Sumário

O cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. A falta de detecção precoce e opções limitadas de terapias-alvo são ambos fatores que contribuem para as estatísticas sombrias observados em câncer de pulmão. Assim, os avanços em ambas as áreas são susceptíveis de conduzir a melhores resultados. MicroRNAs (miRNAs) miRs ou representam uma classe de RNAs não-codificantes que têm a capacidade para a regulação de genes e pode servir como biomarcadores de diagnóstico e prognóstico no câncer de pulmão. padrões de expressão anormais para vários miARNs foram identificadas em cancros do pulmão. Especificamente, deixe-7 e miR-9 estão desregulados em ambos os cancros do pulmão e outros tumores sólidos. Neste trabalho, construímos um modelo matemático que integra deixá-7 e miR-9 expressão em uma via de sinalização para gerar um modelo em silico para o processo de transição mesenquimal epitelial (EMT). Simulações do modelo demonstraram que as mutações de EGFR e de Ras em cancros do pulmão não pequenas (NSCLC), que levam ao processo de EMT, resultar em miR-9 regulação positiva e deixou-7 supressão, e este processo é um pouco robusto contra entrada aleatória em miR-9 e mais fortemente robusta contra entrada aleatória para let-7. Nós somos eleitos para validar o nosso modelo in vitro, testando os efeitos da inibição EGFR em MYC jusante, miR-9 e deixe-7a expressão. Curiosamente, em uma linha de células de cancro do pulmão de EGFR mutante, o tratamento com um inibidor de EGFR (Gefitinib) resultou numa redução de concentração específica em c-Myc e miR-9 expressão apesar de não alterar let-7a expressão. Nosso modelo matemático explica a ligação de sinalização entre EGFR, MYC, e miR-9, mas não deixe-7. No entanto, muito pouco se conhece sobre os fatores que regulam a let-7. É bem possível que, quando tais fatores reguladores tornou conhecido e integrado no nosso modelo, eles vão apoiar ainda mais o nosso modelo matemático

Citation:. Kang HW, Crawford M, Fabbri M, Nuovo G, Garofalo M, Nana- Sinkam SP, et al. (2013) um modelo matemático para MicroRNA no câncer pulmonar. PLoS ONE 8 (1): e53663. doi: 10.1371 /journal.pone.0053663

editor: Elad Katz, da Universidade de Edimburgo, Reino Unido

Recebido: 31 de maio de 2012; Aceito: 03 de dezembro de 2012; Publicação: 24 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado em parte pelo Instituto de Biociências matemática e da National Science Foundation sob DMS subvenção 0931642 e pelo Instituto Nacional do Câncer sob concessão CA 150297. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. Em os EUA o número de novas ocorrências é de aproximadamente anualmente, o número de mortes é, em representação de todas as mortes relacionadas ao câncer [1]. A falta de detecção precoce e opções limitadas de terapias-alvo são ambos fatores que contribuem para as estatísticas sombrias observados em câncer de pulmão. Assim, os avanços em ambas as áreas são susceptíveis de conduzir a melhores resultados.

microRNAs (miRNAs miRs ou) representam uma classe de RNAs não-codificantes que têm a capacidade para a regulação de genes e pode servir como diagnóstico e prognóstico biomarcadores em câncer de pulmão. padrões de expressão anormais para miARNs foram identificadas em cancros do pulmão. Especificamente, deixe-7 e miR-9 estão desregulados em ambos os cancros do pulmão e outros tumores sólidos. Takamizawa et al. (2004) e Nicoloso et ai. (2009) demonstraram que deixe-7 é regulada negativamente em cancros do pulmão de células não pequenas (NSCLC) [2], [3]. Vários investigadores demonstraram que a let-7 portos propriedades supressivas de tumor tanto in vitro como in vivo [4], [5]. Usando dados de microarranjos, Yanaihara et al. (2006) relataram que o miR-9 foi diminuída em NSCLC [6], ao passo que Volinia et ai. (2006) relataram um aumento na expressão de miR-9 [7]. Mais recentemente Crawford et ai. (2009) relataram um aumento da expressão de miR-9 em [8] NSCLC, e VOSA et ai. (2011) chegou à mesma conclusão a partir de seus dados de microarranjos [9]. Recentemente, temos também analisado independentemente casos de NSCLC e comparados miR-9 expressão entre tumores e tecido pulmonar sem envolvimento adjacente. Descobrimos que em cerca de casos miR-9 foi sobre-expressos em tumores de pulmão; veja Suplementar Material de S1. Uma investigação recente mostrou que miR-9 contribui para o potencial metastático em câncer de mama em parte, visando componentes da transição epitelial mesenquimal (EMT) [10]. No entanto, o papel para miR-9 na patogénese do cancro do pulmão é menos bem compreendido. Mascaux et ai. (2009) demonstraram uma indução em miR-9 expressão durante a carcinogênese escamosas brônquica [11].

Dado o fato de que um único miRNA pode regular dezenas a centenas de genes, compreendendo a importância de um miRNA individual na biologia do câncer pode ser um desafio. Isto é ainda mais complicado pela observação de que a desregulação de vários miARNs é muitas vezes necessária para causar um determinado fenótipo. Até à data, não existem poucos modelos para elucidar os mecanismos pelos quais os vários miARNs contribuem ambos individualmente e em conjunto para promover a iniciação e progressão do tumor. Aplicando a modelagem matemática para miRNA biologia oferece uma oportunidade para entender essas relações complexas. No presente estudo, nós desenvolvemos pela primeira vez um modelo matemático focando miARNs (miR-9 e deixam-7), no contexto de cancro do pulmão como um sistema modelo; no entanto, o nosso sistema modelo poderia ser aplicável a miRNA biologia em ambas as doenças malignas e benignas. Por questões de simplicidade, que integraram estes miARNs em uma via de sinalização para gerar um modelo de silício para o processo de EMT. Aqui, nós incluímos a sinalização a jusante complexa e associada EGF-EGFR culminando em metaloproteinases da matriz expressão (MMP). Outros componentes do nosso caminho incluem SOS, Ras, ERK, MYC, E-caderina, miR-9, e deixe-7.

Temos simulado o modelo sob vários cenários de mutações genéticas que podem levar ao câncer de pulmão e determinar, em cada situação, que o miR-9 foi regulada positivamente e deixou-7 regulada negativamente. Nós também têm demonstrado que o processo conducente à EMT é um pouco robusta contra entrada aleatória em miR-9 e mais fortemente robusta contra entrada aleatória para let-7.

Resultados

Fundo Biológica

a Figura 1 a mostra uma via de sinalização que envolve o miR-9, deixou-7, MYC, e EMT, enquanto que a Figura 1 B é uma versão simplificada que vai ser utilizado no modelo matemático. miR-9 é regulada em NSCLC. Embora Yanaihara et ai. (2006) relataram uma diminuição de miR-9 utilizando dados de microarray [6], vários outros papéis, alguns mais recente, relatou um aumento de miR-9 em NSCLC: Volinia et al. (2006) e VOSA et ai. (2011) utilizaram microarrays [7], [9], e Crawford et al. (2009) utilizaram PCR [8]. Analisamos casos de NSCLC com PCR e demonstrar miR-9 superexpressão em tumores de pulmão em comparação com pulmão não envolvido adjacente e apresentar uma representação de tais casos; veja Suplementar Material de S1.

Um caminho do complexo de EGF-EGFR de MMP, que inclui miR-9 e let-7, é dada em (A) e um caminho simplificado é mostrado em (B).

MYC controla muitos processos celulares fundamentais, e expressão MYC aberrante é conhecida por estar associada com o cancro. Por exemplo, Frenzel et ai. (2010) observaram que MYC é normalmente activado em muitos cancros [12], e Aguda et ai. (2008) mostrou como MYC pode actuar tanto como um oncogene ou supressor de tumores [13]. No cancro do pulmão, oncogenes da família MYC são amplificados em ambos os cancros do pulmão de células pequenas (SCLC) e NSCLC [14], [15]. Além disso, c-Myc podem induzir metástases em c-Raf mutante NSCLC [16].

Os investigadores identificaram também uma ligação entre myc e miARNs que também desempenham um papel importante no cancro. Rinaldi et ai. (2007) mostraram que tanto myc e o cluster miARN miR-17-92 são amplificados no linfoma de culas do manto humano [17]; Frenzel et ai. (2010) descreveram o miR-9 como um miARN oncogénica e deixou-7, como um supressor de tumor miARN ambos os quais são regulados por MYC [12]: MYC induz miR-9, que vias supressores de blocos de tumor, enquanto inibe MYC let-7, que bloqueia vias oncogênicos. Ma et al. (2010) encontraram que o miR-9 é impulsionada por MYC, regula negativamente a E-caderina, e induz a metástases no cancro da mama [10]. Wolfer e Ramaswamy (2011) investigaram o papel de MYC na metástase do câncer de mama utilizando uma via de sinalização que inclui let-7, miR-9, E-caderina, e EMT [18].

O nosso percurso proposto baseia-se em várias linhas de investigação. Similar ao câncer de mama, deixe-7 é regulada negativamente em NSCLC [2], [3]. Takamizawa et al. (2004) demonstraram que as reduções de deixá-7 tão elevada como ocorreu em tumores comparada com o tecido pulmonar adjacente não envolvido [2]. Neste mesmo estudo, apenas os casos tiveram tais reduções (). No entanto, uma investigação mais recente Inamura et al. (2007) demonstraram que entre os adenocarcinomas bem diferenciados (), as reduções de let-7 membros da família foram mais modestos (cerca de) [19]. Wang et al. (2011) afirmaram que c-Myc reprime a transcrição de deixá-7 [20]. Johnson et ai. (2005) e outros mostraram que Ras é suprimida por deixar-7 [21]. Lee e Dutta (2007) sugeriu que deixe-7 reprime HMGA-2 numa célula de cancro do pulmão [22], e Thuault et ai. (2008) afirmou que HMGA-2 provoca EMT ativando Snail1 que por sua vez reprime caderina-E [23]. E-caderina regula negativamente MMP em células tumorais brônquica [24]. Tanto o E-caderina e MMP têm sido implicados como biomarcadores em vários tumores sólidos incluindo cancro do pulmão. Um estudo recente mostrou que os níveis elevados de MMP-9 em casos de NSCLC correlacionada com estágios avançados e a presença de metástases [25]. Além disso Rao et al. (2005) demonstraram in vitro e in vivo que a transferência genética mediada por adenovirus de MMP-9 pode reduzir o cancro do pulmão capacidade invasiva e formação de metástases [26]. Diminuição da expressão de E-caderina também parece correlacionar-se com a doença clinicamente mais agressivos [27] – [29].

e Der Roberts (2007) utilizaram uma via EGFR-Ras-Raf-MEK-ERK para explicar que 10 % de NSCLC surgir a partir de mutações de EGFR e que 30% de NSCLC surgir a partir de mutações em Ras [30]. SOS é um intermediário entre o complexo de EGF-EGFR e Ras [31], e é reprimido através do feedback negativo por ERK, [33] [32]. Huang et ai. (2011) mostraram que a ERK /MAPK, no cancro do pulmão activa c-myc [34]. Figura 1 Um fornece um resumo das linhas acima de investigação. Para efeitos de simplicidade, propomos uma versão mais simples na Figura 1 B, que engloba, no entanto, as principais características da Figura 1 A. reconhecemos que outras vias de sinalização são accionados pelo complexo de EGF-EGFR, incluindo PI3K /Akt, que regula a sobrevivência de células. No entanto, dado o nosso interesse em miR-9 e deixá-7 como potenciais biomarcadores, não incluímos esta via em nosso modelo.

Modelo Equações

Nós introduzimos um sistema de equações diferenciais ordinárias que descrevem uma via de sinalização de EMT (representada pelo nível de ARNm de MMP) induzida por MYC através de miR-9 e deixou-7 como mostrado na Figura 1 B. as equações diferenciais são baseadas na Figura 1 B, e explicações detalhadas são dadas em Methods . Notação para concentrações das espécies é dada na Tabela 1. (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8)

Simulações

Um grande número de casos de NSCLC surgir a partir de mutações de EGFR [35], [36] ou ras [37]. Nós assumimos que o feedback negativo de ERK para SOS pode ser interrompido em NSCLC. Nós descrevemos essas aberrações, aumentando, aumentando, ou diminuir, de modo que o nível de concentração de aumentos complexos EGF-EGFR, Ras está sobre-activada pela SOS, ou feedback negativo da ERK a SOS está enfraquecido. Os seguintes simulações demonstrar o efeito do aumento e na e diminuir em no aumento do miR-9, deixe-7 e MMP.

Simulações das equações do modelo foram realizadas utilizando Matlab. Utilizou-se um solucionador ode, ode15 s, para resolver um sistema de equações diferenciais ordinárias numericamente. Para resolver um sistema de equações diferenciais estocásticos com entradas aleatórias no miR-9 ou deixá-7 numericamente, foi desenvolvido um código usando um esquema de Euler. Todos os valores iniciais são tidas como os de células normais saudáveis, ou seja,,,,,,,, e.

Se aumenta como resultado de mutações em EGFR, esperamos um aumento no miR-9 e um diminuir de let-7 como, aliás, são observados em câncer de pulmão. Também haverá um aumento no ARNm de MMP significando EMT e a migração de células, o que contribui para a metástase. A Figura 2 mostra o nível de miR-9, deixou-7, e MMP no como uma função de: à medida que aumenta, as concentrações de miR-9 e MMP ARNm aumentar e deixou-7 concentração diminui. Por exemplo, para, o nível de miR-9 aumenta por vezes de de a e o de mRNA MMP concentração aumenta por vezes de de a comparação com o nível em células normais saudáveis. Por outro lado, o nível de concentração de 7-deixe diminui por vezes de de a.

. As unidades nos eixos verticais estão dentro e o tempo está próximo.

A Figura 3 mostra o efeito de mutações Ras sobre os níveis de miR-9, let-7, e mRNA MMP depois. mutações de Ras são representados por um aumento na. Vemos que à medida que aumenta, assim como as concentrações de miR-9 e mRNA MMP enquanto deixá-7 diminui a concentração. Por exemplo, para, o nível de miR-9 concentração aumenta por vezes de de a e o de mRNA MMP concentração aumenta por vezes de de a comparação com o nível em células normais saudáveis. Por outro lado, o nível de concentração de 7-deixe diminui por vezes de de a.

. As unidades nos eixos verticais estão dentro e o tempo está próximo.

Quando o feedback negativo da ERK a SOS está enfraquecido como resultado de possíveis mutações no ERK, o parâmetro na Eq. (1) é diminuída. A Figura 4 mostra o efeito destas mutações: como diminui, as concentrações de miR-9 e MMP e aumenta a de deixar-7 diminui. Por exemplo, para, o nível de miR-9 concentração aumenta por vezes de de a e o de mRNA MMP concentração aumenta por vezes de de a comparação com o nível em células normais saudáveis. Por outro lado, o nível de concentração de 7-deixe diminui por vezes de de a.

. As unidades nos eixos verticais estão dentro e o tempo está próximo.

Na Figura 5, simulamos a evolução temporal da SOS, Ras, ERK, MYC, miR-9, let-7, E -Cadherin, e MMP ARNm ao longo de um período de com; na Figura 6, as simulações são realizadas para o período mais longo de. Uma comparação entre os painéis das duas figuras revela que a dinâmica de SOS, Ras, e ERK são muito rápidas; MYC, miR-9, e deixe-7 mudança relativamente mais lento, e mRNA MMP leva ainda mais tempo para atingir o equilíbrio. Após alguns minutos, SOS e Ras aumentou em fold a partir de e para, respectivamente; ERK e MYC aumentou em fold a partir de e para, respectivamente; miR-9 aumentaram fold de a; MMP aumentou fold de a comparação com os seus valores nas células normais; let-7 diminuiu fold de a, e E-caderina diminuiu fold de para.

. O tempo é de a; Os valores iniciais são as de uma célula saudável normal; as unidades nos eixos verticais estão dentro e as unidades nos eixos horizontal estão em minutos.

. O tempo é de a; Os valores iniciais são as de uma célula saudável normal; as unidades nos eixos verticais estão dentro e as unidades nos eixos horizontais são escalados em minutos.

Figuras 7 e 8 mostram simulações semelhantes quando é aumentada para e as Figuras 9 e 10 mostram simulações semelhantes quando é diminuiu para. Na Figura 8, por vezes de aumento Ras de a; ERK e MYC aumentou em fold a partir de e para, respectivamente; miR-9 aumentaram fold de a; MMP aumentou fold de a comparação com os seus valores nas células normais; SOS diminuiu fold de a; let-7 diminuiu fold de a, e E-caderina diminuiu fold de para. Na Figura 10, as mudanças de concentração essencialmente na mesma quantidade como na Figura 6.

. O tempo é de a; Os valores iniciais são as de uma célula saudável normal; as unidades nos eixos verticais estão dentro e as unidades nos eixos horizontal estão em minutos.

. O tempo é de a; Os valores iniciais são as de uma célula saudável normal; as unidades nos eixos verticais estão dentro e as unidades nos eixos horizontais são escalados em minutos.

. O tempo é de a; Os valores iniciais são as de uma célula saudável normal; as unidades nos eixos verticais estão dentro e as unidades nos eixos horizontal estão em minutos.

. O tempo é de a; Os valores iniciais são as de uma célula saudável normal; as unidades nos eixos verticais estão dentro e as unidades nos eixos horizontais são escalados em minutos.

Seria interessante estudar o efeito de um “fundo” no miR-9 e deixá-7 , ou seja, os genes com os quais estes interagem miARNs. Tais interacções no entanto, não são reportados na literatura. Nós, portanto, modelar tais interações por uma entrada aleatória. A Figura 11 mostra como perturbações aleatórios de miR-9 afectar MMP (EMT). Configuração e como apresentados na Figura 2, o miR-9 perturbado por entrada de Gauss aleatória e MMP são mostrados na Figura 11 A-D e E-H, respectivamente (que adicionado no lado da mão direita de onde é um movimento browniano padrão). Os painéis A /B e E /F na Figura 11 corresponde ao caso em que o miR-9 é perturbado por entrada de Gauss com painéis e C /D e G /H na Figura 11 corresponde ao caso em que para aumentar. Em Painéis B /D /F /H na Figura 11, que compara a concentração de MMP com perturbações aleatórias (linha vermelha) e sem perturbações (linha pontilhada verde). A Figura 12 mostra resultados semelhantes no caso de deixar-7 com e. Os painéis A /B e E /F na Figura 12 corresponde ao caso em que deixe-7 é perturbado por entrada de Gauss com painéis e C /D e G /H na Figura 12 corresponde ao caso em que para aumentar. Figuras 13 e 14 mostram meios (azuis ou linha vermelha) e desvios-padrão (linha tracejada preta) do meio de miR-9, let-7, e as concentrações de MMP obtido a partir de realizações de simulação com os mesmos parâmetros nas Figuras 11 e 12. Os resultados das simulações em Figuras 11-14 são obtidos com o passo de tempo fixo,.

para (a-D) e para (e-H). Para (A, B, E, F) e para (C, D, G, H). As unidades nos eixos horizontais são escalados em minutos.

Para (A-D) e para (E-H). Para (A, B, E, F) e para (C, D, G, H). As unidades nos eixos horizontais são escalados em minutos.

Para (A-D) e para (E-H). Para (A, B, E, F) e para (C, D, G, H). As unidades nos eixos horizontais são escalados em minutos. O resultado é tirado de realizações de simulação.

Para (A-D) e para (E-H). Para (A, B, E, F) e para (C, D, G, H). As unidades nos eixos horizontais são escalados em minutos. O resultado é tirado de realizações de simulação.

Conclui-se que a média das concentrações de MMP e desvios padrão das médias são estáveis ​​(robusta) a pequenas perturbações no miR-9, ou seja, quando. No entanto, quando já aumentar a estabilidade dos desvios-padrão da concentração média MMP tende a quebrar como vemos Painéis D /H na Figura 13; Painéis D /H na Figura 11 mostra um caminho amostra de concentração de MMP instável contra miR-9 perturbação. Por outro lado, a média de MMP concentrações e desvios padrão do meio são muito mais estável para deixá-7 perturbações com os grandes, e trajetórias de meios de acompanhar de perto a trajetória de MMP, sem entrada aleatória, como mostrado na Figura 14; A Figura 12 mostra um caminho amostra de concentração de MMP contra a let-7 perturbação. Observe que temos tido nos Painéis A /B /E /F e nos Painéis C /D /G /H. Para deixá-7, se tomarmos tão pequeno quanto como fizemos em painéis C /D /G /H na Figura 11, os desvios-padrão são muito pequenos e insignificantes (não mostrado aqui). A razão pela qual a MMP é mais estável contra perturbações aleatórios de deixar-7 do que contra o miR-9 perturbações é que deixe-7 perturbações submeter a amortecimento pelas reacções negativas de deixar-7 a Ras e de ERK de SOS, como se mostra na Figura 1. resultados semelhantes (não mostrado aqui) segurar quando variamos ou, em vez de.

Análise de Sensibilidade

Uma vez que estamos nos concentrando no miR-9 regulação positiva e deixe-7 downregulation como potenciais biomarcadores para o câncer de pulmão , queríamos determinar como o quociente de miR-9 dividido por deixar-7 depende dos parâmetros das equações modelo. Estamos focados sobre os parâmetros da Tabela 2 que são apenas estimativas. Foi realizada análise de sensibilidade, empregando o método de coeficiente de correlação parcial (PRCC), utilizando o programa descrito anteriormente [38]. Deixamos que cada um dos parâmetros variam no intervalo entre o valor estimado e duas vezes o seu valor estimado. Usando o método de amostragem Latin Hypercube como em [38], foram amostrados cada parâmetro de intervalos uniformemente distribuídos e correu realizações de simulação. Então, transformamos os valores dos parâmetros incluídos na amostra e a relação entre o miR-9 e let-7, calculado na simulação para valores de classificação, e calculados os coeficientes de correlação de classificação parcial. valores PRCC dos parâmetros estimados e seus limites são apresentados na Tabela 3, e gráficos de dispersão de parâmetros estatisticamente significativos são apresentados na Figura 15.

Gráficos de dispersão são atraídos para os parâmetros estatisticamente significantes (p-valor); as unidades nos eixos horizontal e vertical são escalados em; tempo está minutos eo resultado é retirado de realizações de simulação.

Entre os parâmetros,,,,,, e foram estatisticamente significativas. Os parâmetros e foram fortemente correlacionada positivamente com. Isso é natural; de facto e as taxas de produção são de myc e miR-9. À medida que aumentar a taxa de produção de MYC, miR-9 concentração aumenta e deixe-7 concentração diminui. Por outro lado,,, e foram fortemente correlacionados negativamente a. Isto também é de se esperar. Com efeito, é a taxa de produção de deixá-7, é a constante de saturação de MYC como fonte para miR-9, e é a constante de controlo de MYC na equação let-7. Portanto, é natural que diminuiria como parâmetros, e aumento. Quando correu realizações de simulação, foram obtidos resultados semelhantes.

inibição EGFR reduz tanto c-MYC e miR-9 em uma concentração maneira dependente

Em uma tentativa inicial para validar o nosso modelo matemático, nós tratamos uma linha mutante EGFR células de câncer de pulmão com várias concentrações do inibidor EGFR clinicamente usado Gefitinib. Em seguida, avaliou células tratadas para miR-9, let-7a e expressão de c-myc por qRT-PCR. Como mostrado na Figura 16, determinou-se que enquanto que as concentrações mais baixas () de Gefitinib causou uma redução estatisticamente significativa em ambos os miR-9 e C-MYC, efeitos semelhantes não foram evidentes para concentrações mais elevadas de Gefitinib ou em let-7a. Estas descobertas, enquanto eles teriam de ser validado em outras linhas de células sugerem a complexidade adicional da inibição efeitos EGFR na expressão miRNA e que o nosso modelo matemático prevê apenas parcialmente as ligações biológicas entre EGFR, c-MYC e miRNA no câncer de pulmão.

a significância estatística é definida como *

p Art 0,05 em (a) e **

p

. 0,01 em (C)

Discussão

o cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. A maioria dos casos são diagnosticados em fases posteriores limitando assim as opções terapêuticas e que contribuem para a má evolução. Como resultado, os investigadores procuraram identificar biomarcadores específicos de câncer de pulmão que podem ser utilizadas para a detecção precoce e para compreender melhor o processo metastático. Tais biomarcadores podem melhorar significativamente o prognóstico e reduzir a mortalidade. Neste trabalho, propomos um modelo matemático que integra os miRNAs deixá-7 e miR-9 no processo de EMT. miR-9 foi demonstrado ser significativamente regulada positivamente e deixou-7 regulada negativamente em NSCLC.

Com base na literatura experimental, introduzimos uma via de sinalização a partir do complexo de EGF-EGFR a expressão de MMP que envolve SOS, Ras, ERK, MYC, o miRNAs miR-9 e let-7, e-caderina, e MMP. Estudos recentes demonstraram elevados de MMP-9 em NSCLC [25], mas para fins de modelagem a que nos referimos MMP de uma forma genérica. Usando uma linha celular de cancro do pulmão mutante de EGFR, que mostrou que a inibição do EGFR leva a uma redução na miR-9, bem como de c-myc. No entanto, as relações entre o miR-9 e C-MYC não foram consistentes em concentrações mais elevadas do tratamento com medicamentos. Estes resultados suportam a complexidade da cinética de miRNA e alvo relações genéticas e destacar as dificuldades inerentes com modelagem miRNA biologia. Nossos resultados sugerem que as concentrações mais elevadas de EGFR são susceptíveis de envolver outros reguladores de miR-9 e /ou c-MYC e que miR-9 pode estar sob o controlo regulamentar de genes adicionais além do c-MYC.

correspondentemente desenvolvido um modelo matemático que inclui um sistema de equações diferenciais e utilizado o modelo utilizado para calcular o nível de miR-9 superexpressão e deixou-7 downexpression na definição de mutações de EGFR e mutações de Ras. Mostrámos que tais mutações regular positivamente o nível de miR-9 e infra-regular o nível de deixá-7. O aumento fold no miR-9 níveis obtidos nas simulações foi consistente quantitativamente com os dados clínicos relatados em tumores de pulmão humano (Recurso de materiais S1). Nossos experimentos com células de câncer de pulmão mutante EGFR não mostrou qualquer alteração significativa no let-7, sugerindo que deixá-7 também pode ser regulada por outras redes de sinalização. Nós investigamos como perturbações de aleatório deixá-7 e miR-9 afetar MMP e concluiu que a MMP é mais robusto contra Deixe-7 perturbações do que contra miR-9 perturbações; isto pode ser explicado pelo fato de que let-7 perturbações sofrem de amortecimento pelos feedbacks negativos de let-7 para Ras e da ERK para SOS.

Para o melhor de nosso conhecimento, o presente trabalho é o primeiro que desenvolve um modelo de cancro do pulmão e miRNA em termos de equações diferenciais. O modelo baseia-se numa via de sinalização, que inclui o miR-9 e deixou-7. Simulações do modelo demonstram como as mutações que são detectados em NSCLC incluem a regulação positiva de miR-9 e regulação negativa de deixá-7. O modelo matemático poderia ser alargada através da inclusão de vias de sinalização adicionais, envolvendo especificamente let-7, que estão associados com câncer de pulmão. No entanto, um próximo passo importante nesta linha de investigação é determinar como a desregulamentação do miR-9 e deixá-7 podem contribuir conjuntamente para a progressão do câncer de pulmão e podem ser usados ​​como biomarcadores confiáveis. A fim de enfrentar este desafio matematicamente, será necessária investigação clínica adicional.

Métodos

Neste modelo, assumimos que o complexo EGF-EGFR é no estado estacionário e defini-lo como uma constante . Brown et ai. (2004) modelou EGFR sinalização com feedback negativo de ERK para SOS [32]. Nós simplificado algumas partes de seu modelo para obter as equações de SOS, Ras e ERK. Denotamos por, e as concentrações de SOS ativo, inativo SOS, SOS e total, respectivamente. Partindo do princípio de que o número total de SOS é conservada, temos (9)

denotar por a taxa de activação do SOS inactiva e pelo que a taxa de desactivação do SOS activa. Descrevendo essas conversões pela cinética de Michaelis-Menten, a equação para governar a concentração do SOS activo é dada por

Usando o facto de o complexo de EGF-EGFR activa SOS e ERK que reprime SOS activa, que substitua por e por, e temos Eq. (1). Da mesma forma, nós descrevemos as conversões entre Ras ativos e inativos e entre ERK ativos e inativos usando a cinética de Michaelis-Menten, e derivar Eqs. (2) e (3). Aqui, as taxas de activação catalítica de Ras e ERK são proporcionais ao SOS ativa e concentrações Ras ativos, respectivamente. Na Eq. (2), a repressão por deixar-7 da activação de Ras é descrita por um factor de inibição,. Na Eq. (4), a produção de MYC é proporcional à concentração de ERK activo. Na Eq. (5), a activação de miR-9 por MYC é descrito pela função de Hill quarta ordem, uma vez que MYC é um factor de transcrição e a activação de miR-9 pode envolver vários passos enzimáticos. Na Eq. (6), deixou-7 de produção é inibida por MYC. Na Eq. (7), a produção de E-caderina é proporcional à concentração deixou-7 e é inibida por miR-9. Ao longo Eqs. (4) – (7), a degradação das espécies é descrita por uma cinética de acção de massa lineares. Finalmente, na Eq. (8) MMP é produzido a uma taxa constante e é degradada pela E-caderina

.

Os parâmetros de NQA. (1) – (8) são derivados nas seguintes subseções. A maioria dos parâmetros são tomadas a partir de Brown et ai. (2004) [32]. Em seu modelo, eles tomaram as concentrações iniciais de todas as espécies de sinalização activa a ser zero, e as concentrações iniciais de todas as espécies de sinalização inativos ser exceto para MEK e ERK, cujas concentrações foram levados para ser. A concentração de complexo de EGF ao EGFR, Brown et al (2004) [32] supor que ela seja uma variável mas no nosso modelo, é constante. Esta constante é escolhida como a concentração de equilíbrio do complexo EGF-EGFR calculada usando seus parâmetros.

Computação de

Por denotar, e os números de moléculas de EGF, EGFR livre, e complexo de EGF-EGFR, e por taxas de ligação e os unbinding e para o complexo de EGF ao EGFR. Se é o número total de moléculas de EGFR, em seguida. Supondo que a ligação e desligamento de EGF e EGFR são equilibradas no estado de equilíbrio, nós havewhich dá (10)

De acordo com Brown et al. (2004) [32], e portanto. Nós determinará através da conversão em uma unidade de concentração. Lung o tamanho das células, no entanto, variar até fold diferenças [39]. Por conseguinte, utilizar um tamanho de célula “média”, levando-a a ser a célula HeLa

Uma vez que o EGF e EGFR estão localizados na superfície da célula, é necessário para calcular a área de superfície celular.; assume-se que as células têm forma esférica com raio. Para células HeLa, o volume total isaccording para Fujioka et ai. (2006) [40]. Por isso e a sua área de superfície é

A conversão do número de moléculas de em concentração na superfície da célula, nós calcular a concentração de estado estacionário de aswhere complexo de EGF ao EGFR é o número de Avogadro,; é a quantidade de uma substância que contém tantas entidades como os átomos que existem no de, e é a concentração molar (por litro),

Outros parâmetros na equação SOS

Let E denotam os números de moléculas SOS ativos e inativos. De acordo com Brown et al. (2004), (11) onde é P90Rsk uma S6-quinase p90 ribossomal que inactiva SOS, e é o número de moléculas activas P90Rsk [32]. Nesse papel, os parâmetros são dados como,,, e. Utilizando estes números, determinamos nossos parâmetros bywhere é o volume do citoplasma de uma célula HeLa. O número total de moléculas de P90Rsk activa foi considerada como sendo [32].