em tempo real para análise de mRNA Expression

total de RNAs foram extraídos de câncer de ovário linhas de células com o reagente de Trizol ™ (Invitrogen) e 2 ug de RNA total foi transcrito de forma inversa utilizando o kit de RT master Mix (Takara) de acordo com as instruções do fabricante. PCR em tempo real foi realizada em ABI 7500 rápido em tempo real do sistema de PCR (Applied Biosystems). As condições dos ciclos de PCR consistiu de um único passo de incubação a 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 5 segundos a 95 ° C, e 34 s a 60 ° C. Todas as reacções de PCR foram realizadas com Pré-mistura em tempo real SYBR verde-PCR kit (Takara) de acordo com o protocolo do fabricante. sequências de iniciadores utilizados na análise de PCR foram como se segue: MGAT3 humano para a frente (5′-CAGGGCACAGGATTGAAGAGTT-3 ‘) e reverso MGAT3 humana (5′-AGCTTGGTTTCCCTTCATATTGAG-3′); MGAT5 humano para a frente (5’-GACCTGCAGTTCCTTCTTCG-3 ‘) e reverso MGAT5 humana (5′-CCATGGCAGAAGTCCTGTTT-3′); desidrogenase humana gliceraldeído-3-fosfato (GADPH) para a frente (5’-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3 ‘) e reverso da GAPDH humano (5′-TGAGCGATGTGGCTCGGCT-3’). mRNA GADPH humana serviu como um controle endógeno para a normalização. análise de PCR em tempo real foi realizada em triplicado.

Plasmids e Gene superexpressão

SKOV3-ip e SKOV3 células foram transfectadas usando X-tremeGENE HP DNATransfection Reagente (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha ) com plasmídeos pcDNA3.1-MGAT5, respectivamente (fornecidos por um pesquisador em nosso laboratório), de acordo com as instruções do fabricante pcDNA3.1-MGAT3 ou. E vector pcDNA3.1 foi utilizado como controlo negativo. Às 48 horas após a transfecção, a sobre-expressão de MGAT3 MGAT5 e foram confirmados por análise de Western blot.

pequeno ARN interferente e Queda de MGAT3

células SKOV3 foram transfectadas com ARNsi MGAT3 específica Transfection Reagent Complexo, (Santa Cruz Biotech, Inc., SC-44469), o qual foi preparado de acordo com o protocolo do fabricante. Mexidos siARN foi utilizado como controlo negativo. Às 48 horas após a transfecção, foram preparados lisados ​​celulares por análise de Western blot para determinar a eficácia do gene knockdown.

Western Blot e análise de mancha de lectina

De modo a obter proteínas de células inteiras, as células foram recolhidas , lavou-se com solução de tampão fosfato (PBS) e depois lisadas em tampão de lise de SDS [50]. As concentrações totais de proteína foram determinadas pelo ensaio BCA (Pierce, Rockford, IL). Quantidades iguais de lisados ​​de proteína total de cada linha celular foram separadas por 10% de sódio de electroforese em gel de poliacrilamida de sulfato de dodecilo (SDS-PAGE) e em seguida, transferido para membranas de PVDF (Roche Applied Science). Eu. A análise de transferência de Western: Após o bloqueio com leite desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween 20 (TBST) durante 2 h à temperatura ambiente, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo monoclonal de ratinho contra MGAT3 (1/1000 diluído, Sigma) ou MGAT5 (1/1000 diluída, Sigma) e, em seguida, um anticorpo secundário à temperatura ambiente durante 1 h. Após a lavagem, as membranas foram detectados por quimioluminescência aumentada (ECL) Kit de ensaio. II. Análise de mancha de lectina: Após o bloqueio com BSA a 5% em TBST, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com biotinilado

Phaseolus vulgaris erythroagglutinin

(E-PHA) (1/5000 diluída, Vector Labs) ou

Phaseolus vulgaris leucoagglutinin

(L-PHA) (1/5000 diluída, Vector Labs). Em seguida, as membranas foram lavadas quatro vezes com TBST, seguido por incubação com estreptavidina peroxidase de rábano (Vector Labs) durante 30 min à temperatura ambiente. Subsequentemente, as membranas foram lavadas quatro vezes com TBST e detectou pelo kit de ensaio de ECL.

Transwell Ensaio de Migração

Para avaliar a capacidade migratória, a migração de células foi realizada utilizando câmaras de 24 poços formato Transwell ( 8 um filtro de poro, Corning, Canton, NY). Resumidamente, as células SKOV3 foram transfectadas com MGAT3 siRNA específico ou plasmídeo MGAT5, e as células SKOV3-ip foram transfectadas com plasmídeo MGAT3 durante 36 h, respectivamente. Depois disso, as células foram tripsinizadas, recolhidas, contadas, e depois suspensa em meio RPMI1640 isento de soro. 2 × 10

4 células em 100 uL de meio RPMI 1640 isento de soro foram tecendo para cada inserção da câmara superior. Entretanto, 600 mL de meio RPMI1640 contendo FBS a 10% foram adicionados a cada câmara inferior. Subsequentemente, as células foram incubadas durante 12 h a 37 ° C. Após remoção das células na superfície da membrana superior, as células na superfície inferior da membrana foram fixadas e coradas com violeta de cristal a 0,1% durante 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, as células que haviam passado através do filtro para a câmara inferior foram contadas microscopicamente em 6 regiões aleatórias por filtro. O número de células que atravessaram a membrana revelou a capacidade migratória das células testadas.

Análise Imunohistoquímica

Um total de 24 tecidos de cancro do ovário foram fixadas em 4% de formalina e embebidos em parafina. As secções de tecido foram primeiramente submetidos a hematoxilina e eosina (H E) Coloração para diagnóstico histopatológico. Em seguida, coloração imuno-histoquímica com o anticorpo anti-MGAT3 (Abcam, Cambridge, MA, EUA) foi realizada como descrito anteriormente [51]. A intensidade de coloração MGAT3 foi classificado de 0 a 3, em que 0 significa coloração negativa, 1, 2, 3 repousar durante coloração fraca, moderada e forte, respectivamente. tecidos de câncer de ovário foram obtidos a partir da Obstetrics and Gynecology Hospital, Universidade Fudan, de Xangai, China. Todos os protocolos foram aprovados pelo Institutional Review Board do hospital. Todos os pacientes deram o seu consentimento informado por escrito. informação clínica destes doentes foram apresentados na Tabela S1.

Processamento de Dados e Análise Estatística

MALDI MS e espectrometria de massa em tandem (MS /MS) dados foram adquiridos e processados ​​no software Launchpad (Shimadzu Biotech , Kyoto, Japão). Os parâmetros de processamento de pico: método de alisamento: Gaussian; método de detecção de pico: limiar-25% centróide; limite offset: 0,500 mV. O

m /z

valores e intensidades foram exportados como arquivos ASCII e intensidades de pico foram escalados com o pico mais alto como 100%. A quantificação relativa de

N-glicanos

detectadas foi de acordo com os protocolos relatados anteriormente [42]. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Prism (versão 5). Todas as experiências foram realizadas pelo menos três vezes. Os dados foram expressos como a média ± erro padrão da média (SEM). Student

t

-test foi utilizado para determinar a significância das diferenças entre os dois grupos. Wilcoxon Signed Rank Test foi usada para comparar os dados de imuno-histoquímica dos dois grupos. A

p

-valor menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Quantitativa /Comparativa Glycomics Análise do sobrenadante entre SKOV3 e celular SKOV3-ip

Para descobrir a

N

alteração glicanos em secretome de células de cancro do ovário, o pool total de

N

mistura-glicanos, lançado pela enzima Peptide

N

-glycosidase F a partir da mistura de secretoma SKOV3 (amide-

15N-etiquetada Gln) e células SKOV3-ip (amide-

14N-etiquetada Gln), foi analisada por MALDI-TOF-MS QIT ( Figura 2). Um total de 17

foram identificados N

glicanos, incluindo manose elevada, híbrido, triantenária, estruturas tetra-ramificados e bisecting glycoforms GlcNAc. Todo o identificado

N

-glicanos com a estrutura proposta foram mostradas na Figura 2 e resumidos na Tabela 1.

N

-Conectado glicanos a partir de uma mistura 01:01 de SKOV3 -IP (Gln-14 marcado) e SKOV3 (Gln-15 marcado) sobrenadante. As estruturas foram interpretados manualmente com base em suas

m /z

valores de acordo com várias literaturas anteriormente publicados [46], [47], [48] GlycoWorkbench bem como Glicano Massa Espectral banco de dados [49]. Gln-14 indica amide-

14N-Gln; Gln-15 indica amide-

15N-Gln. círculo verde indica manose; círculo amarelo indica galactose; quadrado azul indica

N

acetilglicosamina; triângulo vermelho indica fucose.

A análise quantitativa de

N

glicanos da mistura secretome de SKOV3 e células SKOV3-ip foi baseada em intensidades de sinal. As relações de intensidade (SKOV3-ip /SKOV3) de 0,83 e 1,2 foram definidos como o limiar para estimar a jusante ou sobre-regulação da

N

níveis glicanos em células SKOV3-ip, em comparação com células SKOV3 , uma vez que o coeficiente máximo de variação (CV) (n = 9) foi inferior a 20% neste estudo [43]. quantificação relativa de todos detectado

N

glicanos entre as células SKOV3 SKOV3-ip e foram resumidos na tabela 1. Os resultados demonstraram que três em cada quatro altas estruturas de manose foram regulados positivamente em células SKOV3-ip.

N

glicanos contendo híbrido, triantenária e estruturas tetra-ramificados com ou sem fucose foram elevados em células SKOV3-ip. A tendência semelhante foi observada em três glicanos com estruturas biantenais complexos. Entre toda a alteração no

N

glicanos, todo o

N

glicanos com bisecting GlcNAc foram encontrados para ser aparentemente diminuiu nas células SKOV3 IP, com os seus rácios de SKOV3-IP /SKOV3 variando ,73-,12, enquanto todo o β-1,6-GlcNAc ramificada

N-glicanos foram

elevada em células SKOV3-ip. Entre estes

N

glicanos alterados, nós nos concentramos no

N

glicanos com bisecting GlcNAc, em parte porque todos eles diminuíram e eles foram os mais obviamente alterado

N

glicanos. Além disso, um corpo crescente de provas indicou que os glicanos bisecting pode afectar a progressão tumoral e metástase [52] .As estruturas contendo GlcNAc bissectora foram ainda confirmadas por espectrometria de massa em tandem (MS /MS). em tandem representativas espectros de MS de

m /z

2012,7 [M + Na]

+, e

m /z

2377,8 [M + Na]

+ foram mostradas nas Figuras S1A -B.

é digno de nota que os ácidos siálico, normalmente apresentados como monossacarídeos terminais na porção glicano de muitas glicoproteínas, desempenham um papel essencial em muitos processos fisiológicos e patológicos. glicanos sialilados são instáveis ​​e fácil de ser perdido durante a análise por espectrometria de massa direta de

N

glicanos não derivados. Como permetilação pode estabilizar os resíduos de ácido siálico por conversão -OH altamente polar e -COO

– grupos de diferentes monossacarídeos em apolar [38],

N-glicanos

após permetilação foram também analisados. Os resultados demonstraram que mais

N-glicanos

com diferentes graus de sialilação foram observadas em comparação com os resultados da análise sem permetilação. Apesar do sinal de um

N

-glicanos com bisecting GlcNAc pode ser descentralizado para vários sinais de

N

glicanos com diferentes graus de sialilação, a tendência de alteração em todas as estruturas GlcNAc bifurcado foram o mesmo, não importa permetilado ou não (ver figura S2). A intensidade de sinal do bissector

N-glicano sem

permetilação (Figura S2A,

m /z 2012,6

por exemplo) foi maior do que a de permetilado

N-glicanos em

m /z

2.489,4,

m /z

2.850,3 e

m /z

3.211,4 contendo 0, 1 e 2 ácidos siálico respectivamente (Figura S2B). É possivelmente porque parte da intensidade de sinal bissectriz original (Figura S2A) foi contribuído para os fragmentos correspondentes dos glicanos com estrutura mesma enquanto contendo 1 e 2 ácidos siálicos adicionais (Figura S2B). Além disso, os perfis de glicano com permetilação eram mais complexos (isto é, têm mais picos). Deste modo, sugere-se que o passo de permetilação provavelmente poderia ser omitido em análise quantitativa glycomics desses

N-glicanos neutros

que é sem relação a ácidos siálicos, como bissectriz GlcNAc glicoforma neste estudo.

expressão diferencial de MGAT3 em SKOV3-ip e linhas celulares SKOV3

Como bisecting resíduo GlcNAc foi sintetizado por glycosytransferase específico (MGAT3), a mudança no

N

glicanos com bisecting GlcNAc podem ser correlacionados com a correspondente alteração no MGAT3. Portanto, a análise de PCR em tempo real foi realizada para comparar os níveis de MGAT3 expressão mRNA entre SKOV3 e linhas celulares SKOV3-ip. Os resultados demonstraram que MGAT3 foi expresso diferencialmente entre as duas linhas de células. O nível de ARNm de MGAT3 foi significativamente maior em células SKOV3 do que em células SKOV3-ip (61-vezes,

P

0,001, Figura 3A). Em seguida, a expressão de MGAT3 nestas duas linhas de células foi ainda avaliada no nível de proteína por análise de Western blot. A menor abundância de MGAT3 foi observado para células SKOV3-ip, em contraste com células SKOV3 (Figura 3B). Portanto, a diminuição da expressão MGAT3 em ambos os níveis de mRNA e proteína em células SKOV3-ip estavam de acordo com a diminuição da bissectriz modificação GluNAc no sobrenadante de células SKOV3-ip manifestada por análise glycomics quantitativa.

(A) Os níveis de expressão de mRNA MGAT3 em SKOV3-ip e linhas celulares SKOV3. Os níveis de ARNm de MGAT3 foram normalizados com GAPDH níveis. Significar mudanças de dobra foram calculados com o 2

-ΔΔCt método. (B) Os níveis de expressão de proteína de MGAT3 em SKOV3-ip e linhas celulares SKOV3. Os lisados ​​celulares foram isolados por 10% de SDS-PAGE de Western blotting utilizando anticorpos contra MGAT3. Humano da beta-actina serviu como um controle endógeno. A linha celular 293T foi utilizado como controlo positivo. Os dados são expressos como o meio ± SEM. Cada ensaio foi realizado pelo menos três vezes. A

p

-valor inferior a 0,05 indica significância estatística usando Student

t

-teste.

Efeitos de MGAT3 sobre Migração capacidade das células do cancro do ovário

os dados acima mostram que os níveis de MGAT3 e sua catalysate,

N

glicanos contendo bissectriz GlcNAc, foram significativamente menores em células SKOV3-ip em comparação com a de células SKOV3. Como as células SKOV3-ip são os derivados altamente metastáticas de células SKOV3, estes resultados sugerem um papel potencial de MGAT3 e sua catalysate, que atravessa glicanos, na motilidade celular de cancro do ovário. Para testar isso, gene MGAT3 foi sobre-expressos em células SKOV3-ip por transfecção. A análise de transferência de Western demonstrou um aumento significativo na expressão MGAT3 após a transf ecção, em comparação com células de controlo-ip-SKOV3 (Figura 4A). O nível de glicanos bisecting também foram elevados em conformidade (Figura 4B). Para confirmar se a sobre-expressão de MGAT3 afectar a capacidade de migração, foram realizados ensaios de migração trans-poços. Tal como mostrado na Figura 4C e 4D, a capacidade de migração em células transfectadas MGAT3 foi significativamente reduzido a 52% do que nas células de controlo. Enquanto isso, o knockdown de MGAT3 em células SKOV3 foi realizada por-alvo MGAT3 siRNA transfecção. A análise por Western blot demonstrou depressão eficiente de expressão MGAT3 em SKOV3 após a transfecção (Figura 5A). O nível de glicanos bisecting foram sub-regulada em conformidade (Figura 5B).