Abstract

Fundo

células epiteliais humanas transformando sequência 2 (ECT2) é um fator de troca de nucleotídeos guanina para GTPase família Rho, que tem foi implicado no fenótipo maligno de cancros humanos. Pouco se sabe sobre o efeito de um alto nível de ECT2 na regulação do comportamento de células de câncer oral. Neste estudo, nós investigamos o envolvimento de ECT2 no carcinoma de células escamosas oral (CCEO).

Metodologia /Principais Achados

Foram analisados ​​expressão ECT2 em linhas celulares CCEO derivados e carcinoma epidermóide estudados primários em comparação com tecido normal combinados (n = 96) por reacção quantitativa da polimerase-transcriptase reversa cadeia, transferência de Western, e imuno-histoquímica. Em seguida, avaliou a correlação entre o estado de expressão ECT2 no carcinoma epidermóide estudados primárias e as características clínico-patológicas. ECT2 expressão foi significativamente regulada para cima no carcinoma epidermóide estudados

in vitro

e

in vivo

(

p Art 0,05). Entre as variáveis ​​clínicas analisadas, maior expressão ECT2 também foi associado com a classificação estágio TNM (

p Art 0,05). Quando realizamos análises funcionais de ECT2 em células de CCEO derivados que utilizam o sistema shRNA, a proliferação celular das células ECT2 knockdown diminuiu significativamente em comparação com as células de controlo (

p Art 0,05). Análise do ciclo celular por citometria de fluxo mostrou paragem da progressão do ciclo celular na fase G1 nas células ECT2 knockdown. Também encontramos aumento da regulação da família Cip /Kip dos inibidores da quinase dependente da ciclina, p21

cip1 e p27

KIP1, e para baixo-regulação da ciclina D1, ciclina E, e CDK4. Estes dados sugerem que a Cip /Kip família inibição elevada induzida da ciclina D1 atividade complexa-CDK levando a interrupção do ciclo celular na fase G1.

Conclusões /Significado

Nossos resultados propostos para o primeira vez que ECT2 é um indicador da proliferação celular em carcinoma epidermóide estudados e que ECT2 pode ser um alvo terapêutico potencial para o desenvolvimento de novos tratamentos para epidermóide estudados

citação:. Iyoda H, Kasamatsu a, Ishigami t, Nakashima D, endo-Y Sakamoto, Ogawara K, et al. (2010) de células epiteliais Transformando Sequência 2 em Câncer Oral Humano. PLoS ONE 5 (11): e14082. doi: 10.1371 /journal.pone.0014082

editor: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemanha |

Recebido: 18 de junho de 2010; Aceito: 28 de outubro de 2010; Publicação: 29 de novembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Iyoda et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma Grant-in-Aid Pesquisa científica (No. 20.592.353) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células escamosas oral (CCEO) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo, sendo responsável por 275.000 novos casos e mais de 120.000 mortes por ano [1]. Muitos fatores de risco foram identificados, incluindo o uso do tabaco e do álcool [2], [3], [4]. No entanto, alguns pacientes desenvolvem CEB sem factores de risco, sugerindo que a susceptibilidade do hospedeiro desempenha um papel importante. alterações moleculares em vários oncogenes e genes supressores de tumores associados com o desenvolvimento de CCEO poderia ser pistas importantes para prevenir esta doença [4], [5].

A tecnologia de microarray tem sido útil para analisar mudanças em milhares de genes e identificar padrões significativos. Nós relatado anteriormente perfis de CCEO expressão genética para identificar genes relacionados com o cancro [6]. Entre os genes, transformação de células epiteliais sequência 2 (ECT2) foi significativamente regulada para cima no CEB. ECT2 é um fator de troca de nucleotídeos guanina (GEF) para GTPase família Rho relacionada à citocinese [7], [8], [9], [10], [11]. GEFs catalisar a troca de GDP por GTP, ativando assim as Rho GTPases na transdução de sinal. ECT2 expressão é controlada dinamicamente ao longo do ciclo celular. Após a ruptura do envelope nuclear durante a mitose, ECT2 é dispersa por todo o citoplasma, então torna-se localizada ECT2 para os fusos mitóticos durante a metafase, o sulco de clivagem durante telofase, e o meio do corpo no fim da citocinese [8]. As GTPases Rho têm sido implicadas no fenótipo maligno de cancros humanos como um resultado da sua participação na sinalização aberrantes em células tumorais [12], [13], [14], [15], [16], [17].

no estudo atual, ECT2 era frequentemente sobre-expresso em linhas celulares CCEO derivados e carcinoma epidermóide estudados primários. Além disso, uma experiência de shRNA demonstrou que a sub-regulação ECT2 resultou numa diminuição da proliferação celular por paragem do ciclo celular da fase G1. Portanto, sugerimos que ECT2 pode ser um biomarcador da proliferação e alvo terapêutico potencial para o carcinoma epidermóide estudados.

Resultados

Avaliação do

ECT2

expressão de mRNA em linhas celulares CCEO derivados

Para investigar a expressão do mRNA de

ECT2

identificado como um gene relacionado ao câncer pela nossa análise microarray análise [6], foi realizada quantitativa transcriptase reversa PCR (qRT-PCR) usando células de seis CCEO-derivado linhas (HSC-2, HSC-3, HSC-4, H1, Ca9-22 e SA3) e queratinócitos orais normais humanos (HNOKs). Os níveis de expressão de ARNm foram normalizados para GAPDH.

ECT2

mRNA foi significativamente sobre-regulada em todas as linhas de células de CCEO em comparação com os HNOKs (Figura 1A, *

p Art 0,05).

(A) Quantificação de

ECT2

níveis de mRNA em linhas celulares CCEO derivados por análise de qRT-PCR. Para determinar a expressão do mRNA de

ECT2

no câncer oral, foi realizada análise de qRT-PCR utilizando seis linhas celulares CCEO derivados (HSC-2, HSC-3, HSC-4, H1, Ca9-22 e SA3 ) e HNOKs. Significativo aumento da regulação do

ECT2

mRNA é visto em seis linhas celulares CCEO derivados em comparação com os do HNOKs. Os dados estão expressos como médias ± SEM de valores a partir de três ensaios (*

P

0,05, teste de Mann-Whitney

L

teste). (B) Análise de transferência de Western de proteína ECT2 nas linhas celulares derivadas de CEB e HNOKs. Para investigar a expressão da proteína de ECT2 no câncer oral, foi realizada a análise Western blot utilizando seis linhas CEB-derivados de células (HSC-2, HSC-3, HSC-4, H1, Ca9-22 e SA3) e HNOKs. a expressão da proteína ECT2 é sobre-regulada em linhas celulares derivadas de CEB-comparado com HNOKs. dados de proteínas ECT2 densitométricos são normalizados para os níveis de proteína-tubulina a. Os valores são expressos como uma percentagem dos HNOKs.

linhas celulares de Avaliação da expressão da proteína ECT2 em CCEO derivados

Foram realizadas análises de Western blot para investigar status de expressão da proteína ECT2 na CEB-linhas celulares derivadas e os HNOKs (Figura 1B). O peso molecular do ECT2 foi de 112 kDa. Um aumento significativo na expressão da proteína ECT2 foi observada em todas as linhas celulares CEs em comparação com as HNOKs. A análise da expressão indicam que ambos os produtos de transcrição e tradução dessa molécula foram altamente expresso em linhas celulares CCEO derivados.

Avaliação da expressão ECT2 no carcinoma epidermóide estudados primários

Nós medimos a

ECT2

os níveis de expressão de mRNA em epidermóide estudados primários e tecidos orais normais emparelhados a partir de 96 pacientes. Similar aos dados a partir das linhas de células derivadas de CEB, análise de qRT-PCR mostrou que

ECT2

expressão de ARNm foi regulada em 75 (78%) de 96 epidermóide estudados primários em comparação com os tecidos orais normais correspondentes. Os níveis de expressão de ARNm relativa nos tecidos orais e epidermóide estudados primárias normais variou 0,003-1,632 (mediana, 0,081) e 0,005-4,39 (mediana, 0,289), respectivamente (Figura 2,

P

0,05).

Para investigar o

ECT2

níveis de expressão de mRNA em carcinoma epidermóide estudados primários e tecidos orais normais emparelhados de 96 pacientes, foi realizada análise de qRT-PCR. Os níveis de expressão de ARNm relativos em epidermóide estudados primários e os tecidos orais combinados (n = 96) Intervalo de 0,005-4,39 (mediana, 0,289) e 0,003-1,632 (mediana, 0,081), respectivamente.

ECT2

expressão de mRNA foi regulado para cima em 75 (78%) de 96 epidermóide estudados primária em comparação com os tecidos orais normais correspondentes. Significativamente maior do

ECT2

expressão de mRNA foi observada em carcinoma epidermóide estudados primárias de tecidos orais normais correspondentes (

P Art 0,05; Mann-Whitney

U

teste).

Em seguida, analisamos ECT2 expressão da proteína por imuno-histoquímica (IHQ). Resultados representativos para IHC ECT2 proteína no tecido oral normal e CEB primário estão apresentados na Figura 3A e B. imunorreacção positiva para ECT2 foi detectado no núcleo e no citoplasma. immunoreactions ECT2 fortes foram detectados em carcinoma epidermóide estudados, enquanto que tecidos orais normais mostrou imunomarcação negativa. As pontuações ECT2 IHC de tecidos e epidermóide estudados orais normais variou 8,33-85,33 (mediana, 44,00) e 55,67-211,33 (mediana, 163.33), respectivamente. As pontuações ECT2 IHC em carcinoma epidermóide estudados primários foram significativamente maiores do que aqueles em tecidos normais (Figura 3C,

p Art 0,001). As correlações entre as características clinicopatológicas dos pacientes com CEB e o estado da expressão da proteína ECT2 utilizando o sistema de pontuação IHC estão apresentados na Tabela 1. Entre as classificações clínicas, carcinoma epidermóide estudados ECT2-positivos foram correlacionados com o tamanho do tumor (

p

= 0,043) e estadiamento TNM da CEB (

p

= 0,044) (Tabela 1).

(A, B) Os resultados representativos IHC de ECT2 no tecido oral normal e CCEO primário. (A) tecido oral normal não tem a expressão da proteína ECT2. ampliação original, × 100. As barras de escala, 50 | im. (B) casos ECT2 positivo de CEO. imunorreacção positiva para ECT2 é detectado no núcleo e no citoplasma. ampliação original, × 400. As barras de escala, 10 | im. (C) Estado da expressão da proteína ECT2 no tecido oral nomal e CCEO primário. Para investigar a expressão da proteína de ECT2 no carcinoma epidermóide estudados primários, realizamos IHC. As pontuações ECT2 IHC são calculados como se segue: Pontuação IHC = 1 × (número de células fracos coradas no campo) + 2 x (Número de células moderadamente coradas no campo) + 3 × (número de células intensamente coradas no campo) . As pontuações ECT2 IHC para carcinoma epidermóide estudados e tecidos orais normais variam de 55,67-211,33 (mediana, 163.33) e 8,33-85,33 (mediana, 44.00), respectivamente. O nível de expressão da proteína ECT2 no carcinoma epidermóide estudados é significativamente maior do que em tecidos orais normais (

p Art 0,001; Mann-Whitney

U

teste).

Estabelecimento de ECT2 células

Para obter transfectantes ECT2 estável knockdown knockdown, foi utilizado o plasmídeo ECT2 shRNA (shECT2) eo shRNA (Mock) plasmídeo controle. Para avaliar ECT2 ARNm e a expressão da proteína em células shECT2-transfectadas, foi realizada qRT-PCR e análise de Western blot. A Figura 4A mostra que o

ECT2

expressão de ARNm em células shECT2-transfectadas foi significativamente menor do que em células transfectadas por simulação. os níveis de proteína em células ECT2 shECT2-transfectadas também diminuiu acentuadamente em comparação com células falsamente transfectadas (Figura 4B). Os níveis de expressão de proteína ECT2 eram consistentes com a expressão de ARNm nos transfectantes.

Para obter transfectantes estáveis ​​ECT2 knockdown, foi realizada a transfecção do ECT2 shRNA (shECT2) e o controlo shRNA (Mock) em linhas celulares de CEs (Sa3 e H1). Foi realizada qRT-PCR e análises de Western blot para investigar mRNA ECT2 e expressão de proteínas em células shECT2-transfectadas. (A) A expressão de

ECT2

mRNA em shECT2- e células SA3 Mock-transf. (B) Análise de transferência de Western de proteína ECT2 em shECT2- e células pseudo-transfectadas. O ARNm e proteínas ECT2 são significativamente sub-regulada em células shECT2-transfectadas.

Redução do crescimento celular em células ECT2 knockdown

Para investigar os efeitos antiproliferativos em células shECT2-transfectadas, celular O crescimento foi monitorizado durante 7 dias. As células shECT2-transfectadas mostraram uma diminuição significativa no crescimento celular em comparação com células falsamente transfectadas (Figura 5).

Para determinar o efeito de shECT2 sobre a proliferação celular, e shECT2- células pseudo-transfectadas foram semeadas em placas de seis bem placas a uma densidade de 1 × 10

4 células viáveis ​​por poço. shECT2- e células pseudo-transfectadas contadas em 7 dias consecutivos. O crescimento das células transfectadas shECT2 é significativamente inibido em comparação com as células pseudo-transfectadas 7 dias depois. Os resultados são expressos como a média ± SEM de valores a partir de três ensaios. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre as células Mock- e shECT2-transfectadas (

p Art 0,01; Mann-Whitney

U

teste).

Knockdown de ECT2 promove detenção do ciclo celular

para investigar o mecanismo pelo qual ECT2 está relacionado com a progressão do ciclo celular, foi realizada a análise de FACS de células shECT2-transfectadas. A percentagem da fase G1 em células shECT2-transfectadas foi significativamente mais elevado do que em células pseudo-transfectadas (Figura 6A,

P

0,05), sugerindo que a sub-regulação da proliferação celular ECT2 inibida pela indução de G1 prender. Para identificar o mecanismo pelo qual ECT2 blocos progressão G1, foram avaliados o nível de expressão de inibidores da quinase dependente da ciclina (p16

INK4A, p21

cip1, p27

KIP1), ciclina D1, ciclina E, e CDK4 (Figura 6B). Os dados de PCR mostrou-regulação da

p21

cip1

e

p27

KIP1

e para baixo-regulação da

ciclina D1

,

ciclina E

,

e CDK4 em células

shECT2-transfectadas.

Para investigar a progressão do ciclo celular, foram analisadas por citometria de fluxo de determinação de conteúdo de ADN por um FACScalibur na G0-G1, S, e, G2-M fases. Em seguida, determinou o nível de expressão de inibidores de quinase dependentes de ciclina (p16

INK4A, p21

CIP1, e p27

KIP1), ciclina D1, ciclina E e CDK4 para identificar o mecanismo pelo qual os blocos ECT2 G1 progressão. A análise por citometria de (A) de fluxo foi realizada para investigar ciclo celular em shECT2- e células pseudo-transfectadas. O número de células em G1 aumentou marcadamente nas células ECT2 knockdown. (B) de qRT-PCR foi realizada para investigar os níveis de mRNA de genes relacionados com o ciclo celular. PCR mostra-regulação da

p21

cip1

e

p27

KIP1

e para baixo-regulação da

ciclina D1

,

ciclina E

,

e CDK4

. Os dados estão expressos como médias ± SEM de valores a partir de três ensaios (*

P

0,05, teste de Mann-Whitney

L

teste).

Discussão

Os nossos dados de microarranjos anteriores [6] mostrou significativo aumento da regulação do

ECT2

em linhas celulares CCEO derivados. No presente estudo, ECT2 mRNA e proteína foram altamente expresso

in vitro

e

in vivo

em CCEO. número Regional cópia do 3q26 aumentos em vários tipos de câncer, como de cabeça e pescoço, pulmão e colo do útero [18], [19]. Esta região tem genes relacionados com o cancro (PRKC1 e SOX2), bem como ECT2. Portanto, desequilíbrio genômica seria a razão de ECT2 superexpressão em CCEO. Os níveis de expressão de proteína em ECT2 epidermóide estudados primários foram correlacionados com a classificação TNM fase (Tabela 1) (

P

0,05). Estes resultados sugeriram que ECT2 tem um papel importante no desenvolvimento e progressão CEB. No entanto, pouco se sabe sobre o mecanismo de ECT2 na progressão CEB. Para determinar se a função ECT2 é relevante para a progressão CEB, foi realizada a experiência shECT2 e verificaram que a proliferação celular diminuiu significativamente como resultado da paragem do ciclo celular na fase G1 em células ECT2 knockdown com a sobre-regulação de p21

cip1 e p27

KIP1 e para baixo-regulação da ciclina D1, ciclina e, e CDK4, indicando que ECT2 função está relacionada intimamente à progressão CCEO.

GEFs, incluindo ECT2, catalisar a troca de GDP por GTP, ativando as Rho GTPases em transdução de sinal [7], [8], [9], [10], [11]. Activado GTPases Rho ligar-se e activar vários efectores a jusante, levando a vários processos biológicos, tais como o tamanho celular, progressão do ciclo celular, a apoptose, a sobrevivência, a morfologia, a polaridade celular, adesão celular, e o tráfico de membrana [20], [21]. Up-regulação da atividade GTPase Rho, frequentemente associados com tumorigênese [22], foi detectado em vários tumores humanos, incluindo câncer pancreático, câncer de mama, melanoma, cancro do pulmão, cancro colo-rectal e cancro gástrico [12], [23]. Por outro lado, GTPases Rho desempenhar um papel importante na promoção da progressão G1-S por meio da modulação de ciclina e inibidores de quinase dependentes de ciclina (CDKIs) [24], [25]. Yamamoto et al. relataram que, quando Rho GTPase foi inibida pela

Clostridium botulinum

C3 toxina ou um mutante negativo dominante, a progressão do ciclo celular G1-S foi significativamente prejudicada [26]. A activação diminuída de GTPases está associada com níveis constitutivamente elevados de p21

cip1 e p27

KIP1, fazendo com que as células se acumule na fase G1 [27], [28], [29], [30], [31 ], [32]. Especulamos que ECT2 leva à ativação prejudicada de Rho GTPase knockdown, e consistente com isso, encontramos não só sobre-regulação da família Cip /Kip (p21

cip1 e p27

KIP1), mas também a infra-regulação da ciclina D1, ciclina e, CDK4 e, levando à paragem do ciclo celular na fase G1, na ECT2 células knockdown.

ciclina D1, ciclina e, CDK4 e são também um regulador crítico de progressão G1 e G1-S transição. A inibição da ciclina D1, ciclina E, CDK4 e bloqueia a expressão G1-S transição no ciclo celular [33], [34], [35], [36]. famílias E ciclinas D1-D3 e e seus respectivos parceiros quinase, CDK4 /6 e CDK2, são responsáveis ​​por regular a transição de G1 para a fase S. As atividades dos complexos ciclina-CDK são modulados por dois tipos de CDKIs, Cip /Kip (p21

Cip1, p27

KIP1 e p57

Kip2) eo INK4 (p15

INK4B, p16

INK4A, p18

INK4C e p19

INK4D) famílias, tanto dos que regulam a progressão do ciclo celular [37]. Os membros do ligamento família Cip /Kip para complexos ciclina-CDK e inibir suas atividades, o que leva a uma redução da proteína do retinoblastoma fosforilada e interrupção do ciclo celular G1.

Em conclusão, nossos resultados indicaram que ECT2 é overexpressed frequentemente em CCEO . Além disso, ECT2 knockdown inibiu a proliferação celular

In vitro

prendendo a progressão do ciclo celular na fase G1 por modulação da expressão de moléculas relacionadas com o ciclo celular, que em última análise conduz à inibição da actividade do complexo de ciclina D1-CDK. Estes dados sugerem que ECT2 desempenha um papel importante na proliferação de células CEB. expressão ECT2 é provável que seja um biomarcador da proliferação e um potencial alvo terapêutico para o desenvolvimento de drogas anticâncer em carcinoma epidermóide estudados primários.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todos os pacientes forneceram consentimento informado para um protocolo revisto e aprovado pelo conselho de revisão institucional da Universidade de Chiba. Os consentimentos informados por escrito foram obtidas de todos os pacientes.

linhas celulares derivadas do CCEO e amostras de tecido

linhas de células HSC-2, HSC-3, HSC-4 e Ca9-22, derivado epidermóide estudados a partir de humanos, foram adquiridos a partir da pesquisa da ciência Banco de Recursos humanos (Osaka, Japão). linhas celulares H1 e SA3 foram gentilmente cedidas pelo Dr. S. Fujita em Wakayama University Medical (Wakayama, Japão). HNOKs de cultura principal foram obtidos a partir de três dadores saudáveis ​​[38], [39]. Todas as células foram cultivadas em meio de Eagle modificado /F-12 de HAM de Dulbecco (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Sigma) e 50 unidades /ml de penicilina e de estreptomicina (Sigma).

as amostras de tecido de 96 pacientes japoneses não relacionados com CCEO primária que foram tratados no Hospital Universitário Chiba foram obtidos durante a ressecção cirúrgica. Os tecidos ressecados foram divididas em duas partes, uma das quais foi imediatamente congelado e armazenado a -80 ° C até o isolamento de ARN, e a segunda das quais foi fixado em formol tamponado a 10% para diagnóstico patológico e IHC. A análise histopatológica dos tecidos foi realizado de acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde do Departamento de Patologia do Hospital Universitário Chiba. estadiamento clínico-patológico foi determinado pela classificação TNM da União Internacional contra o Câncer. Todos os pacientes tinham CEB que foi confirmado histologicamente, e amostras do tumor foram verificadas para garantir que o tecido do tumor estava presente em mais de 90% da amostra.

Preparação de ADNc

O ARN total foi isolado utilizando Reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. cDNA foi gerado a partir de 5 ug de RNA total usando Ready-To-Go You-primeiro-Primeira-Strand Beads (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) e oligo (dT) (Sigma Genosys, Ishikari, Japão), de acordo com as instruções do fabricante .

expressão de mRNA análise

em tempo real qRT-PCR foi realizada para avaliar os níveis de expressão de genes-alvo (

ECT2

,

p16

INK4A

,

p21

cip1

,

p27

KIP1

,

ciclina D1

,

ciclina e

, e

CDK4

) em células derivadas de CEs e carcinoma epidermóide estudados primários. qRT-PCR foi realizada com um método que utiliza um LightCycler FastStart DNA mestre SYBR Green 1 Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). Foram utilizados os seguintes iniciadores: ECT2, directo 5′-ATTTTCATGTCGCCCGTTGT-3 ‘e inverso 5′-CCCATGTGATGGACCAATGTC-3’; p16

INK4A, frente 5′-CAGACATCCCCGATTGAAAGAAC-3 ‘e reverso 5′-GGTAGTGGGGGAAGGCATATATCT-3’; p21

cip1, frente 5′-CCCAGTTCATTGCACTTTGATTAGC-3’and reversa 5′- CAGTCTAGGTGGAGAAACGGGAAC-3 ‘; p27

KIP1, frente 5′-CCGGCTAACTCTGAGGACAC-3’and reversa 5′- AGAAGAATCGTCGGTTGCAG-3 ‘; ciclina D1, frente 5′-GCATGTTCGTGGCCTCTAAGA-3’and reversa 5’- CGGTGTAGATGCACAGCTTCTC-3 ‘; ciclina E, frente 5′-TTCTTGAGCAACACCCTCTTCTGCAGCC-3’and reversa 5’- TCGCCATATACCGGTCAAAGAAATCTTGTGCC-3 ‘; CDK4, frente 5′-TGCAACACCTGTGGACATGTG-3’and reversa 5’- ATTTTGCCCAACTGGTCGG-3 ‘. Os produtos amplificados foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose a 3% para verificar o tamanho e pureza. As reacções de PCR utilizando o aparelho LightCycler foi realizada num volume final de 20 ul de uma mistura reaccional que consiste em 2 ul de FirstStart ADN mestre SYBR Green I misturar, MgCl 3 mM de

2, e L uM de iniciadores, de acordo com a as instruções do fabricante. A mistura reaccional foi carregada em tubos capilares de vidro e submetidos a uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 45 ciclos de amplificação a 95 ° C (10 s) para a desnaturação, 62 ° C (10 s) para o recozimento, e 72 ° C (10 s) para a extensão, com uma inclinação temperatura de 20 ° C /seg. As quantidades de transcrição para os genes alvo foram estimados a partir das respectivas curvas padrão e normalizados para a desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) (directo 5′-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3’and reverso 5′-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 ‘) quantidade determinada de transcrição amostras correspondentes.

Proteína extracção

As células foram lavadas duas vezes com solução salina fria tamponada com fosfato (PBS) e centrifuga-se brevemente. Os sedimentos de células foram incubadas a 4 ° C durante 30 minutos num tampão de lise (ureia 7 M, 2 M tioureia, 4% w /v de CHAPS, e 10 mM de Tris pH 7,4) com o cocktail inibidor de proteinase (Roche). A concentração de proteína foi medida com o kit BCA Protein Assay (Thermo, Rockford, IL).

análise Western blot

Os extractos de proteína foram sujeitos a electroforese em gel de 4-12% Bis-Tris, transferidos para nitrocelulose membranas (Invitrogen), e bloqueadas durante 1 h à temperatura ambiente no bloqueio Um (Nacalai Tesque, Quioto, Japão). As membranas foram lavadas três vezes com 0,1% de Tween 20 em solução salina tamponada com Tris e incubou-se com 2 ug /ml de anticorpo de coelho purificado por afinidade anti-humano policlonal ECT2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante a noite a 4 ° C. As membranas foram lavadas novamente e incubadas com um 1:10,000 de IgG anti-coelho de cabra (H + L) conjugado com HRP (Promega, Madison, WI) como um anticorpo secundário durante 2 h a temperatura ambiente. Finalmente, as membranas foram detectados utilizando substrato quimioluminescente SuperSignal West Pico (Thermo) e imunotransferência foi visualizado por exposição das membranas a ATTO claro Captura II (ATTO, Tóquio, Japão). intensidades de sinal foram quantificadas utilizando o software versão 3.0 CS Analyzer (ATTO).

A transfecção

linhas celulares CCEO (SA3 e H1) foram estavelmente transfectadas com o ECT2 shRNA (shECT2) ou o controle shRNA (Mock) (Santa Cruz Biotechnology) construir por Lipofectamine LTX e Plus Reagentes (Invitrogen). Após a transfecção, as células estavelmente shECT2 foram isolados por meio de cultura contendo 2 ug /mL de puromicina (Invitrogen). 2-3 semanas após a transfecção, as colónias viáveis ​​foram colhidos e transferido para novos pratos. shECT2- e as células transfectadas por simulação foram utilizados para novas experiências.

IHC

IHC de secções 4 mícrons de espécimes embebidos em parafina foi realizada utilizando anticorpo de coelho anti-ECT2 policlonal (Santa Cruz Biotechnology ). Resumidamente, após desparafinização e hidratação, a actividade de peroxidase endógena foi extinta por 30 minutos de incubação numa mistura de 0,3% de solução de peróxido de hidrogénio em metanol a 100%, após o que as secções foram bloqueadas durante 2 h a temperatura ambiente com 1,5% de bloqueio de soro ( Santa Cruz Biotechnology) em PBS antes da reacção com o anticorpo anti-ECT2 (1:100 diluição) a 4 ° C numa câmara húmida durante a noite. Após a incubação com o anticorpo primário, as amostras foram lavadas três vezes em PBS e tratou-se com reagente de Envision (DAKO, Carpinteria, CA) seguido por desenvolvimento de cor em tetracloridrato de 3,3′-diaminobenzidina (DAKO). Os slides, em seguida, foram ligeiramente contrastadas com hematoxilina, desidratadas com etanol, limpas com xileno, e montadas. A ligação não específica de um anticorpo para outras proteínas do que o antigénio às vezes ocorreu. Para evitar a ligação não-específica, foi realizado um péptido de bloqueio imunizantes experimento. Como controlo negativo, as secções foram imunocoradas em triplicado sem exposição a anticorpos primários, o que confirmou a especificidade da coloração. Para quantificar o estado de expressão da proteína ECT2 nesses componentes, utilizou-se sistemas de pontuação IHC descrito anteriormente [6], [39], [40], [41], [42], [43], [44], [45] , [46], [47]. Resumidamente, as células coradas foram determinados em pelo menos cinco campos aleatórios a 400 x de ampliação em cada secção. A intensidade da imunorreacção ECT2 na célula foi pontuado como se segue: 1 +, fraco; 2+, moderada; e 3+, intenso. O número de células e a intensidade da coloração foi então multiplicado para produzir uma pontuação ECT2 IHC. Casos com uma pontuação superior a 85,33 (a maior pontuação para o tecido normal) foram definidos como ECT2-positivo. Dois patologistas independentes, ambos os quais foram mascarados para o estado clínico dos pacientes, fez esses julgamentos.

A proliferação celular

Para investigar o efeito da shECT2 sobre a proliferação celular, shECT2- e Mock-transf As células foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 1 × 10

4 células viáveis ​​por poço. Nos pontos de tempo indicados, as células foram tripsinizadas e contadas utilizando um hemocitómetro em triplicado.

ciclo celular análise

Para determinar a distribuição do ciclo celular, as células foram colhidas, lavadas com PBS, e sondados Além disso, com CycleTEST kit de reagente de ADN (Becton-Dickinson, San Jose, CA), de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células concentradas a 5,0 × 10

5 células /ml foram centrifugadas a 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, adicionados 250 uL de solução A (tampão de tripsina) ao tubo e suavemente misturada. Deixou-se a tripsina-se reagir durante 10 min à temperatura ambiente. A seguir, adicionou-se 200 ul de solução B (inibidor de tripsina e RNase num tampão) e misturar suavemente. Nós incubadas com a mistura durante 10 min à temperatura ambiente. Finalmente, adicionou-se 200 ul de solução C (solução corante iodeto de propídio). E suavemente misturado como acima e incubar durante 10 min no escuro em gelo. Determinação por citometria de fluxo do teor de ADN foi analisado por um FACScalibur (Becton-Dickinson). As fracções das células na fase G0-G1, S e G2-M fases foram analisados ​​utilizando o software de fluxo Jo (ár, Ashland, OR).

A análise estatística

A significância estatística dos níveis de expressão ECT2 foi avaliada por meio do teste exato de Fisher ou Mann-Whitney

U

teste.

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os dados são expressos como a média ± SEM.

Reconhecimentos

Agradecemos Lynda C. Charters para a edição deste manuscrito, e os Drs. Hiroshi Nakajima e Hiroaki Takatori, do Departamento de Genética Molecular, Faculdade de Medicina da Universidade de Chiba, para discussões úteis e revisão crítica do manuscrito.