Abstract

Fundo

As toxicidades dose-dependentes da doxorrubicina (DOX) limitam suas aplicações clínicas, particularmente em cancros resistentes a fármacos, tais como o cancro do fígado. Neste estudo, nós investigamos o papel da quercetina sobre os efeitos antitumorais de DOX em células de câncer de fígado e sua capacidade de fornecer proteção contra danos no fígado DOX-mediada em camundongos.

Metodologia e Resultados

o ensaio de coloração MTT e anexina V /PI demonstrado que a quercetina sensibilizados selectivamente citotoxicidade induzida pela DOX contra células de câncer de fígado ao mesmo tempo proteger as células normais do fígado. O aumento em apoptose DOX-mediada em células de hepatoma por quercetina foi p53-dependente e ocorreu por regular negativamente a expressão de Bcl-XL. Z-VAD-fmk (inibidor da caspase), pifithrin-α (inibidor de p53), ou sobre-expressa Bcl-XL diminuiu os efeitos da quercetina sobre a apoptose mediada por DOX. O tratamento combinado de quercetina e DOX reduziu significativamente o crescimento de xenoenxertos de cancro do fígado em ratos. Além disso, a quercetina diminuiu os níveis séricos de alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase que foram aumentados em ratinhos tratados com DOX. A quercetina também reverteu as alterações patológicas induzidas DOX em ratos fígados.

Conclusão e Significado

Estes resultados indicam que a quercetina potencializou os efeitos antitumorais de DOX em células de câncer de fígado ao mesmo tempo proteger as células normais do fígado. Por conseguinte, o desenvolvimento de quercetina pode ser benéfica num tratamento combinado com DOX para aumentar a eficácia terapêutica contra o cancro do fígado

citação:. Wang L, Zhang J, Liu G, Sharma S, Dong Q (2012) A quercetina Potencializa doxorrubicina mediada efeitos antitumorais contra o cancro do fígado através de p53 /Bcl-xl. PLoS ONE 7 (12): e51764. doi: 10.1371 /journal.pone.0051764

editor: Ashraf B. Abdel-Naim, Universidade Ain Shams, Egipto

Recebido: 25 de julho de 2012; Aceito: 07 de novembro de 2012; Publicação: 11 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (no .: 30400521), o Departamento de Ciência, Tecnologia da Província de Zhejiang (no .: 2012R10047 para QD e no .: 2012C33116 a GW) e do Departamento de Educação da Província de Zhejiang (no .: Y201224108). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o carcinoma hepatocelular (HCC) é um dos tipos mais comuns de câncer de fígado e a quarta principal causa de mortes por câncer em todo o mundo [1]. A falta de biomarcadores que detectam fase precoce cirurgicamente operável de uma doença provocou a manifestação de estágios avançados na maioria dos pacientes quando a ressecção cirúrgica não é viável [2]. Portanto, a quimioterapia continua a ser a opção viável para o tratamento de pacientes de CHC inoperáveis.

Ao longo dos anos, a doxorrubicina (DOX) tornou-se um agente de rotina e amplamente utilizados no tratamento de HCC. No entanto, estudos têm demonstrado que algumas células cancerosas, incluindo hepatoma, são resistentes aos efeitos apoptóticos de DOX [3]. Além disso, a quimioterapia baseada-DOX está associada com efeitos secundários graves em tecidos não-tumorais, tais como o coração, fígado e rim, o que limita fortemente as suas aplicações clínicas [4], [5]. Benjamin descrito oito pacientes com insuficiência hepática que desenvolveram graves pancitopenia e mucosite durante a recepção de DOX, levando especialistas para reduzir a dosagem por causa da função hepática alterada [6]. Assim, são necessários melhoradas regimes terapêuticos que potenciem os efeitos de DOX, que permitem a redução da dose e protecção dos tecidos não tumorais, para melhorar o tratamento de pacientes com cancro do fígado.

Os mecanismos de citotoxicidade mediada por DOX em células cancerosas e tecidos normais são diferentes [7]. DOX toxicidade em células cancerosas ocorre principalmente por meio de intercalação de ADN e danos [8], ao passo que a cardiotoxicidade ou hepatotoxicidade induzida por DOX ocorre principalmente através da geração de radicais livres de oxigénio, que é inibida por depuradores de radicais livres [9]. Esta diferença na toxicidade mediada por DOX em células cancerosas e normais pode ser investigado para melhorar os efeitos antitumorais de DOX com abordagens combinatórias que permitem a redução da dose de DOX protegendo ao mesmo tempo as células normais.

A quercetina (3, 3 ‘, 4 ‘, 5, 7-pentahydroxyflavone), um importante da dieta presente flavonóide em diversas frutas e legumes, antioxidante exposições, anti-inflamatórios e propriedades anticancerígenas [10]. A quercetina tem recebido crescente atenção como um flavonóide pró-apoptótica com atividade específica e quase exclusiva sobre as células tumorais, em vez de células normais, não transformadas [11], [12]. No entanto, os mecanismos através dos quais a quercetina exerce as suas actividades anti-proliferativas e apoptóticos permanecem obscuros. Vários

in vitro

e

in vivo

estudos avaliaram a quercetina combinado com DOX para câncer de mama e tratamentos de leucemia, revelando efeitos sinérgicos [13] – [15]. Em modelos de cancro da mama de murídeo, uma combinação de quercetina dietética e injecção intratumoral de DOX reduz o volume do tumor e espalhamento metastático [13]. Embora quercetina inverte multirresistência induzida DOX em células de leucemia mielóide humanos [14], [16], não há estudos sobre a eficácia da quercetina com DOX contra o câncer de fígado ainda não foram relatados.

Os antioxidantes têm efeitos benéficos contra DOX toxicidade induzida em ratinhos e ratos [17]. A quercetina tem um efeito protetor contra a cardiotoxicidade induzida pela DOX em camundongos, mas os mecanismos ainda não estão claros [18]. A quercetina também apresenta um efeito protetor contra danos no fígado mediada por AFB1

in vivo

através da promoção de sistemas de defesa antioxidante e inibindo a peroxidação lipídica [19]. Além disso, a quercetina reduz o teor de citocromo P450 hepática e aumenta a actividade hepática de glutationa-S-transferase (GST) que participam na activação /desintoxicação de mutagéneos químicos /cancerígenos [20] – [22]. Estes resultados sugerem que a quercetina pode fornecer proteção contra danos no fígado DOX-mediada.

O presente estudo tem como objetivo avaliar os efeitos da combinação de DOX agente quimioterápico com a quercetina composto natural sobre o câncer de fígado humano e as células normais. A função potencial de quercetina como um agente de protecção hepática durante o tratamento DOX em ratos também foi examinada.

Os nossos resultados demonstram que a apoptose mediada por DOX-quercetina aumentada em células de hepatoma é dependente de p53 ocorre e pela regulação negativa Bcl XL. Além disso, a quercetina apresenta um efeito protetor contra a hepatotoxicidade induzida por DOX em camundongos.

Resultados

A quercetina potencializam seletivamente DOX citotoxicidade nas células do câncer de fígado, mas não em células normais do fígado

Culturas foram expostas a quercetina em doses de 0 a 150? M? M para determinar os efeitos da quercetina sobre células de cancro do fígado e células normais. Dimetilsulf óxido (DMSO; 0,1%) foi utilizado como controlo negativo. Após 48 h, uma redução dependente da dose na viabilidade de células de cancro (IC

50 células SMMC7721 valor = 133 ^ m e células QGY7701 = 142 uM) foi observada (Fig. 1A). A quercetina não afectam o crescimento normal das células do fígado (L02), mesmo em concentrações elevadas ( 100? M). Considerando-se que 12? M de concentração sérica quercetina não induziu quaisquer efeitos secundários associados em seres humanos e sua citotoxicidade em várias linhas celulares de cancro [23], [24], foram selecionados 20 mM de quercetina para estudos de combinação de drogas. A quercetina (20 pM) aumentou a morte de células de cancro do fígado induzida por DOX e reduziu o IC

50 valor de DOX contra células de hepatoma SMMC7721 (5.1 uM a 2,2 uM; Fig. 1B) e QGY7701 células (6,2 uM a 2,7 uM; Fig . 1C). Em contraste, o pré-tratamento com 20 uM de quercetina reduziu a citotoxicidade mediada por DOX em fígado normal de células L02 (Fig. 1D). No plasma humano, o pico e a concentração em estado estacionário de DOX são 5 | iM e 25 nM a 500 nM, respectivamente [25]; Assim, foram selecionados 1 pM de DOX para os estudos de combinação de drogas para representar os níveis plasmáticos relevantes em pacientes tratados com DOX. Anexina V coloração /PI foi realizada para investigar se ou não-DOX induzida morte celular em células de hepatoma ocorre por meio de apoptose. tratamento DOX (1 uM) induziu apoptose em 13% das células SMMC7721; o co-tratamento com quercetina aumentou a percentagem de células apoptóticas a 42% (Fig. 1E). A percentagem de apoptose induzida por DOX sozinha ou co-tratamento com quercetina nas células L02 foram de aproximadamente 22% e 18%, respectivamente, sugerindo que a quercetina não sensibilizar as células normais do fígado para a apoptose induzida por DOX. Resultados semelhantes foram confirmadas por coloração Hoechst (dados não mostrados). Estes resultados sugerem um efeito de potenciação preferencial da quercetina sobre a citotoxicidade mediada por DOX em células de cancro do fígado, mas não em células normais do fígado.

(A) Efeito da quercetina sobre a proliferação de SMMC7721 e QGY7701 células do cancro do fígado, e células de fígado normais L02. As células foram incubadas com quercetina (0 uM a 150 uM) durante 48 h e submetida a um ensaio de MTT para determinar a taxa de proliferação. (B) A quercetina SMMC7721 sensibilizados células de DOX. (C) A quercetina QGY7701 sensibilizados células de DOX. (D) A quercetina reduziu parcialmente a inibição do crescimento induzida por DOX em células L02. As células foram incubadas com DOX (1? M) e /ou quercetina (20 pM) (B, C, e D) durante 24 h, e, em seguida, submetido a um ensaio de MTT. Os dados são apresentados como a média ± S.D. de três experiências independentes. células (E) SMMC7721 e L02 foram incubadas com DOX (1? M) e /ou quercetina (20 uM) durante 24 h, e, em seguida, analisadas por citometria de fluxo utilizando coloração /PI Anexina V para discriminar as células vivas (anexina V /PI -), células em apoptose precoce (Anexina V + /PI-), necrose ou células apoptóticas tardias (anexina V + /PI +), e as células mortas (anexina V /PI +). *

P Art 0,05 vs. células co-tratados com quercetina

A quercetina aumenta a ativação da caspase-induzida DOX em células de câncer de fígado

ativação Caspase tem uma. função importante em ambas as vias apoptóticas intrínsecos e extrínsecos. Assim, nós também analisou o efeito da quercetina sobre as mudanças induzidas DOX em caspases. A quercetina não activar caspases directamente, mas fortemente reforçada a induzida por DOX activação de caspase-9, caspase-8 não activação, em células SMMC7721 (Fig. 2a). Activado caspase-3, o principal efector de caspases, e PARP, o principal substrato de caspases, também foram avaliados. A quercetina sozinho não induziu a clivagem de caspase-3 em células SMMC7721; DOX induziu uma formação de clivagem de 20 kDa. No entanto, o co-tratamento de quercetina e DOX induziu a clivagem de pro-caspase-3 em uma p20 intermediário, que subsequentemente clivada para a subunidade p17 activa. Mais proteinas PARP foram clivados em 85 formas kDa após o tratamento de combinação foi administrado em comparação com o tratamento com DOX sozinha. padrões de activação similares de caspases, clivagem de PARP foram observadas em QGY7701 células (dados não apresentados). O ensaio da actividade da caspase-3 confirmou que a quercetina aumentou significativamente a actividade de caspase-3 induzida por DOX em SMMC7721 células (Fig. 2B). Os efeitos do inibidor de largo espectro de caspases Z-VAD-FMK na apoptose de células de cancro do fígado foram determinados por coloração com PI para confirmar que a acção da quercetina sobre a DOX estava dependente da caspase. A acumulação de co-induzidos por tratamento de populações de células de fase sub-G1 em células QGY7701 foi diminuída (26% para 7%) pelo pré-tratamento com Z-VAD-fmk (Fig. 2C) significativamente. A população de células de fase sub-G1 em células SMMC7721 também diminuiu de 39% para 8% (dados não mostrados). Estes resultados indicaram que a quercetina potenciou a apoptose induzida por DOX em células de cancro do fígado através da activação de caspases-9 e -3 da via intrínseca.

(A), as caspases-3 clivado, -8, -9 e expressão e PARP foram avaliadas por transferência de western em SMMC7721 células tratadas com DOX (1? M) e /ou quercetina (20 uM) durante 24 horas. β-actina foi utilizado como um controlo interno. (B) Ensaio de Caspase-3 de DOX- (1? M) e /ou quercetin- (20 uM) A atividade tratada SMMC7721 células durante 24 h. Os lisados ​​celulares foram incubadas com substrato fluorogénico de caspase-3 durante 1 h a 37 ° C. a actividade da caspase-3 foi normalizada para a proteína de lisado de células e expressa como a activação vezes em comparação com o controlo. *

P Art 0,05 vs. células tratadas com DOX. (C) inibidor Caspase Z-VAD-fmk reduziu o efeito da quercetina na apoptose induzida por DOX em QGY7701 células examinadas por coloração PI. Controlo: 0,5% de sulfóxido de dimetilo; quercetina: 20 uM; DOX: 1 uM; DOX + quercetina: DOX 1 uM, mais quercetina 20 uM; DOX + quercetina Z-VAD-fmk +: as células foram pré-tratadas com 25 uM de Z-VAD-fmk, durante 1,5 h e ainda tratados com DOX mais quercetina durante 24 h. Os dados são apresentados como a média ± S.D. de três experiências independentes. *

P Art 0,05 vs. células tratadas com DOX. **

P

. 0,01 vs. células DOX + tratados com quercetina

A quercetina potencializa a apoptose induzida por DOX em células de câncer de fígado através de Bcl-xl /via mitocondrial Bax mediada

os experimentos foram realizados utilizando JC-1 para investigar o envolvimento potencial de ruptura da membrana mitocondrial. A determinação quantitativa mostrou que SMMC7721 células tratadas com quercetina sozinhos não exibiram qualquer alteração em comparação com o controlo. DOX tratamento induziu uma redução moderada da fluorescência vermelha, indicando uma diminuição no potencial de membrana mitocondrial, enquanto que o co-tratamento de quercetina e DOX induziu uma acentuada, redução significativa (Figs. 3A e B). Consistente com a perda da membrana mitocondrial, o co-tratamento de células com SMMC7721 quercetina e DOX libertado mais citocromo

C

das mitocôndrias para o citossol, quando comparada com a do tratamento DOX sozinha (Fig. 3C).

(a, B) Efeito de DOX e /ou quercetina na membrana mitocondrial potencial falha em SMMC7721 células tratadas com DOX (1? M) e /ou quercetina (20 uM) durante 24 h. JC-1 é observada como monómeros fluorescentes verdes no citossol ou como agregados fluorescentes vermelhas em mitocôndrias intactas. A redução da intensidade de fluorescência vermelha indica ruptura da membrana mitocondrial com potencial intacta. *

P Art 0,01 vs. células tratadas com DOX. (C) Análise de mancha de Western da expressão total de Bid, Bcl-2 e Bcl-XL, bem como a distribuição mitocondrial de Bax e a distribuição de citosol do citocromo

C

SMMC7721 em células tratadas com DOX ( 1? M) e /ou quercetina (20 uM) durante 24 h. β-actina foi utilizado como um controlo interno para a proteína total e as proteínas citosol. Hsp60 foi utilizado como um controlo interno para a proteína mitocondrial. (D) Análise Western blot da distribuição mitocondrial de Bax e o total de expressão de Bcl-XL em SMMC7721 células transfectadas com vector de expressão de Bcl-XL e tratados com DOX (1? M) e /ou quercetina (20 uM) durante 24 h. (E) Efeito de DOX e /ou quercetina sobre a apoptose de células SMMC7721 /Bcl-XL e SMMC7721 /neo ensaiado por coloração de PI após DOX (1? M) e /ou quercetina (20 uM) foi administrado durante 24 h. *

P

0,01, SMMC7721 /Neo vs SMMC7721 células /Bcl-xl. Os dados são apresentados como a média ± S.D. de três experiências independentes.

Foram examinados nível de proteínas Bcl-2 família para investigar os alvos moleculares potenciais a montante da caspase-9 vias. Bcl-2 nível de expressão não se alterou após vários tratamentos foram realizados. O co-tratamento de DOX e quercetina não afectou a diminuição induzida pelo DOX no nível de expressão Bid. Surpreendentemente, o co-tratamento provocou uma redução acentuada na expressão de Bcl-xl, enquanto que o tratamento de DOX ou a quercetina por si só não afectou a expressão de Bcl-XL (Fig. 3C). Por conseguinte, o co-tratamento de células com SMMC7721 quercetina e DOX aumentou grandemente Bax translocação do citosol para a mitocôndria em comparação com o tratamento com DOX sozinha, o que só causou um aumento moderado na translocação da Bax.

SMMC7721 células foram estavelmente transduzidas utilizando o vector de expressão de Bcl-XL para confirmar a importante função da proteína Bcl-XL em os efeitos da quercetina sobre a apoptose induzida por DOX. A sobre-expressão de Bcl-XL em SMMC7721 células inibiu significativamente Bax translocação para a mitocôndria, que foi induzida pelo co-tratamento de DOX e quercetina (Fig. 3D), e reduziu o efeito de potenciação da quercetina sobre a apoptose induzida por DOX (Fig. 3E ). Estes resultados sugerem que a quercetina potencia a apoptose em células de hepatoma de DOX-induzida através da via mitocondrial por regulação negativa da proteína Bcl-XL e, subsequentemente, aumentando o Bax translocação para a mitocôndria.

A quercetina aumento da apoptose induzida pela DOX em células de cancro do fígado é

Activado promoção mediada por p53 dependente de p53 de apoptose em células tumorais é um mecanismo importante de drogas anti-tumor, tal como DOX [26]. Por isso, nós investigamos se a proteína p53 está envolvido na potenciação do efeito da quercetina sobre a apoptose induzida por DOX em células de cancro do fígado. Nenhuma expressão da proteína p53 detectável foi observada no controlo ou células tratados com quercetina, enquanto que o co-tratamento de quercetina e DOX aumentou significativamente o nível de proteína p53 induzida por DOX em SMMC7721 células (Fig. 4A) expressão. p53 upregulated modulador da apoptose (PUMA), uma proteína pro-apoptótica de BH3-única, é um alvo directo da transcrição de p53. Quercetina posteriormente aumentado os níveis de expressão PUMA induzidas DOX. SMMC7721 células foram transf ectadas transitoriamente com o plasmídeo p53-luciferase e expostos a diferentes tratamentos para clarificar a função da p53 no efeito de potenciação da quercetina sobre a apoptose induzida por DOX. A quercetina sozinho não aumentou a actividade do p53. Em contraste, o tratamento combinado com o tratamento e DOX DOX sozinha aumentou significativamente a actividade de p53 por 15 e de 6 vezes, respectivamente, em comparação com o grupo de controlo. Além disso, pifithrin-α, um inibidor de p53 específico, não afecta a sobrevivência de células, mas a actividade inibiu significativamente a p53 (2,4 vezes), que foi aumentada pela quercetina combinadas e tratamento DOX (Fig. 4B), e reduziu o efeito de potenciação de quercetina sobre a apoptose induzida por DOX (Fig. 4C). Estes resultados sugerem que a atividade p53 reforçada é necessária para estimular o efeito de potenciação da quercetina na apoptose induzida por DOX.

expressões p53 e Puma (A) foram avaliadas por western blot em SMMC7721 células tratadas com DOX (1? M ) e /ou quercetina (20 uM) durante 24 h. β-actina foi utilizado como um controlo interno. (B) O ensaio de luciferase de DOX- e activação de p53 induzida por quercetina. SMMC7721 células foram pré-tratadas durante 1 h com 2 uM de pifithrin-α, e, em seguida, tratada com DOX (1 uM) ou quercetina (20 uM) durante 12 h. actividade de p53 foi determinada por ensaio da actividade da luciferase. Os dados são apresentados como a média ± S.D. de três experiências independentes. *

P Art 0,01 vs. células tratadas com DOX. **

P Art 0,001 vs. células tratadas com quercetina DOX +. (C) SMMC7721 células foram pré-tratadas com 2 uM de pfithrin-α durante 1 h, e depois tratou-se com DOX (1? M) e /ou quercetina (20 uM) durante 24 h. taxas de apoptose foram analisados ​​por coloração de anexina V /PI. Os dados são apresentados como a média ± S.D. de três experiências independentes. *

P Art 0,001 vs. células tratadas com DOX. **

P Art 0,01 vs. células tratadas com DOX. ***

P

. 0,001 vs. células DOX + tratados com quercetina

A quercetina aumenta DOX-induzida inibição do crescimento de SMMC7721 xenoenxertos em ratinhos

A efeitos da quercetina na DOX em nosso modelo de cultura de células

in vitro

foram validados neste estudo. Assim, avaliamos se a quercetina pode potenciar o efeito antitumoral da DOX em xenoenxertos tumorais SMMC7721 em camundongos nus. SMMC7721 suspensões de células individuais foram injectados s.c. para os flancos de ratinhos imunodeficientes seis semanas de idade, os ratos foram então divididos em quatro grupos de 10 dias após a inoculação do tumor, quando os tumores eram palpáveis: 1) grupo de controlo de solução salina normal (i.p., 3 x /semana); 2) A quercetina (100 mg /kg, i.p., 3 x /semana); 3) DOX (4 mg /kg, i.p., 1 x /semana); e 4) DOX (4 mg /kg, i.p., 1 × /sem) mais quercetina (100 mg /kg, i.p., 3 x /semana). Para o grupo de DOX, os tratamentos foram administrados até que uma dose cumulativa de 12 mg /kg foi atingida. A quercetina por si só não inibiu o crescimento do tumor; Em vez disso, a quercetina promovido o crescimento do tumor durante os primeiros 14 dias, e, em seguida, retardou o crescimento do tumor para os próximos 7 dias em comparação com o grupo de controlo. No final da experiência, o volume médio do tumor de tratamento quercetina foi 531,3 milímetros

3, semelhante ao do grupo de controlo. tratamento DOX reduziu significativamente os volumes de tumor (334,7 milímetros

3), em comparação com o grupo controle. Uma diminuição significativa no volume do tumor dos xenoenxertos de co-tratadas foi observada a partir do dia quatro de pós-tratamento até ao fim da experiência (Fig. 5A). Após co-tratamento foi administrado, os tumores cresceram a uma taxa reduzida com o início e os volumes tumorais finais médias de 76,5 e 118,1 mm

3, respectivamente.

SMMC7721 tumores derivados de células foram desenvolvidos em ratinhos nus e tratou-se com solução salina, quercetina, DOX e a DOX + quercetina. (A) O crescimento do tumor foi monitorizado medindo o volume do tumor durante três semanas. (

n

= 5 ratos por grupo). *

P Art 0,01 vs. o controlo e grupos tratados com quercetina. **

P Art 0,01 vs. grupo tratado com DOX. (B) Ao fim de três semanas, os tumores foram recolhidos e pesados. DOX reduziu o tamanho do tumor em comparação com o controle e grupos tratados com quercetina (*

P

0,05). Co-tratamento reduziu significativamente o tamanho do tumor em comparação com outros grupos de tratamento (**

P 0,001)

. (C) As amostras de tumor foram submetidos a coloração com hematoxilina e eosina e análise imuno-histoquímica utilizando Ki67, Bcl-XL, e anticorpos de p53. Os tumores tratados com Co apresentaram uma redução significativa na expressão de Ki67 e Bcl-XL, bem como um aumento da expressão de p53 em comparação com outros tumores tratados (

P

0,05).

o peso médio do tumor no grupo de controlo atingiu 163 mg, ao passo que o grupo tratado com quercetina provocou nenhum efeito no crescimento do tumor SMMC7721. DOX tratamento resultou na inibição do crescimento do tumor de aproximadamente 50% em comparação com o grupo de controlo; o peso médio do tumor diminuiu para 87 mg. O co-tratamento de DOX e quercetina induzida a inibição do crescimento tumoral mais eficaz e resultou num peso médio do tumor de 20 mg (Fig. 5B). Os dados indicaram que a quercetina aumenta a actividade anti-tumoral de DOX

In vivo

.

Histologicamente, os tumores eram consideravelmente menos celular e composto principalmente de material acelular nos xenoenxertos de co-tratados. Em contraste, as células tumorais de murganhos que receberam o tratamento de controlo com veículo e a quercetina foram dispostos como ninhos separados por feixes de matriz extracelular (Fig. 5C). Um baixo número de tumores foram encontrados em ratos tratados com DOX. secções de tumores de ratinhos nus foram avaliadas para a expressão de Ki67 para investigar o efeito do tratamento combinado sobre a proliferação de células de tumor (Fig. 5C). Após três semanas de tratamento, 24%, 62%, 91% e 92% de células tumorais Ki67 + foram encontradas no co, DOX-, e controlo do veículo ou ratinhos tratados com quercetina, respectivamente. análises de imuno-histoquímica adicionais foram realizados para confirmar o

in vitro

conclusões sobre os mecanismos pelos quais quercetina apresenta efeito de potenciação com DOX

in vivo

. Quercetina e DOX tumores co-tratados exhibitd aumento p53 níveis e diminuição da Bcl-x níveis em comparação com o grupo controle (Fig. 5C), de acordo com os nossos

in vitro

resultados.

A quercetina atenua DOX hepatotoxicidade induzida por

in vivo

Considerando nossos

in vitro

observações que a quercetina pode diminuir DOX citotoxicidade nas células hepáticas normais (Fig. 1D), investigamos ainda mais o seu efeito sobre hepatotoxicidade induzida por DOX

in vivo

. Ratinhos C57BL /6 foram tratados com DOX a 20 mg /kg (i.p.), uma dose que faz com que a toxicidade aguda [27]. A hepatotoxicidade aguda de DOX foi claramente revelado pelo aumento nos marcadores bioquímicos séricos, particularmente alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST). tratamento DOX resultou em um aumento significativo de 765% e 378% em ALT e AST, respectivamente, em comparação com o grupo controle (Tabela 1). suplementação quercetina sozinhos não exibiram alterações significativas nos marcadores bioquímicos. Por outro lado, o co-tratamento de DOX e quercetina resultou em uma reversão parcial do aumento de soro induzida por DOX em ALT e AST (

p Art 0,05).

O exame microscópico revelou que o controlo e a quercetina-tratada tecidos hepáticos normais têm células poligonais grandes com núcleos proeminentes redondos e citoplasma eosinófilo, bem como alguns sinusóides hepáticas espaçados dispostos em-entre os cabos hepáticas (Fig. 6A). Em contraste, os ratinhos que receberam 20 mg /kg de DOX apresentaram hepatotoxicidade maciça, com a dissolução dos cabos hepáticas envolvidas, que apareceu vacúolos como vazios alinhados por fios de hepatócitos necróticas e células de Kupffer proliferaram de forma difusa entre a gordo degenerado hepatócitos. evidência histopatológica revelou que o dano hepático após o tratamento de DOX foi significativamente reduzido com a co-tratamento com quercetina.

(A) ratinhos C57BL /6 foram tratados com quercetina (100 mg /kg /dia, po) quatro dias antes da ip administração de DOX (20 mg /kg). Os fígados foram removidos cinco dias após o tratamento DOX, e as seções foram coradas com hematoxilina e eosina (H E; ampliação de 200 ×). Os tumores derivados de células (B) SMMC7721 foram desenvolvidos em ratinhos nus e tratados com solução salina, quercetina, DOX e a DOX + quercetina. Ao fim de três semanas, os fígados foram recolhidas e coradas com H E. (C) Um modelo do efeito de quercetion em DOX em células do fígado. Neste modelo, a quercetina aumenta a expressão do p53-DOX induzida em células de cancro do fígado e reduz a expressão de Bcl-XL, aumentando assim a caspase -3 /-9 actividade e potenciar a morte celular induzida por DOX em células de cancro do fígado. Quercetina diminui o estresse oxidativo induzido por DOX e aumenta a sobrevivência das células em células normais do fígado.

Foram investigados os danos hepáticos subcrónicos induzidas DOX em ratos usando SMMC7721 xenotransplantes. O grupo tratado recebeu DOX DOX, uma vez por semana (4 mg /kg, i.p.), até uma dose cumulativa de 12 mg /kg foi atingida. O tecido hepático do grupo tratado com DOX mostraram alterações patológicas semelhantes aos da aguda DOX-tratados ratos C57BL /6 (Fig. 6B). A quercetina inverteu a lesão hepática induzida pela DOX em ratinhos nus com xenoenxertos de tumor SMMC7721.

Discussão

Embora DOX é uma droga anti-cancro potente, a sua utilização clínica é limitada pela sua toxicidade para os tecidos normais, tais como o coração e o fígado. Outra limitação da sua eficácia é o desenvolvimento de resistência a múltiplas drogas de células de cancro. Alguns flavonóides, exibem elevadas efeitos anti-tumor com agentes quimioterapêuticos, tais como quercetina [28]. Em

modelos in vitro do cancro da mama

e animais, quercetina melhora o índice terapêutico de DOX em células de cancro da mama, por interferir com o metabolismo das células, a actividade de GST, e citoesqueleto. Em contraste, a quercetina reduz DOX citotoxicidade em células mamarias não-tumorais [13] – [15]. Embora o co-tratamento de quercetina e DOX pode ser desenvolvido a uma nova combinação quimioterapêutico para a terapia do cancro da mama, ou não quercetina provoca o mesmo efeito sobre DOX em outros tipos de cancros, em que a DOX é usado como tratamento de primeira linha, tais como câncer de fígado, permanece desconhecida. O estudo investigou a eficácia de quercetina com DOX em células de cancro do fígado e do seu efeito protector contra hepatotoxicidade induzida por DOX em ratinhos.

Vários estudos têm mostrado que o IC

50 para a quercetina em vários tumores varia entre 7 nM a 100? M. Em contraste com outros tipos de células de cancro humanas, quercetina exibe anti-proliferativa e efeitos pró-apoptóticos em concentrações baixas [23], tal como 21 uM para células MDA-MB-468 células de cancro da mama humano [24]. Vários relatórios e os nossos resultados demonstraram que as células de hepatoma humanas são considerados resistentes a quercetina porque o IC

50 valor é 100? M. células de hepatoma humano também são resistentes a DOX (IC

50 valor 5 ^ M) e o pico de concentração de DOX no plasma humano é de 5 uM. Os nossos resultados também revelaram que o co-tratamento de quercetina (20 uM) e DOX (1 uM) potencia significativamente os efeitos antitumorais de DOX em células de cancro do fígado humano. As células cancerosas exibem a sua resistência aos agentes quimioterapêuticos, expulsando os intracelulares drogas anti-cancro para fora das células através da P-gp e outras bombas de medicamentos. A quercetina podem inibir a actividade da P-gp bomba de efluxo dependente da dose, e de induzir a apoptose em células de leucemia e de cancro da mama resistentes mielóides humanos [29] – [31]; Assim, a apoptose induzida Facilitado-DOX talvez o resultado da inibição da P-gp induzida por quercetina, seguido por um aumento da DOX intracelular, e consequentemente uma apoptose aumentada [32]. No entanto, doses baixas de DOX pode aumentar ligeiramente MDR1 ARNm, mas não a expressão de proteína [33]. Para MRP1, nenhum ARNm MRP1 detectável em células tratadas SMMC7721-DOX foi encontrado [34]. Com as tecnologias microscópicas confocal, observou-se que a distribuição intracelular de DOX nestas células de hepatoma não foi afectada pela quercetina (dados não mostrados). Assim, a quercetina provável potencializa apoptose DOX-induzido, mas não através da sua acção sobre a retenção de drogas e de efluxo. Mais estudos são necessários para determinar se ou não a quercetina sensibiliza as células de câncer de fígado resistentes-DOX, afetando a expressão de genes relacionados com a MDR

apoptose induzida por DOX está associada com duas vias de apoptose distintas:. A via de receptor de morte pela ativação de caspase -8 e a via mitocondrial através da activação de caspase-9 [35]. A via mitocondrial é o principal mecanismo de apoptose induzida por DOX [36], em que o processo envolve o centro de permeabilização da membrana mitocondrial externa com a subsequente libertação de vários factores pró-apoptóticos para o citosol [37]. Citocromo

C

, um dos factores pró-apoptóticos, CARTÃO proteína adaptadora APAF-1, e pró-caspase-9 montar no citosol para formar o apoptossomo. Pró-caspase-9 é então processado autoproteolytically e desencadeia a activação de caspases efectoras, conduzindo assim à clivagem de vários substratos. Descobrimos que a quercetina aumentou significativamente a perda induzida por DOX do potencial de membrana mitocondrial, indicando o aumento na quebra mitocondrial. Substancialmente maior libertação de citocromo

C

e a clivagem de pró-caspase-9 ocorreu posteriormente, que conduz ao aumento da actividade da caspase-3 e PARP degradação. Z-VAD-fmk bloqueou a, apoptose induzida por DOX-quercetina reforçada, sugerindo que a quercetina sensibiliza a apoptose induzida por DOX em células de câncer de fígado, principalmente através da via mitocondrial.

Vários relatórios indicam que a proteína supressora de tumor p53 regula mitocôndria -directed apoptose [38]. p53, como um factor de transcrição, podem estimular a expressão de genes alvo, pró-apoptóticos tais como PUMA, Bax, Bid e [39].